金属配合物对DNA的氧化断裂研究

金属配合物对DNA的氧化断裂研究 博哥 一 引言 生理条件下借助于氧化或光活化产生活性氧中间产物导致核酸骨架断裂，即显示出与天然核酸酶相同或类似生物活性的过渡金属配合物及其载体衍生物称为化学核酸酶。化学核酸酶既有限制性内切酶的高度专一性，又能在人们预先设计的任何位点断裂DNA，而且克服了传统的限制性内切酶识别位点仅为4～8个核苷酸的限制，还具有分子小、结构简单、易于提纯、成本低等优点，可用于基因分离、染色体图谱、大片段基因的序列分析以及DNA定位诱变、肿瘤基因治疗与新的化学疗法等领域。绝大部分化学核酸酶的断裂系统是以氧化还原机理作用的。化学核酸酶以氧化作用攻击DNA的核糖环及碱基，产生各种氧化物，可以直接引起DNA的单链或双链发生断裂。而以水解机理断裂DNA时，仅影响磷酸二酯键，不造成碱基和核糖环损伤。 本实验将Cu(ClO4)2.6H2O和1,10-邻菲咯啉 (phen)加入甲醇中, 25 oC下电磁搅拌半小时，以制备[Cu(phen)2(H2O)](ClO4)2。将其作用于质粒pBR322 DNA，再通过凝胶电泳以检测DNA氧化断裂分子量以及构型的分布。 二、 实验原理 1． DNA氧化断裂 DNA断裂有三种途径：水解断裂DNA，仅影响磷酸二酯键，不造成碱基和核糖环损伤；氧化断裂DNA，以氧化作用攻击DNA的核糖环及碱基，产生各种氧化物，可以直接引起DNA的单链或双链发生断裂；光断裂DNA。化合物通过光反应产生多种氧化性的自由基，如超氧阴离子（O2–），超氧自由基（OOH·）或羟基自由基（OH·）等。这些物质都能够氧化DNA的鸟嘌呤碱基，从而使DNA发生断裂。    氧化断裂中常用的氧化还原剂有3-巯基丙酸(3-MPA)、二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、抗坏血酸、H2O2、谷胱甘肽、抗坏血酸钠、抗坏血酸∕H2O2等。Fenton 反应和Haber-Weiss机理都属于由H2O2引发金属离子的氧化断裂，羟自由基OH·是可能的活性中间体。 Cu2+与DNA碱基上氮原子有配位作用，用自旋捕获技术检测到羟自由基作为中间产物确实存在。正是Cu( )配合物产生的羟自由基导致了DNA的断裂。除了OH·自由基外，其它的自由基如O2·-，ROO·，RO·等也能断裂DNA。 2．水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA氧化断裂 凝胶电泳是研究核酸和蛋白质等生物大分子的一项重要的实验技术，操作简便、快速、灵敏，是分离、鉴定和提纯核酸的首选方法。以琼脂糖凝胶为支持电解质的电泳技术，为DNA分子及其片段的分子量测定和DNA分子构象提供了一个重要手段。DNA分子在高于其等电点的pH缓冲溶液中带负电荷，在电场的作用下，DNA分子向正极移动。由于不同分子量的DNA在凝胶中的迁移率的差异，分子量越小，迁移率越大。对于不同构型的DNA分子，即使分子量相同，在电泳中迁移率也是不同的。常见的质粒DNA存在三种构型：共价闭环形（Form I）、开环缺刻形（Form II）和线形（Form III）。共价闭环形的超螺旋Form I 的结构最为紧密，迁移速度最快，电泳时跑在最前面。线形的Form III 其次。开环缺刻形的Form II 由于结构松散，跑在最后。这样，可以通过在小分子化合物与DNA作用后，观察DNA迁移位置的变化，来了解小分子化合物与DNA作用的特点。 3．EB对DNA进行染色原理 溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，由于其分子的平面结构，它可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB本身发出的荧光强大10倍，因此不需要洗净背景就能清楚地观察到核酸的电泳带型。通常，在凝胶中加入终浓度为0.5 μg/ml的EB，可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况，这种方法使用于一般性的核酸检测。EB-DNA复合物的激发波长和发射波长分别为518 nm和605 nm。EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20 min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10 ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中凝胶中。 图1 溴化乙锭的分子结构 三、仪器试剂 1．仪器 微量移液器、电泳仪、水平电泳槽、透射紫外观察仪 2．试剂 质粒pBR322 DNA、Cu(ClO4)2.6H2O、1,10-邻菲咯啉 (1,10-phenanthroline, 缩写phen)、无水甲醇、 抗坏血酸、 Tris 缓冲液、 溴酚蓝指示剂点样缓冲液、1 g/ml溴化乙锭溶液 、电泳缓冲液(TAE)、6.0.8% 琼脂糖凝胶 四、操作步骤 1．[Cu(phen)2(H2O)](ClO4)2的制备 将Cu(ClO4)2.6H2O (370 mg, 1.0 mmol) 和1,10-邻菲咯啉 (phen) (360 mg, 2.0 mmol) 加入15 ml甲醇中, 25 oC下电磁搅拌半小时, 产生的绿色沉淀经减压抽滤并用少量的冷甲醇淋洗后, 再用P2O5真空干燥。 图2 配合物[Cu(phen)2(H2O)](ClO4)2的结构示意图 2．DNA氧化断裂 首先用Tris缓冲液配置[Cu(phen)2(H2O)](ClO4)2溶液（200 M，为使样品溶解，可加入不超过总体积10%的DMF）和抗坏血酸溶液(0.1 mM）。在排列固定好的样品管里，依次用微量取液器加入1 μL 稀释5倍的pBR322 DNA原液、[Cu(phen)2(H2O)](ClO4)2 (5 μL）和抗坏血酸 (1 μL），再用Tris缓冲液把所有样品都补到10 μL（另外要有一个DNA的空白）。37 oC下温育1小时后，每个样品管里加点样液2 μL，上样，进行琼脂糖凝胶电泳。 2．水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA氧化断裂 (1)选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负极的线路。选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。 (2)制备1%琼脂糖凝胶，100℃水浴加热至琼脂糖融化均匀。 (3)用吸管取少量琼脂糖凝胶溶液将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3～5 mm。倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。 (4)琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端的挡板，保持点样孔的完好。 (5)将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶面1～2mm。如点样孔内有气泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。 (6)将上述反应液样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。上样缓冲液不仅可以提高样品的密度，使样品均匀沉到样品孔内，还可以使样品带颜色，便于上样和估计电泳时间和判断电泳的位置。 (7)用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。 (8)盖上电泳槽，开启电源开关，最高电压不超过5 V/cm（100～150V恒压电泳），使DNA从负极向正极移动。从电泳槽中取出凝胶，将凝胶置于1 ug/ml溴化乙锭水溶液中，室温下振摇染色30~45分钟。回收染色液，自来水冲洗凝胶后，于紫外灯下观察。 (9)电泳完毕后关闭电源，戴一次性塑料手套取出凝胶，尽可能将所有的电泳缓冲液淋干，在254 nm波长的透射紫外灯下观察。 五、结果分析与讨论 1．电泳结果 图3 DNA氧化断裂电泳图谱 表1 加样孔对应样品含量 加样孔编号 DNA/ uL Tris/ uL [Cu(phen)2(H2O)](ClO4)2/ uL Vc/ uL 1 2 11 0 0 2 2 9 1 1 3 2 8 2 1 4 2 7 3 1 5 2 6 4 1 6 2 5 5 1 7 2 4 6 1 8 2 3 7 1 9 2 2 8 1 10 2 1 9 1 11 2 0 10 1           2． 讨论 常见的质粒DNA存在三种构型：共价闭环形（Form I）、开环缺刻形（Form II）和线形（Form III）。共价闭环形的超螺旋Form I 的结构最为紧密，迁移速度最快，电泳时跑在最前面。线形的Form III 其次。开环缺刻形的Form II 由于结构松散，跑在最后。 加样孔从左往右，[Cu(phen)2(H2O)](ClO4)2的浓度依次增加，所以电泳谱图左边，由于化学核酸酶的浓度低，DNA氧化不完全，只存在Form I和Form II。当[Cu(phen)2(H2O)](ClO4)2的浓度增加时候，DNA被进一步氧化断裂，Form II增加，并且出现了Form III，此时谱图中Form I、Form II、Form III三者并存，并且Form II 的谱带变宽。当[Cu(phen)2(H2O)](ClO4)2的浓度进一步增加，Form I 被完全氧化，所以谱图上只存在Form II、FormIII。 六、感想与体会 通过这次实验，认识到化学核酸酶的定义，以及其相对与限制性内切酶的优越性，例如具有分子小、结构简单、易于提纯、成本低等优点；DNA断裂机理，氧化断裂，水解断裂和光断裂的机理；以及以琼脂糖凝胶为支持电解质的电泳技术，在DNA分子及其片段的分子量测定和DNA分子构象测定的应用。另外，本次实验的结果与预期一致，实验较成功，与每过同学认真负责的态度，以及良好的分工分不开。 思考题 1．抗坏血酸在实验中起什么作用？类似的还有哪些化合物？ 答：抗坏血酸在实验中，在Cu离子存在等特定条件下表现出氧化剂的性质，损伤核酸等生物大分子。类似的化合物有有3-巯基丙酸(3-MPA)、二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、H2O2、谷胱甘肽。 2．溴乙啶在DNA琼脂糖电泳中起什么作用？ 答：溴化乙锭(EB) 在DNA琼脂糖电泳中是作为一种荧光染料。由于其分子的平面结构，它可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间， EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB本身发出的荧光强大10倍，因此不需要洗净背景就能清楚地观察到核酸的电泳带型。 3． DNA断裂除了氧化断裂途径外,其它途径还有哪些? 答：DNA断裂除了氧化断裂途径外还有两种：(1)水解断裂DNA。仅影响磷酸二酯键，不造成碱基和核糖环损伤。 (2)光断裂DNA。化合物通过光反应产生多种氧化性的自由基，如超氧阴离子（O2–），超氧自由基（OOH·）或羟基自由基（OH·）等。这些物质都能够氧化DNA的鸟嘌呤碱基，从而使DNA发生断裂。