细菌生长曲线的测定的实验步骤

细菌生长曲线的测定的实验步骤 一、 实验目的 1. 了解细菌生长曲线特征，测定细菌繁殖的代时； 2. 学习液体培养基的配制以及接种； 3. 反复练习无菌操作技术； 4. 了解不同细菌，不同接种方法在同一培养基上生长速度的不同； 5. 掌握利用细菌悬液混浊度间接测定细菌生长的方法 二、 实验原理 将一定量的细菌接种在液体培养基内，在一定条件下培养，可观察到细菌的生长繁殖有一定的规律性，如以细菌的活菌数的对数作纵坐标，以培养时间作横坐标，可绘成一条曲线，成为生长曲线（如图一）。 图一 微生物生长曲线示意图 单细胞微生物的发酵具有四个阶段，即Ⅰ调整期（延滞期）、Ⅱ对数期（生长旺盛期）、Ⅲ平衡期（稳定期）、Ⅳ死亡期（衰亡期）。 生长曲线可表示细菌从开始生长到死亡的全过程的动态。不同的微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。 测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数板法、平板菌落计数法、称重法和比浊法等。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可利用分光光度计测定细菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。将所测得的光密度值（OD600）与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。注意，由于光密度表示的是培养液中的总菌数，包括活菌与死菌，因此所测定的生长曲线的衰亡期不明显。 从生长曲线我们可以算出细胞每分裂一次所需要的时间，即代时，以G表示。其计算公式为： 式中t1和t2为所取对数期两点的时间； W1和W2分别为相应时间测得的细胞含量（g/L）或OD。 三、 实验仪器、材料和用具 1. 实验材料:大肠杆菌，枯草杆菌菌液及平板； 2. 培养基:牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基 3. 实验仪器:取液器(5000ul, 1000ul 各一支);培养箱, 摇床，722s分光光度计； 4. 实验用具:无菌1000ul吸头80个;无菌5000ul吸头2个;比色皿9个+共用参比杯一个. 四、 实验步骤 1. 准备菌种：将细菌接种到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培养基中，37℃振荡培养18h，另外准备单菌落平板各1块 2. 分为三个小组： 第（1）小组 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基,  37 ℃ 200rpm 取3.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ℃ 200rpm 取5.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ℃ 200rpm 第（2）小组 取一个大肠杆菌菌落接种到100ml培养基，  37 ℃ 200rpm 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ℃ 110rpm 取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基，      30 ℃ 200rpm 第（3）小组 取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基，      37 ℃ 200rpm 取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基，      30 ℃ 200rpm 取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基，      37 ℃ 110rpm 每培养一小时取样一次(2.5h,3.5h加测1次). 对照组测量起始pH,所有瓶子测量发酵9h结束测pH. 3. 测量：选用600nm波长，以蒸馏水作为参比，开始培养前测定每组培养液的OD值作为起始点。开始培养后，每小时吸取测定一次OD值。 五、 实验结果及分析 1. 实验数据： 表一  三个小组时间-OD数据 开始取样时间   10:55 12:01 12:39 13:17 13:53 结束取样时间 9:55 11:01 12:09 12:47 13:23 13:59 发酵时间 0 1 2 2.5 3 3.5 ODt 大肠杆菌 单菌落 0.004 0.024 0.027 0.027 0.025 0.036 37℃110rpm -0.010 0.049 0.164 0.255 0.312 0.327 30℃200rpm -0.010 0.043 0.088 0.158 0.242 0.361 1.0mL 0.010 0.070 0.158 0.266 0.372 0.436 3.0mL 0.039 0.096 0.257 0.373 0.420 0.451 5.0mL 0.067 0.134 0.302 0.361 0.334 0.456 枯草杆菌 37℃200rpm 0.008 0.023 0.076 0.132 0.184 0.254 30℃200rpm 0.013 0.032 0.052 0.088 0.091 0.125 37℃110rpm 0.007 0.017 0.098 0.130 0.230 0.253 OD=ODt-OD0 大肠杆菌 单菌落 0.004 0.020 0.023 0.023 0.021 0.032 37℃110rpm -0.010 0.059 0.174 0.265 0.322 0.337 30℃200rpm -0.010 0.053 0.098 0.168 0.252 0.371 1.0mL 0.010 0.060 0.148 0.256 0.362 0.426 3.0mL 0.039 0.057 0.218 0.334 0.381 0.412 5.0mL 0.067 0.067 0.235 0.294 0.267 0.389 枯草杆菌 37℃200rpm 0.008 0.015 0.068 0.124 0.176 0.246 30℃200rpm 0.013 0.019 0.039 0.075 0.078 0.112 37℃110rpm 0.007 0.010 0.091 0.123 0.223 0.246                   开始取样时间 14:29 15:35 16:43 17:50 18:57 19:07 20:12 结束取样时间 14:35 15:43 16:50 17:57 19:09 20:07 21:12 发酵时间 4 5 6 7 8 9 10 ODt 大肠杆菌 单菌落 0.065 0.267 0.395 0.454 0.457     37℃110rpm 0.333 0.340 0.342 0.360 0.362     30℃200rpm 0.439 0.566 0.570 0.588 0.586     1.0mL 0.464 0.446 0.446 0.458 0.440     3.0mL 0.487 0.470 0.457 0.483 0.458     5.0mL 0.469 0.457 0.464 0.482 0.478     枯草杆菌 37℃200rpm 0.337 0.428 0.517 0.590 0.686 0.711 0.711 30℃200rpm 0.171 0.261 0.370 0.540 0.628 0.606 0.652 37℃110rpm 0.295 0.302 0.305 0.305 0.352 0.352 0.378 OD=ODt-OD0 大肠杆菌 单菌落 0.061 0.263 0.391 0.450 0.453     37℃110rpm 0.343 0.350 0.352 0.370 0.372     30℃200rpm 0.449 0.576 0.580 0.598 0.596     1.0mL 0.454 0.436 0.436 0.448 0.430     3.0mL 0.448 0.431 0.418 0.444 0.419     5.0mL 0.402 0.390 0.397 0.415 0.411     枯草杆菌 37℃200rpm 0.329 0.420 0.509 0.582 0.678 0.703 0.703 30℃200rpm 0.158 0.248 0.357 0.527 0.615 0.593 0.639 37℃110rpm 0.288 0.295 0.298 0.298 0.345 0.345 0.371                     2. 作图、简要分析及代时计算： 1） 取一个大肠杆菌菌落接种到100ml培养基，  37 ℃ 200rpm 图一  单菌落大肠杆菌生长曲线 这条曲线属于比较标准的“S”形曲线，很容易看出调整期和对数期，由于单菌落菌较少，而且从固体培养基转移至液体培养基环境变化较大，所以出现了长达4小时的调整期，但可以看出，调整期之后这瓶菌都生长良好。 计算代时：取培养4小时到5小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。 由代时计算公式，t2－t1=1h  W1=0.061  W2=0.263 代时 2） 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ℃ 110rpm 图二  大肠杆菌菌生长曲线（取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基，37 ℃ 110rpm） 接种后几乎没有调整期出现，大肠杆菌很快适应了新的环境并开始呈指数增长，估计是新的培养环境和原有环境较一致，而且在培养最初的时候溶氧和酸碱度都较为适宜，但是这瓶菌是稳定期OD最小的，估计是培养基最初分装不均产生的。 计算代时：取培养2小时到2.5小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。 由代时计算公式，t2－t1=0.5h  W1=0.174  W2=0.265 代时 3） 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，30 ℃ 200rpm 图三  大肠杆菌生长曲线（取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基，30 ℃ 200rpm） 可以看出温度对大肠杆菌适应环境产生了一定的影响，使它在调整期滞留了较长的时间，且在对数期增长较慢，应该是酶活性对细胞复制的影响所致。 计算代时：取培养2.5小时到3.5小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。 由代时计算公式，t2－t1=1h  W1=0.168  W2=0.371 代时 4） 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基,  37 ℃ 200rpm 图四  大肠杆菌生长曲线（取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基,  37 ℃ 200rpm） 这是大肠杆菌培养的最适调节，可以看出其生长良好，调整期较短，对数期较长。 计算代时：取培养2小时到3小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。 由代时计算公式，t2－t1=1h  W1=0.148  W2=0.362 代时 5） 取3.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ℃ 200rpm 图五  大肠杆菌生长曲线（取3.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基，37 ℃ 200rpm） 接种量的增加没有产生太大的影响，生长曲线没有太大变化。 计算代时：取培养2小时到2.5小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。 由代时计算公式，t2－t1=0.5h  W1=0.218  W2=0.334 代时 6） 取5.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ℃ 200rpm 图六 大肠杆菌生长曲线（取5.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ℃ 200rpm） 3小时出现了一次明显的波动，应该是测量过程中没有摇匀的结果，忽略它之后，这条生长曲线属于正常形态，比较前两天生长曲线，发现5mL得到的最大OD反而减小了，说明在一定量的培养基下，初始接种量对最后结果影响不大。最大OD应该是受到了最初添加培养基的影响。 计算代时：取培养1小时到2小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。 由代时计算公式，t2－t1=1h  W1=0.067  W2=0.235 代时 7） 取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基，      37 ℃ 200rpm 图七 枯草杆菌生长曲线（取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基， 37 ℃ 200rpm） 枯草杆菌的生长曲线包含了调整期、对数期和很小一部分稳定期，虽然稳定期很短，但是已经可以看出停止生长的趋势，说明枯草杆菌的代时较长。 计算代时：取培养3小时到4小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。 由代时计算公式，t2－t1=1h  W1=0.176  W2=0.246 代时 8） 取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基，      30 ℃ 200rpm 图八 枯草杆菌生长曲线（取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基， 30 ℃ 200rpm） 温度降低后，生长变得缓慢了，最后达到的最大OD也更小了，代时加长。 计算代时：取培养4小时到5小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。 由代时计算公式，t2－t1=1h  W1=0.158  W2=0.248 代时 9） 取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基， 37 ℃ 110rpm 图九  枯草杆菌生长曲线（取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基， 37 ℃ 110rpm） 4小时时，似乎由对数期进入了稳定期，但是对比前两组数据，此时的OD值明显偏小，所以分析，可能此时突然有外因影响，使细胞进入了调整期，可以看到后来7、8小时左右细菌又有增长趋势。 计算代时：取培养2.5小时到3小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。 由代时计算公式，t2－t1=1h  W1=0.123  W2=0.223 代时 3. 发酵结束pH 对照组pH=7.5 实验结束后所有瓶pH均小于6.4 pH全部降低，说明大肠杆菌和枯草杆菌发酵均产生了酸。 4. 分析 表二  不同环境和菌种生长比较 培养菌 接种量 培养温度/ ℃ 摇床转速/rpm 生长曲线状态 代时/min 调整期/h 对数期/h 稳定期OD(取8小时OD） 大肠杆菌 单菌落 37 200 4 3 0.453 28.5 1.0mL 37 110 1 3 0.372 49.4 1.0mL 30 200 2 3 0.596 52.5 1.0mL 37 200 1 3 0.430 46.5 3.0mL 37 200 1 2 0.419 48.7 5.0mL 37 200 1 2 0.411 33.1 枯草杆菌 1.0mL 37 200 2 6 0.678 66.5 30 200 3 5 0.615 92.2 37 110 1 3 0.345 34.9                 1） 接种量对微生物的影响： 预期：接种量大，调整期缩短，对数期增长，稳定期OD增大，代时缩短。 原因：接种量大的细胞基数大，因而更快适应环境。 实际：调整期影响不大，对数期稍有缩短，稳定期OD减小，代时规律不明显。 分析：生长曲线受各种因素调节，这里实验结果不同于预期应该是受到培养基的限制，接种量大对氧气和原料需求更多，而且产生酸的速度也快，也许对后来的细胞生长造成了一定的影响。 2） 培养温度对微生物的影响 预期：最适温度下细胞生长应该最快，调整期最短，稳定期OD最大，代时最短 原因：温度影响细菌内酶活力和细胞膜的通透性，进而影响新陈代谢，从而影响细菌的生长繁殖。最适温度下，细菌酶活性最强，因而能最快适应环境，并取得生长增殖的最高效率。 实际：大肠杆菌37℃稳定期OD最大，调整期更短，但代时更长。枯草杆菌37℃调整期更短，对数期更长，稳定期OD更大，代时更短。 分析：大肠杆菌代时的问题应该来自实验误差，如取样未摇匀、计算时取点不够准确，或实验过程中某些操作导致生长和理论不一致。 3） 摇床转速对微生物的影响 预期：转速高，调整期短，对数期长，稳定期OD大，代时短 原因：转速影响溶氧，溶氧高，生长情况应该越好 实际：大肠杆菌与预期符合；枯草杆菌转速快的调整期长，代时长。 分析：原因可能有两点，一是枯草杆菌在溶氧高的环境下生长没有那么好，说明它是微好氧生物，但这与实际不符；二是其他条件限制，虽然说两个培养瓶进行对照要求其他条件一致，但是由于培养基分配及其其他各种原因，其他条件可能并不一致而且还产生了比对照条件还要大的影响。 4） 生长曲线分析 两个菌的生长曲线都包括了调整期、对数期和稳定期，实验没有进行到衰亡期因为而没有观察到后来的OD值下降。 5） 大肠杆菌和枯草杆菌比较 大肠杆菌：代时要短一些，温度对代时的影响比溶氧对代时的影响要大，估计是因为溶液中细胞不多，所以溶氧的限制作用没有温度明显。 枯草杆菌：代时较长，溶氧比温度对代时的影响要大，但这也可能是实验操作中其他因素影响而得出的表观结果。