[doc] 人胎盘耐热性碱性磷酸酶的分离纯化及其性质的研究
人胎盘耐热性碱性磷酸酶的分离纯化及其
性质的研究
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生物化学与生物物理进展1993年第20卷第l期
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人胎盘耐热性碱性磷酸酶的分离纯化及其性质的研究
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(江苏省原子医学研究b无锟2i4063)
关键诃人胎盘耐热性碱?巨磷酸酶(P—FLSAP),P—HSAP的性质,P-HSAP的
地化,碱?j生磷酸酶sA}?镶撩
人胎盘耐热性谳髋磷酸酶(pl~oentMheBtstable
81kalinephosphatsse,p-HSAP)是一种高度对热稳
定的碱性磷酸酶[AP)同工酶”‘,分子量为13000’0,由
两个相同曲亚基组成.P-HSAP由台体滋养细胞台成
后分珏进入母体血液,孕妇血清中P’HSAP的活性变
化是有规律的h叫,可以作为胎盘功能监担5的指标.
目前P-HSAP也已怍为精原细胞肿瘤的标志物被广
泛采用….制备高纯度p-HSAJ?是建立定量检测方
法的前提.本文报道从人胎盘中纯化P-HSAP的方
法以及对其一些性质的研究..
1材料和方法
i.1材料人眙盘由解放军第1ol医院提供;
DEAE—DE52,Seph~dexG一200为Pharmaci~产品;
cM52为Whstman产品;考马斯亮蓝G25为Fluks产
品;等电点
为LKB产品;十二烷基硫酸钠(SDS),
苯基磷酸二钠为上海化学试剂商店进口分装;其它试
剂均为国产
纯和生化试剂.
1.2AP活力测定主要参考龅氏法”‘铡定,但
有较大改进.以苯基磷酸钠为底物,反应缓冲液为
0.04mol/L巴比妥缓冲液,pH9.6,于37?保温
15rain后用三氯醋酸除去蛋白质,吸取0.1皿l上清加
人定磷试剂,经45?保温l0m1.后在660n皿进行比
色.酶的话力单位(u)定义为在此条件下每min产
生lg无机磷的酶量为lu.
1.3蛋白质舍量测定用考马斯亮蓝G250测
定…,略加改进(所加考马斯亮蓝试剂的体积增加1
倍).牛血清白蛋白为标准蛋白.
1.4聚丙烯酰胺凝腔电泳(PAGE),SDS—PAGE
和等电聚焦(IEF)均按LKB2117电泳手册进行.
1.5酶的分离纯化”胎盘的预处理和正丁
醇抽提接文献【8]进行.将正丁醇抽提波加热至65?
并保持10mia后离心括为4379U/
mg,酶活力回lI殳为57.996.
衰1P—HSAP的分离纯仡
步骤总活力总蛋白比话回收
(u)(mg)(u/mg)(%)
正丁醇抽提蔽29100025601l3.71O0
热空性抽提斌270900980276.493.1
DEAE柱层析lB640062.529B2.464.1
cM柱届析17447050.2{47,.560.0
~ephsdexG一200屡析16860038.54379.257.9
表中数据为两改提取的翠均值,每改提取所用胎盘组瓶
的重量为3OOg.
卫生部青年科学研究基盎资助项目.
收稿日期:1991-10-04怔回日期:1992-01-07
=
田2CM柱屠析纯他P—HSAP
实线:蛋白泼塞Am;虚线:酶活力U/ml
由3SePbldelG一200纯化P—HSAP
实线:蛋白浓度Am;虚线}酶活力u/mt
,
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生物化学与生物物理进展1993年第2O卷第1朝
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2.2酶学性质由本法制各的P—HSAP,以苯
基礴酸=钠为底物,测得其米氏常数为2.5×10
mo|/L,最适反应pH为l0.5左右…’,最适反应温度
在屯左右.
2.3酶的理化性质用SephadexG-200I主层
析测定P—HSAP的分子量约为130000’圈4),用SDS
PAGE测得其亚基分子量为65000(图5),说明由两
千相同的亚基组成,与文献报道相符.
-,
J-
盱4凝睦过滤洼_厕定P—HSAP?的分子量
t蛋白i4403(102.过氧化氢酶(z3oooo);3.醛
缩配(160”000);4-
HSAP对热较稳定,纯酶在65?保蕊3h,活性仍保留
80%以上;当温度提高到90?时活性很快丧失.另
外纯酶在室温放置一和二个月后测定活性,发现话性
并未明显下降.
2.4酶的纯度和嚣基酸组成PAGE和SDS—
PAGE均显示本法制备的P—HSAP为一条带.P—
HSAP的氨基酸组成见表2.
文献报遭应用正丁醇拉挺,pH,丙酮,硫酸镀
分级分离,离于交换柱层祈和凝胶过摅,从人耐”,
肝”Lq]胎盘.’等组织中可以纯化到电泳纯的高活
I
-
,一
…
组成,亚基分子量
为65000,等电点为4.6,以苯基磷酸二钠为底物的
值为2.×lO-*~nolf.L,其最适反应pH为10.5左右,
?65?
最适反应温度为65?左右,特别是诙酶对热的稳定睦
很高,在6s?保温几个小时仍保留大部分括力,宅温
放置二个月瑶性未见下降.这一热稳定性在应用匕具
有较大价值.
参考文献
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