小麦黄色花叶病毒不同分离物外壳蛋白(CP)基因序列的比较分析
小麦黄色花叶病毒不同分离物外壳蛋白
(CP)基因序列的比较分析
第29卷第3期
l999年8月
植物病理
ACTAPHYTOPATHOI0GICASINICA
Vo1.29NO.3
Aug1999
@
小麦黄色花叶病毒不同分离物外壳蛋白(cP)
基因序列的比较分析
韩成贵李大伟,J于嘉林邢怡明朱坤田兆丰蔡祝南刘仪
一(中国农业大学农业生物拄术国家重点
和植物病理学系,北京100094).
1
摘要核苷酸序列分析结果表明,小麦黄色花叶病毒(WYMV)不同分离物的外壳蛋白基因存在一定
的差异.邓州分离物CP基因在其31,33nt处均缺失了3个核苷酸,其余分离物与潢川分离物及日本
分离物长度一致,均为882nt.不同分离物CP基因核苷酸序列同源性
为973,98.9,由此推导的
氰基酸序刊同源性为97.6,99.3,外壳蛋白N末端的110个氨基酸和
C末端的55个氰基酸在各
个分离物间是高度保守的.潢川分离物有5个氨基酸与其它5个分离
物明显同.wYMv不同分离物
外壳蛋白序列分析结果进一步确认了WYMV与WSSMV为毋
movirus属的2种不同病毒.
外壳蛋白基因
SEQUENcEcoMPARISoNoFTHEGENEFoRCoATPRoTEINFRoM
DIFFERENTISOLATESOFWttEATYELLOWMOSAICVIRUS
HanChengguiLiDaweiYu]ialinXingYiming
ZhuKunTianZhaofengCaiZhunanLiuYi
<NationalLaboratoryforAgrobiotechnologyandDepartmentoPlantPathology
ChinaAgricuhuralUniversityrBeijing100094)
AbstraetThesequenceanalysisrevealedthatthereweresomenucleotidedifferencesinCP
genesofwheatyellowmosaicvirus(WYMV)fromDengzhoucityinHenan,Yangzhoucityin
Jiangsu,YaancityinSichuan,ZhouzhicountyinShaanxiprovinceofChina.Comparingwith
theHuangchuanisolateandJapaneseisolate,theCPgeneofDengzhouisolate
hadthreenu
cleotidesdeletion(31—33nt)atits5end,therestisolateshadthesamelengthCPgene.con—
taining882nueleotides.TheisolatesofWYMVexhibitednucleotidesequencehomologiesran
gingfrom97.3to98.9andshareddeducedaminoacidsequencehomologiesof97.6to
99.3,1l0aminoacdresiduesoftheNtermina1sequencesand55aminoacidresiduesofC
terminalsequences1nCPofdifferentWYMVisolateswereextremelyconservative.
Huangchuanisolatehad5aminoacidresiduesobviouslydifferentfromtherest51so[ates.
ThesesequencedataonWYMVCPgenefromdifferentisolatesfurtherlndicatethatWYMV
863”
(课蹰编号101—04一Ot一05)和国家自然科学基金(编
g-39870489)资助项目本文报道的核苷酸序列已登
录于DDBJ/GenBank/EMBL数据库,登录号为AJ240048<郡州分
离物),AJ240050(稚安分离物),AJ240051(扬州分离
物)和AJ240052(周至分离物)
收稿日刺:1998--0~’--03修改稿收到日期:1998--t1—30
门,
.
3期韩成贵等叫,麦黄色花叶病毒不同分离物外壳蛋白(cP)基因序列的比较分析217
andwheatspindlestreakmosaicvirus
genusBymovirus.
Keywords:wheatyellowmosaicvirus
(WSSMV)aretwodistinctvirusspecieswithinthe
isolates,CPgene,sequencecomparison
由禾谷多粘菌(Polymya-agraminis)传播的小麦黄色花叶病毒(wheatyellowmosaicvirus,
wYMV)是一种二分体单链RNA病毒,属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)的大麦黄色花叶病毒属
(Bymovirus).由该病毒侵染引起的小麦黄花叶病在我国长江中下游,淮河和渭河流域广为发生,尤其在
采用稻麦轮作的冬小麦种植区,发生面积及危害程度更为严重,一般减产1o,30,重者达70,
80,甚至绝收,已成为小麦生产上的主要危害之—口.wYMV可在土壤中长期存活并经”土壤传播”
的杼性,使碍此病害难采用常规方法控制,目前的有效
主要是利用抗病品种但大量研究结果表
明,小麦品种之间存在着明显抗病性差异,包括免疫,高抗,中抗,耐病
及高感等各种类型.同时不同地域
的wYMv存在明显的致病性分化现象0].例如,8O年代初在四川表现为抗病的”繁6”引种到陕西后却
表现为高度感病.针对这种情况,有必要搞清楚wYMV不同分离物之间所存在的分子变异及其与致病
力分化的关系,期为抗病品种的选育和品种台理布局等工作提供理论根据.本室对wYMV核苷酸序
列分析结果表明,其外壳蛋白(cP)基因位于RNA13末端,由RNA1编码的270kDa多聚蛋白前
体通过自身编码的蛋白酶切割而成,率史报道wYMv不同分离物CP基因的变异.
1
与方法
1.1样品采集
小麦黄花叶病病叶分别采自河南省潢川县和邓州市,江苏省扬州市,安徽省滁州市,四』Il省
雅安市和陕西省周至县,20c冰箱中保存备用.
1.2RT—PCR扩增
病叶总RNA的提取及RTPCR扩增方法均同文献].
1.3PeR产物的酶切分析
RTPCR产物经苯酚一氯仿抽提,乙醇沉淀浓缩后,根据河南省潢川分离物的酶切位点,选用
XbaI,HindlII,BamHI和StyI4种限制性内切酶进行酶切,根据带型的
变化,确定酶切位点的数量.
1.4PeR产物的克隆
将河南省邓州市分离物,江苏省扬州市分离物,四』Il雅安分离物和陕西周至分离物的PCR
产物用T4DNA聚合酶处理成平端后,克隆进入pGEM一7Zf(+)的SmaI位点,经PCR扩增筛
选和酶切鉴定,得到重组质粒pGDX2,pGDX9,pGYZ5,pGSC422和pGSX11.
1.5序列测定和序列分析
采用PE公司的DyeTerminatorDNA测序试剂盒和ABI377型DNA自动测序仪进行序
列测定.利用Beckman公司的MicroGenie序列分析软件对所测序列进行计算机分析,比较
wYMv不同分离物CP基固核苷酸及氨基酸序列的变异.
2结果与分析
2.1WYMV不同分离物CP基因酶切位点的变异
为初步比较同一地区不同样品wYMVcP基因的变异,分别提取同一采集地不同样品的
218植物病理29卷
病叶总RNA,经RT—PCR扩增获得的产物用苯酚一氯仿抽提后,分别用XbaI,HindIII,BamHI
和StyI4种限制性内切酶进行酶切,结果表叫:扬州的4个分离物,滁州的3个分离物和邓州分
离物的CP基因的酶切位点与潢川分离物相同;周至的7个分离物均无XbaI位点,而多1个
StyI位点;雅安分离物与潢川分离物相比无XbaI位点(见表1).由此说明,同一地区的wYMv
变异较小,而不同地区的wYMV则呈现一定的变异
表1WYMV不同分离物CP基因酶切位点数量比较
Table1ThecomparisonofspecificrestrictionsiteamountsofWYMVCPgen
efromdifferentisolates
潢川I(Huangehuan)
邓l州(Dengzhou)
扬州(Yangzhou)
滁州{Chuzhou)
稚安{Yaan)
同至(Zh~uzh1)
22WYMV不同分离物CP基因的变异分析
根据酶切结果,将河南省邓州市分离物,江苏省扬州市分离物,四川省雅安分离物和陕西省
周至分离物的CP基因分别克隆到pGEM7Zf(+)上,经PCR扩增筛选和酶切鉴定,得到重组
质粒pGDX2,pGDX9,pGYZ5,pGSC422和pGSX11.
核苷酸序列分析结果表明,wYMV不同分离物的CP基因在核苷酸序列上存在一定的差异.扬卅1
分离物,雅安分离物和周至分离物与渍川分离物及日本分离物CP基因长度一致,均为882nt.对邓州
分离物的2个克隆pGDX2和pGDX9的序列测定结果发现,在其CP基因的31~33nt处均缺失了3
个桉苷酸不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为97.3,98.9,由此推导的氨基酸序列同源性
为97.6,99.3(图1,表2)其中,邓州分离物和扬州分离物只有2个氨基酸的变异(其中1个为缺
失),同源性高达99.3,而潢川分离物变异最大,有5个氨基酸均不同于其它分离物.
wYMv外壳蛋白N末端的110个氨基酸和c末端的55个氨基酸在6个分离物间是高度
保守的(图1).由于杆状植物病毒外壳蛋白N末端和c末端多位于亚基表面,并由N末端构成
病毒主要特异抗原决定簇’,因此WYMV的不同分离物其血清学是一致的,这与前人的研究
结果相吻合’.这一结果说明,wYMV外壳蛋白(CP)虽然在不同分离物之间有一定的变异,
作为一种重要的功能蛋白,仍然具有高度的序列保守性.
WYMV不同分离物之间外壳蛋白氨基酸序列同源性均高于97:6,而
与同属于Bymovirus属的
小麦梭条斑花口十病毒(wheatspindlestreakmosaicvirus,WSSMV)及大麦黄花叶病毒(barleyyel—
lowmosaicvirus,BaYMV)外壳蛋白氨基酸序列同源性仅为75.8,76.8和70.8,72.
1_.(参见图1),进一步说明了wYMV与WSSMV应是Bymovirus属内2种不同的病毒.
3讨论
近年来国内外的深入研究结果表明,WYMV和WSSMV虽然同属于大麦花叶病毒属(By
ovirus),并在病毒粒体形态,血清学反应及基因组结构上存在许多相似之处一,但二者间基因
组核苷酸的序列同源程度低于70,应为2种不同的病毒.虽然wYMV不同分离YZ
YA
ZZ
JA
WS
BJ
^DTQTDAQKEEARLAAATKKAADDADAARLRKVEADRVEAAR
VKKASDDx.KARDLTATK6O
++++++++++一
++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++.+++++++++5,
+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++.+++++++++60
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+++十
+++++++A++V+++D+AR++A+++++KQ+++++++++++++++AA+T.A..N+++++58
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+..++++++++++++++G+++++++++++++++++++++++++++++++++++I++H++I118
+...++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++I++++AI118
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+TATE+++VTT+S+++++S++AEVT+T++TM+0A++++4-+++PIA+++
4.v+++M0+++++119
TPT量
++++LKTPs+ARIPS3+ADGN++v+A++Q+++++T+K+PLN++++V+++VM++N+++122
MPTE++++LKTPS+ARIPSs+ADGN++v+A++0+++++T+K+PLN++++V+++vM++N+++122
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+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
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++++++++++++++
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S+++++++++S+++++++++++++++++++++++++++十+H++十
+S+++++++
S+++++++++S+++++++++++++++++++++++++++++H++++S++++
+++
293
292
293
293
293
293
29?
297
297
图1wYMv,wssMV及Ba?V外壳蛋白氨基酸序列的比较
Hg.】A0ac_fIsquencec.mpans0nam0”gWYMV,WSSMVandBaYMVc0atpr(-1eln
沣:Hc:潢川分离物.【)7:邙州分离物,Yz:扬州分离物.YA:雅安分离物.zz:周至分离物,JA:wYMV口l丰分离物一ws
wssMv洼国分离物.上j】;HaYMv日本分离物,BG:BaYMV德国分离物
Note:}{C}H…ch…1s.,.T)ZDenghs.late.YZ
wY1VJapase1at.WS:wSSmVF—ch1soIafe
Yagzhso】ate.YA:Y…1solace.ZZ:Zh.uh11snlace—JA
:BaYMV】paneI.late,BG:hYMVGe….l8tc
端和c端均存在一些保守的区域,若考虑到相似氨基酸在形成抗原
决定簇时可能起相同的作
用,3种病毒外壳蛋白的c末端是非常相似的(圉1).因此具有较近的
血清学关系..
220植物病理29卷
邓州(D~ngzhou)
扬州(Yangzhou)
稚安(Yaan)
周至(Zhouzhi)
97.6983
97.8989
97.498.0
974980
g779S.3
98.6
98.9
98.1
g8.6
98.6
98.3
98.9
比较我国wYMV5个分离物的氨基酸序列可以看出,潢川分离物和其它4个分离物相比,
有7个氨基酸的不同,变异相对较大.侯庆树等通过比较不同地区wYMV的致病性差异,认
为潢川分离物致病性较强,而安徽和陕西分离物致病性中等.研究发现,烟草花叶病毒,黄瓜花
叶病毒和马铃薯x病毒的外壳蛋白基因在致病中起重要作用,甚至外壳蛋白基因上单个氨基酸
的改变就能引起寄主植物的症状变化【].Kashiwazaki等Eta3通过交换不同分离物的RNA组分,
将Bymovirus属的大麦温和花叶病毒(barleymildmosaicvirus,BaMMv)
的致病性基因定位于
RNA1,但对控制致病性的基因未进行进一步定位.至于小麦黄花叶病毒cP基因变异与其致病
性分化关系的深入研究正在进行之中.
参考文献
1李大伟,韩成贵,于嘉林等中国小麦黄色花叶病毒(WYMV)分布的RT-PCR鉴定.植物病理,1997;27(4);303—
907
2侯庆树.真菌传小麦病毒病研究中几个问题的研讨.植物病理,1993;22(2);g7—99
3于嘉林.晏立英,李太伟等一种中国发生的真菌传小麦花叶病毒
RNA13.末端棱苷酸序列分析.病毒,1995;11(3):
248—254
4YuJL,YahLY,SuNel21.AnalysisofnucieotidesequenceofwheatyellowmosaicvirusgenomicRNAsScienceinChi-
na(Seriesc),1999}42(s)(inp~ss)[WYMV潢川分离物核苷酸序列已登
录于DDBJ/GenBank/EMBL数据库,登录号
为AF067124(RNA1)和AFO41041(RNA2)]
5SambrookJ.FritschEF,ManiatisT.Molecularcloning:alaboratorymanua1.andnd.NewYork:ColdSpringHarbor
LaboratoryPress,1989
6NambaS,KashiwazakiS,LuXa1.CompletenueleotidesequenceofwheRtyellowmosaic…genomicRNAs.
ArehViro1.,1998{143:631—943
7ShuklaDD,StrikeSL,TracySLega1.TheNandCterminiofthecoatproteinsofpotyvirusesaresurface--locatedand
theNterminuscontaitmthemajorvirus—specificepitopesJGen.Virol,1988I
69:1497—1580
8周广和,陈剑渡,陈善铭.我国不同地区小麦枝条斑病毒的比较鉴定.
植物病理,1990{2口(2):107—110
9UsuglT,ScbenkPtSignoretPAela1.Somepropertiesofnucleicacidsandc0arproteinsofsoil—bornefilamentousvirus
es.Ann.Phytopatb.Soc.Japan,1989;59126—31
10SohnA,SehenkP,SignoretPAa1.Sequenceanalysisofthe3一
terminalhalfofRNA1ofwheatspindlestreakmosaic
virus.ArchViro1.1994}135;279—292
11KashiwazakiS.MinobeY,OmuraTa1.NucleotidesequenceofbarleyyellowmosaicvirusRNA1.acloseevolutionary
relationshipwithpotyviruses.JGen.Viro].,1990;71:2781—2790
12PeerenboomE.ProlsM,SehellJa1.Thecomp]etenuc[eotidesequenceofRNA1ofaGermanisolateofbarleyyellow
mosaicvirusanditscomparisonwithaJapaneseisolate.JGenViro[,1992{73;1303—1308
13傻庆树,周益军.程兆榜等.我国小麦棱荣花叶病致病型及其有关特
性的比较.植物病理,1993;23(2):150
14粱德林.黄瓜花叶病毒致病及其卫星RNA致弱机理的研究.中国
科学院微生物所博士学位论文,1995
15KashiwazakiS,HibinoHGenomics0rItofbarleymildmosaicvirus:evidencefortheinvol?ntofRNAIin
pathogenicityJ.Gen.Vim[.,1996}77:581—585