z迎金秋《完美武侠》新版三大活动曝光

前言：回拨人类时钟的魔法一一重编程技术多年以来，人们一直研究细胞的重编程及细胞核的潜在全能性，将这一工作推动到哺乳动物领域的，是1998年多利羊的诞生。而2006年日本京都大学Yamanaka教授在《Cell》上发表里程碑式文章，阐述了其用四个因子（Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc）将小鼠成纤维细胞逆转为类似多能干细胞的实验结果，开创了iPS时代。由于同时具备深远的科学价值和广泛的应用价值，iPS技术成为当今生物学研究的热点，并在2007年分别被Nature、Science评为第一大和第二大科学进展后，又在2008年荣登Science十大科技进展榜首。本篇综述专题将从核重编程，iPS诱导模式以及iPS的技术标准等方面来阐述iPS技术，对其原理、应用以及将来的研究方向做一个系统的介绍。一、细胞核重编程细胞核重编程的意思是细胞内的基因表达由一种类型变成另一种细胞的类型。早期在青蛙克隆的研究为重编程提供了初步的实验证据。之后的证据包括体细胞核移植、细胞融合、由外源基因诱导重编程以及直接重编程。通过这一技术，可以在同一个体身上将较易获得的细胞（如皮肤细胞）类型转变成某一特定的细胞类型（如脑细胞）。这一技术的实现将能避免异体移植会产生的免疫排斥反应。这个部分将对此介绍一些背景理论知识、相关的机理以及对细胞核重编程研究未来的展望。当受精卵发育成一个成熟的个体的时候，特定类型的细胞的是沿“单行道”的形式形成的。随着发育的进行，这些细胞会变得逐渐丧失可塑性，不可逆的成为某一特定类型的细胞。例如，一个皮肤细胞不会自然而然的转变成为一个脑细胞，而小肠细胞而不会产生心脏细胞。然而，却有一些试验方法可以使不同类型细胞之间的转换成为可能。这些方法都利用了细胞核重编程的原理，也就是说让一种细胞的基因表达转变成为胚胎细胞或者其他细胞类型的状况。由于一下三个原因，这一机制引起了科学界的广泛兴趣。首先，了解细胞核重编程是如何发生的能让我们理解细胞分化以及特定的基因变达情况在一般情况下是如何保持的。其次，细胞核重编程代表了人类在细胞替换移植领域迈出的第一步，即从另外一种类型的细胞诱导出所需的细胞，再进行替换治疗。最后，细胞核重编程使得从疾病组织中诱导出可培养的细胞，然后再用于药物筛选成为可能。接下来，我们将对以上所述的重编程方法展开介绍，讨论其背后的机制问题，并且还将探讨这一领域未来的发展方向。卵细胞和卵母细胞的核移植首次证明可以通过实验方法逆转细胞分化状态的证据来自于将一个存活的细胞核移植到去核的蛙卵实验。Briggs和King首次成功实现通过移植Ranapipiens的囊胚细胞核产生会游动的蝌蚪。但是，他们发现如果移植的是处于胚胎发育较晚阶段（肠胚）的细胞核的时候，就会导致非正常发育。于是，他们提出细胞分化可能涉及不可逆转的细胞核转变。不久之后，有人在南非青蛙Xenopuslaevis上进行相似的实验。按照同样的实验方法，他们发现即使用于移植的核是来自于完全分化的细胞，在该实验中是供体蛙的小肠上皮，也能得到发育完全正常并且具有生育能力的雄性和雌性青蛙。这些实验结果告诉人们，细胞分化是可以被完全逆转的，并且不可逆的细胞核变化是非必须的。这一过程涉及细胞核基因表达的变化，但并不涉及到基因本身。因此，即使在发育过程中细胞变成彼此不同，具有各自功能但都稳定存在的个体，但是基因组在所有不同的细胞类型内都是一样的（产生抗体的免疫细胞除外），它们因此保持形成其他不同类型细胞的潜力。这一领域的突破来自于多利羊的实验，这个实验通过将成体羊身上分离出来，并且在体外培养的乳腺细胞的细胞核移植到去了细胞核的羊卵内，从而产生出正常成体山羊。多利羊以及后来的探索表明，可以利用成体哺乳动物的细胞核来完全逆转细胞分化过程，并且提示，这一个机制可能也适用于人类。通过移植成体猴细胞核，能够得到了猴胚胎干细胞的实验是迈向证明这一假设的重要的一步。这些具有完善的生长和分化功能的细胞是从用成体猴的细胞核移植到去核猴卵后发育成的胚泡中分离出来的。因此，在人类的卵子里面也非常可能包含能逆转成体人类细胞分化进程的因子。效率实现由卵细胞诱导的完全重编程的金标准公认为是产生这样一个成体个体，其包含任何一种细胞类型（被定义为全能性），并且具有生育能力。但是，从医学治疗的角度看，我们并不认为得到的细胞否具有全能性，甚至多能性（即具有分化成虽然不是所有，但是大多数细胞类型的能力）是一个必须具备的属性。例如，在治疗上，为一个脊椎损伤的病人提供能分化成任何一种类型细胞的细胞是不必要的。在讨论体细胞核移植的时候，知道利用来源于完全不相干的另一种细胞的细胞核来进行移植，并且得到特定类型的细胞的效率是很重要的。已有实验结果显示，细胞核重编程的效率会随着供体细胞的分化程度加深而降低。通过一系列的核转移实验（从一个核移植胚胎中将细胞核移植到另一系列的去核卵子中）以及核嫁接实验（从一个核移植胚胎中将细胞核移植到从同一品系受精卵发育而来的受体胚胎中）,得出了约30%的小肠上皮细胞核能够产生具有功能的肌肉和神经细胞的结论。在哺乳动物身上，可以从核移植胚泡的细胞中产生胚胎干细胞，并且可将这些细胞移植到正常的受体胚胎中去测试它们的分化能力。相对于用胚胎细胞核所能达到的30%效率，用已分化细胞的细胞核得到正常动物的效率通常在1%到2%之间。到目前为止，还没有从相距甚远的异物种组合，包括将人的细胞核移植到猴卵母细胞的细胞质中，从而得到可以传代的胚胎干细胞的证据。机理用卵子去进行细胞核重编程的一个值得关注的地方是卵子具有以100%的效率重编程定向分化了的精子细胞核的能力。另外一个优点是利用这一方法并不需要对移植的细胞核及其产生的重编程细胞进行永久的遗传学改变（即病毒插入、强制打开特定基因等）。因此，发现包含其中的机理就非常重要了。我们需要解决的问题是为什么重编程能够被成功的实现？而又是什么因素常常导致这一过程的失败，在即便使用卵子细胞的条件下也是这样？有人利用卵母细胞（第一次减数分裂早期的雌性生殖细胞，是产生卵子的前体细胞）探索了卵细胞（处于第二次减数分裂中期）的重编程机制。许多移植进卵母细胞生殖泡的哺乳动物体细胞核被直接重编程而表达干细胞标志基因，包括Oct4,Sox2和Nanogo在卵母细胞内进行的细胞核重编程不会产生新的细胞，但是与卵子相反的是，这一过程的发生既不需要细胞分裂，也不需要蛋白质的合成。伴随这个重编程的机理包括：异染色体的开放；分化标记，如DNA甲基化的去除，组蛋白修饰以及组蛋白交换等等。这些事件发生的基础是：受精卵拥有能引起上述效应的高浓度特定蛋白。如果卵子的蛋白能够在几秒或几分钟的时间内被交换到移植进来的体细胞核的话，那么完全重编程就应该总会发生。但是，这个概念却和另一个事实相悖。那就是卵子常常不能完全重编程植入其中的体细胞核。如果以上所说的染色体蛋白迅速交换适用于卵子里用来重编程受精卵的细胞核的话，在卵细胞第一次分裂之后，蛙类细胞就会需要一定的时间，并且哺乳动物细胞里应该需要更多的时间去完成彻底的重编程。但这通常不会发生。一个可能的原因是移植进来的细胞核携带了供体细胞的表观遗传学记忆。例如，在肌肉细胞里取出的细胞核，用于重编程后，在重编程的胚胎里发育出来的神经或其他非肌肉细胞里还会强烈的表达肌肉相关的基因。这可能是由卵子组蛋白里大量存在的H3.3亚型整合到核移植后的供体细胞核里所引起的。组蛋白H3.3的表达被认为能阻碍重编程的发生，并且会保留以前的基因表达的记忆。细胞融合与细胞提取物在技术上是有可能让两个细胞发生融合，同时用细胞分裂抑制剂来保证融合后两个细胞核是分离的。在这些融合体里面，主导细胞，通常是体积较大并且分裂活性较强的那个，会影响另外一个细胞核的基因表达情况。这方面的例子包括红细胞和体外培养的正在增殖的细胞的融合，以及人类肝脏细胞和肌肉多核细胞的融合。如果去掉细胞核的一种体细胞的细胞质与另外一种细胞融合的话，它们也会将供体细胞的表达谱强加于受体细胞的细胞核之上。但是，这些融合细胞生长不佳，因而也没有太大的医学意义。一些重要的结论可以从上述这些实验中得到。其一就是细胞核的涨大和染色体的去以染色质化会发生在基因表达谱的重编程之前。另一个就是新的基因表达谱并不依赖于供体基因表达谱的退去或者细胞分裂。因此，所以上述这些都不是重编程所必需的。另一个重要的结论就是，分化的细胞以及胚胎的细胞包含可以改变其他细胞的细胞核基因表达情况的调节分子。当受体细胞体积非常大的时候，例如卵子或肌肉束（100或更多的肌肉细胞形成的大型细胞），它自身的调节分子大大超过可以让细胞产生出现胚胎干细胞特征的外来调节因子结论就变得可以理解了。这些分子在正常生理情况下的作用可能是确保这些细胞以及它们的后代不会逃离它们所属的种系或者改变细胞类型。换据话说，细胞似乎在不停的重编程自我以保持它们自己以及它们的后代保留在原来的品系里面。诱导全能性这个领域的一个惊人的突破发生在2006年，Takahashi和Yamanaka发现往小鼠成体成纤维细胞里转入四个基因（Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4）以后，这些细胞能被诱导成为具有胚胎干细胞特征的细胞。后来引入Nanog表达的筛选系统后，得到的干细胞移植入具有免疫耐受能力的受体胚胎后，还显示出参与发育的能力。因此说它们是具有多能性的，所以叫做诱导性多能干细胞，或iPS细胞。从人的体细胞上获得多能干细胞也需要上述的四个转录因子或者另外一组由Oct4,Sox2,Nanog和Lin28组成的组合。这些程序现在已经得到确认并且发展。已被证实iPS细胞可以从终末分化的胃和胰脏细胞中得到，并且在去除癌基因c-Myc情况下也能得到。这些干细胞似乎与胚胎干细胞并没有多大的区别，并将有可能最终应用在产生病人特异性细胞进行细胞治疗，用于提供合适的能分化为各种组织的细胞来源，或者应用于测试潜在的治疗药物。但是，这些都必需在通过改良方法而去除由于病毒载体引起的基因组插入隐患后才有可能成为现实。最近的成果表明，稳定的基因组插入并非必不可少，并且有研究报道可以通过使用腺病毒或者质粒来传导外源基因，从而朝这一方向迈出了一步。通过导入外源因子而使分化的体细胞变成iPS细胞的机理并不清楚。因为在早期的实验中，这些细胞出现的比例是如此之低（1000到10000份之一的起始细胞），并且这些被感染的细胞一般要在外源因子存在的情况下增殖将近两个星期，这些似乎偶然形成的iPS细胞的来源确实难以分析。在某些情况下，多能性状态的维持可能需要抑制分化程序，可能涉及的机制已经在其它综述里提及。品系转变通过外源表达基因来改变细胞的分化类型在很多年前就由Weintraub通过发现“主导基因”MyoD而提出了。过表达这个在肌肉细胞里特异表达的转录因子就足以将一系列非肌肉细胞转变成为肌肉细胞了。然而，在其它一些类型的非肌肉细胞里，这种转变只是暂时的，或者干脆无法观察得到。在观察到肌肉样的细胞出现之前，在好几个细胞世代里对外源MyoD表达的选择是必需的。一旦转变成为肌肉细胞以后，MyoD就会激活自身的持续表达，外源MyoD的过表达就不再必需了。细胞类型的转换在其它好几种细胞类型之间，特别是形成血液的细胞品系之间，也可以通过外源表达一些转录因子来实现。这些转录因子的相互平衡能激活或抑制决定细胞命运的基因表达。在这些变化当中，在新的类型细胞形成之前，可能涉及一个倒退到分化程度较低的状态，也就是一个去分化过程。就MyoD而言，培养的细胞经过许多细胞分裂的选择才能最终形成新的细胞类型。在这个领域的一个最新的进展就是将胰腺的外分泌细胞直接转变成内分泌l的beta细胞。在这个研究当中，用腺病毒转入三个通常为胰岛beta细胞分化所需的转录因子：Pdxl，Ngn3和MafA后，就能够将20%的转染上的外分泌细胞转变成能产生胰岛素的beta细胞。携带外源基因的腺病毒不必整合入外分泌细胞的基因组当中，并且对外源基因表达的需求也是暂时的。另外，这一品系转变并不需要细胞分裂。这个细胞品系转换和由Yamanaka最早做出的iPS一样，为转变细胞命运提供一条共同的策略，那就是设法找出一系列的转录因子就能够实现细胞类型之间的转变。蛋白一DNA相互作用和飞速逃逸细胞分化的两个基本特征影响着我们对细胞核重编程的理解。一个是每种细胞似乎都表达着一些决定它们分化状态的基因。这一结论从细胞融合实验中看得尤其明显。因此，肌肉细胞就会通过自激活高水平的例如MyoD这样的基因去维持自身的状态。这样，细胞越大，或者越像胚胎干细胞，它就会拥有更多“自我重编程”分子。因此，卵子在没有添加外源因子的情况下也很容易被重编程。在所有重编程的实验里，第二个基本特征是当细胞的分化程度变得越高，通过外源基因来重塑表达谱就变得越困难。分化的细胞状态变得越来越牢固，当细胞开始它们的终末分化道路，并且堵上其它不恰当的分化途径。了解这个理论是这一领域的一个巨大挑战，并且大量的信息化工作已经在DNA和组蛋白层面上展开了。一个普遍的假设就是“快速逃逸”策略。我们提出在非活性基因的调控区DNA和组蛋白的结合会变得越来越紧密。虽然大多数的蛋白会以几秒钟或几分钟一次的频率解离与之结合的DNA，并且在一些特殊情况还需要更长的时间，一个由多组分组成的蛋白复合物则可能会在DNA上拥有很长的逗留时间。因此，一个蛋白复合物的所有组分都刚好解离DNA，并且让重编程因子结合上去的几率是非常小的。在胚胎干细胞里，大多数基因（这些基因在分化的细胞里是具有活性的基因溉会处于一个去浓缩的状态，对大蛋白复合物具有较短的逗留时间。根据这个假说，无论是通过核移植、细胞融合、iPS还是转分化来实现的重编程发生的几率就依赖于统计学上DNA调控区域的可进入程度、作用时间、转录本的浓度和其它调控因子。体积大并且拥有大量调节因子的细胞，如卵子和肌肉管，就会像其它通过实验增强转录因子浓度的细胞一样容易被重编程。在未来，一个重要的突破将会是了解为何分化后的细胞的细胞核比胚胎细胞的细胞核更难以重编程。这可能需要涉及组蛋白去浓缩化的解释。展望未来核移植、iPS技术以及转分化之间的机理会不会是一样的呢？或许不会。快速逃逸的概念可能都适用于上述几种情况，不过实际上起重编程作用的因子会不尽相同。我们已经知道卵细胞具有非常高浓度的某些分子，如nucleoplasmin和组蛋白B4以及组蛋白H3.3等。最终识别出卵细胞重编程因子，可能会有助于改善iPS的效率和找到更多成体细胞之间品系转换的途径。在未来，具有价值的重编程细胞应该主要集中在一下两类：一类是从某种遗传病病人身上获得的能够长期培养的细胞系，用以测试潜在的治疗药物或者用于治疗。另一类是能够提供给用于细胞替换治疗（即再生治疗）的细胞。作为治疗用途的细胞可能具有的特性包括：1.能够提供足够的数量；2.能够在通常情况下不整合入受体组织而发挥它们的作用；3.能够产生恰到好处数量的产物。一个人拥有1015个细胞，而一个肝脏包含1014个细胞。为了达到这个数目，一个以10-4的效率从皮肤产生出来的iPS细胞需要经过大量的细胞分裂周期才可达到。尽管如此，人体的某些组织需要相当少量的细胞就能改善功能了。一个例子就是视网膜，仅仅是105的细胞就能具有治疗效应。要是导入的细胞没有“整合”到受体里面的话，这些细胞还还有利用价值吗？大部分的组织是由许多不同类型的细胞组成的。以胰脏为例，包含了外分泌细胞、管道细胞以及胰岛细胞在内至少四种能分泌激素的内分泌细胞。内分泌细胞的替代治疗具有巨大的治疗价值即使它们并没有整合到胰脏复杂的结构当中。在某些情况下，导入的细胞即使是以间接的形式也能提供功能上的有利作用。到目前还不清楚导入的细胞是否能提供适当量度的产物。展望未来，更多的细胞替代治疗的途径或许会出现，其中一个可能就是找到能够进入细胞内的小分子来取代外源基因导入细胞内，又或许能在成体器官内找到越来越多的自然分裂的细胞群体，并且这些细胞能在体外被培养与扩增，然后用于移植。未来的研究方向，至少在我们的观点来看，应该锁定在“单一多能性”或者“寡多能性”（只能产生一种多几种细胞类型）的研究，而不是多能性（能分化成三胚层的细胞的能力），也绝不应该是全能性（能分化成所有胚胎和胚胎外细胞类型的能力）。以此类推，我们更愿意做到通过转换与所需细胞类型相近的一种正常细胞来产生所需的细胞类型，而不是将细胞先转变成全能性的状态再慢慢的从一个很大的范围通过缩小它们分化的道路。如果仅是为了达到细胞替换治疗的目的，全能性或者生殖系传递能力都不是必需的标准或者目标。如果仅从治疗的角度看，一个具有一定分化能力，但是这种分化能力并非无限制的状态可能更为安全和有用。文献来源：Science图一：核移植实验设计。（A）移植到未受精的蛙或哺乳动物卵（二次减数分裂期）；（B）移植到第一次减数分裂的蛙卵母细胞；（C）细胞融合实验设计图二：核移植成功率随着分化程度的加深而下降。图三：核重编程中发生的核增大以及染色质的去浓缩化。（A）鸡红血球细胞和人类HeLa细胞融合后一小时（左），两小时（右）。虚线表示融合细胞的外轮廓。较小的核是属于鸡红血球细胞的。（B）小鼠胚胎干细胞核注射到一个两栖类卵母细胞囊中，左图示刚移植时的图像，右图为注射后2天。这些细胞核在体积上增大了30倍。图四：当一个正常细胞（左）的细胞核移植到一个卵或卵母细胞（右），其染色体蛋白发生了交换。黄色代表供体细胞的核蛋白，维持了其作为体细胞的基因表达，蓝色代表了卵的核蛋白，通过稀释后取代了体细胞核中的蛋白，并诱发了新的基因表达模式。图五：核重编程的四个实验方式。蓝色物质代表从受精卵分化到成体组织细胞的正常途径。红色箭头表示核重编程°（A）核移植到卵细胞；（B）诱导为多能干细胞；（C）品系转换到分化上游并选择另外一个方向；（D）直接转换为另一细胞类型。图的下部表示通过重编程产生ES细胞，这些ES细胞可以形成拟胚体（EB），直接分化（Diff），或者移植到囊胚中，通过这三种方法可以产生不同类型的成体细胞。二、iPS细胞增殖的原种和随机模型iPS细胞为疾病研究，药物筛选，毒理学和再生医学提供了史无前例的前景。然而，重编程的效率很低，并且许多细胞重编程不完全。下文将对iPS细胞增殖瓶颈的原因提出一些假说，同时提出大多数或是所有细胞有潜能成为多能性细胞的模型。从2000年开始，Yamanaka开始尝试用维持胚胎干细胞多能性的因子来诱导体细胞成为多能干细胞。基于这些因子在小鼠胚胎干细胞中的重要性和表达特异性，Yamanaka实验室选出24个因子作为最初的候选。为了评定这些因子的作用，Yamanaka实验室用逆转录病毒将这些基因导入到小鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryonicfibroblast,MEF）中。这些细胞具有抗性基因，只有当Fbxo15（鼠胚胎干细胞中一种维持多能性的基因）表达时，抗性基因才会表达oYamanaka推测，当重组的24个基因表达，并诱导了细胞回到多能状态时，Fbxo15也将被开启1。当这24个候选基因被逐一导入成纤维细胞时并用药物筛选，没有克隆能够出现。而Yamanaka实验室用含有所有24个基因的逆转录病毒进行试验，便出现了若干克隆。令Yamanaka实验室更加惊奇的是，这24个基因中只有4个是形成少量干细胞样克隆所必需的。这4个基因都是转录因子，它们是：Oct3/4（也称Pou5f1），Sox2,Klf4和c-Myc，Yamanaka实验室发现，他们可以重编程来自胚胎和成年老鼠的成纤维细胞2。这些被Yamanaka实验室称为“诱导多能性干细胞（iPS）”的重编程细胞，在形态上和胚胎干细胞相似，它们可以表达重要的胚胎干细胞标志基因，并且将它们注入小鼠可以形成畸胎瘤（包含不同组织型的瘤）。然而，最初的iPS细胞与胚胎干具有不同的全基因表达模式，而且当把它们注入早期小鼠胚胎中，它们并没有形成嵌合体的能力。这些性质表明，这些iPS细胞没有完全的重编程。后来，最终通过改进诱导方法，Yamanaka实验室团队获得了能够产生嵌合体并能进入生殖细胞传代的小鼠iPS细胞3-5。在2007年，用重组了相同或是有稍微改变的基因的逆转录病毒或慢病毒，人的成纤维细胞也可以被重编程到多能性状态6-9。虽然通过病毒转导这些确定的因子，可以重复形成iPS细胞，但是只有少部分的被转导细胞能够在最后具有多能性。在最初报道的具有克隆形成能力的iPS细胞，效率只有大约0.05%——这就意味着，平均在2000个成纤维细胞中，只有一个可以形成多能细胞4。而且有些小组报道，那些看起来像具有多能性的细胞，实际上只有部分的重编程，它们的自Yamanaka更新依赖转基因的外源因子持续表达2,10,11。低效率和部分重编程，对人的iPS在基础研究，药物筛选，毒理学，及再生医学等方面的应用是个巨大障碍。这里提出了2种模型一一原种和随机模型，来解释iPS形成的低效率和部分性质（图1）。原种模型假设：直接重编程的只能在在一小部分被转导细胞中发生；随机模型假设：大多数或是全部的被转导细胞具有重编程的能力。Yamanaka在这篇文章中的观点支持随机模型。1原种模型这个模型假设只有少数细胞有重编程的能力。此模型可以被进一步分成两种：“假定原种”和“诱导原种”模型（图1）。1.1假定原种模型在假定模型中，一小部分的细胞在未经过逆转录病毒转导四个因子之前，就已经具有了重编程能力。组织干细胞和其它具有再生能力的组织中的未分化细胞，是“原种”的良好候选者，它们有能力可以进行重编程。通过核转移（体细胞核转移，或SCNT）进行重编程，用分化较少的原始细胞的细胞核一一如神经干细胞或是胚胎干细胞得到的重编程效率要比用来自末端分化细胞，如淋巴细胞高的多。同样的，用确定的因子诱导多能性，越原始的干细胞越是优先被重编程。多能干细胞也存在与如皮肤的成体器官和组织中。在皮肤中，干细胞约占总体的0.067%13，这个数字与Yamanaka实验室最初报道的的iPS形成效率十分相似。然而，有4点证据反对假定原种模型。第一，目前iPS的诱导效率比最初的报道要高很多。通过简单的延长使Nanog表达的药物选择时间，就可使效率提高10倍一一0.5%的MEF可以变为iPS细胞14。而且，在Yamanaka的实验室逆转录病毒感染MEF通常可以达到2%的重编程效率。通过使用特殊的化学药物，这个效率可以被进一步提高。据报道，使用丙戊酸这种小分子物质结合4个因子，可以使10%的MEF重编程5。但在最初的成纤维细胞中，并不存在2-10%的组织干细胞或是未分化细胞。虽然重编程因子或是化学处理可能优先提高组织干细胞或是原始细胞的的增殖，但似乎更多的体细胞也被重编程，形成iPS细胞。另一个支持随机模型的独立的证据来自遗传谱系痕量分析。除了成纤维细胞，iPS细胞已经从来自包括肝脏16和胰脏17的多种组织中形成。利用Cre-loxP系统得到的iPS进行遗传谱系痕量分析表明：大多数从肝组织中得来的iPS来源于表达白蛋白的细胞。同样的，很多来自于胰脏的iPS来源于表达胰岛素的细胞。这些数据并没有证明终末分化细胞可以形成iPS，因为白蛋白和胰岛素在原始细胞，成熟的肝细胞及胰月邸细胞中都有表达。尽管如此，这些发现还是明确的证明了那四个因子可以重编程已经分化的，能表达白蛋白或是胰岛素的谱系定型细胞。更加直接的证据是Hanna等人获得了来自B淋巴细胞的iPS细胞18。他们通过展示球蛋白位点的遗传重组，证实了终末分化细胞的起始。尽管需要骨髓转录因子（CCAAT/enhancerbindingproteinalpha-CEBPa）的异位表达，或者是B细胞转录因子Pax5的特异敲除，并且需要4个重组因子的诱导，他们的数据还是证明了种系定型的细胞还是可以通过确定的因子重编程。这些证据说明，如果不是全部细胞，大多数体细胞可以变成iPS细胞。然而，某些类性的细胞可能更加容易重编程。的确，小鼠神经干细胞只用Oct3/4这一个因子就可以直接被重编程（文献19）。1.2诱导原种模型在这个诱导模型中，宿主细胞基因组中除了这四个因子之外的某些基因，需要被病毒插入所激活或失活（图1）。因此只有具有特殊的病毒整合位点的细胞才有能力重编程。然而有很多证据不支持这个观点。起源于上皮细胞或组织的iPS细胞，比如肝脏，胃黏膜和皮肤20，比起源于成纤维细胞的逆转录病毒整合少。利用这个现象，Yamanaka实验室使用反式PCR来检测源自两个分别来自肝细胞和胃细胞的iPS克隆中的逆转录病毒整合位点16。没有任何确定共同的整合位点在这个研究中被发现。最近报道，来源与小鼠MEF的6个iPS克隆没有发现共同的逆转录病毒插入21。这些数据意味着逆转录病毒并没有整合进入会形成iPS细胞的特殊位点。更加直接的证据来自若干不使用逆转录病毒诱导iPS的研究。使用腺病毒诱导表达4个因子可得到来源于成年小鼠肝脏的iPS22。另一个研究小组使用2个质粒将MEF诱导成iPS细胞，其中一个质粒是用2A（可自剪切的肽段）连接的Oct3/4,Sox2和壁，另一个质粒连接了c-Myc（也称Myc）的cDNA23。两个小组都表明了在得到的iPS细胞的基因组中，，没有腺病毒的整合和质粒的插入。最近，iPS细胞又通过四种因子的蛋白诱导成功24。而且，人的iPS细胞也通过随体表达载体形成25。在这些iPS克隆中，某些克隆的随体DNA在培养过程中会自动随着分裂稀释而消失。然而，没有通过逆转录病毒形成的iPS细胞效率很低。如，用随体诱导，需要用包括癌基因SV40在内的7个因子。这暗示着插入突变对形成iPS不是必需的，但是可以促进这个过程。如果是这样的话，不同的克隆之间整合位点就没有相同的必要。用逆转录病毒或是慢病毒激活或是失活内源基因，可以提高增殖，降低凋亡，或是提高重编程，推动PS细胞的形成。但是，逆转录病毒插入的位置和数量会对转入基因表达的量，平衡，持续性及沉默造成很大的影响。这就可以解释为何只有少部分的转导细胞完成了重编程过程。2随机模型在随机模型中，用四个因子诱导过后，大多数或是所有的分化细胞都有成为iPS的潜能。细胞分化经常被描述为一个球沿表观遗传的状态往下滚动，这是由ConradWaddington在1957年被最先描述的，细胞从全能状态，穿越多能状态，最终滚落到一个谱系定型的状态26（图2）。在正常的发育过程中，细胞的多能性状态短暂的存在。它们无法在斜坡上停留，被重力拉下去，并且迅速的分化为各种谱系。与正常发育相对的，确定的胚胎干细胞能够自我更新，并能长时间维持多能性。因此，胚胎干细胞似乎是受到碰撞或是遇到障碍，停留在它们特有的表观遗传状态。在这种假说中，4种重编程因子合作将细胞推到了多能的状态。完全的重编程，至少要有2方面的需要。首先，4个因子必需有足够的表达量，可以以正确的方向推动细胞状态。因为现在的技术还无法精确的控制4个基因的表达，第一个的达到只能是随机的。再次，细胞必需达到被阻碍在胚胎干细胞特有的表观遗传状态的阶段这样才能在外源基因表达消失的时候仍然保持在多能状态。由于这四个重编程因子独自还不能形成这样一个表观遗传的障碍，在iPS形成的过程中依旧存在着随机性。通过核转移进行的重编程提示，DNA甲基化和组蛋白修饰，很可能在形成iPS过程中扮演重要角色。2.1重编程因子的表达模式直接的重编程依赖于4个因子转基因的表达量，平衡，连续性和沉默程度。在每个iPS克隆中有高拷贝数的原病毒，这说明强的外源基因表达是最初的需要。Klf4在成纤维细胞中表达，但是内源基因的表达不足以形成iPS。内源的c-Myc基因也在成纤维细胞中表达，但是它的异位表达能够在形成小鼠和人的iPS时，使效率显著提高14,27。iPS细胞的形成也可能依赖于四个因子特异的随机平衡。如，过量的Oct3/4（文献28）和Sox2（文献29）对于维持多能性是有害的。实际上，在那些也表达内源％伏2的神经干细胞中，四因子的iPS的形成效率要高于异位表达的只有其它3因子而没有Sox2的情况下30。c-Myc与Klf4之间的平衡对于由这些癌相关基因造成的凋亡和衰老起到决定性作用。这4个因子的不平衡会导致不适当的重编程，衰老或凋亡。外源基因的持续表达和沉默也是十分重要的。在初始的10到14天32,33，外源基因必需持续表达。在这方面，逆转录病毒载体明显优于质粒和腺病毒。然而，为了完成重编程，在过了初始阶段后，外源基因必需沉默，取而代之的是内源基因，如果外源基因无法沉默，会导致所谓的部分重编程细胞，它们具有胚胎干细胞的形态，并且表达一些胚胎干细胞的标志基因，但它们的分化能力有限2,10,11。外源基因的导入方法对它们的表达量，平衡，持续性和沉默情况有很大影响。用逆转录病毒和慢病毒，原病毒整合的位置有很大的影响。这就可以解释，为什么只有一小部分的诱导细胞能够完成重编程过程，因为每个诱导细胞有独特的整合式样。如果是这样的话，用含有重编程组分的、整合了外源基因的成纤维细胞，形成iPS的效率将会有一个显著的提高。该实验最先由Werning等完成，他们把用强力霉素诱导的iPS细胞注射进囊胚，然后从嵌合胚胎中分离了MEFs，这时再用强力霉素处理这些MEFs，形成“二次”iPS34。在人细胞上作了同样的处理35。通过强力霉素调节的慢病毒获得人的初级iPS，然后诱导分化，得到成纤维细胞，二次iPS细胞用强力霉素再次诱导形成。在这些实验中，有4%的成纤维细胞变成iPS细胞。最近，一种用piggyBac转座子的方法获得约20%的重编程效率36。这些发现表明，这些有外源基因插入的细胞中含有合适的式样，可以提高成为iPS细胞的效率。2.2重编程所需的表观遗传状态即使当四个因子正确的表达，将细胞抬到谷顶，在没有外源基因的表达下细胞可能再次滚落。细胞需要被特殊的表观遗传状态所固定（图2）。这四个因子的内源位点需要被完全激活。一个重要的方面是DNA甲基化的正确。在成纤维细胞和体细胞中与多能性相关的基因，它们的启动子区严重甲基化，但是在胚胎干细胞和iPS细胞中却没有甲基化37。因此，在直接的重编程过程中，这些区域的DNA去甲基化必须完全。因为这四个因子没有自带的DNA去甲基化活性，这个过程可能是个需要细胞分裂的二次效应。这可能是iPS细胞形成很慢并且效率低的原因。事实上去甲基化试剂，如5-氮胞苷，在此模型中可提高iPS细胞的形成效率10。iPS细胞的形成，也需要正确的组蛋白修饰。在胚胎干和iPS细胞中，与多能性有关的基因在启动子区组蛋白H3和H4高度乙酰化。相反，已分化细胞H4的乙酰化程度低。因此，这些区域的H4在形成iPS的过程中被乙酰化。因为这些转录因子自身没有组蛋白修饰活性，所以需要其它因子。C-Myc的一个功能是为目的基因征募乙酰化酶38。事实上，组蛋白去乙酰化酶的抑制剂，如丙戊酸，可以提高iPS细胞的形成效率，这一现象支持在直接重编程过程中组蛋白乙酰化十分重要这一观点戚39。在阻止iPS细胞形成的过程中，组蛋白的甲基化也是重要的。在胚胎干和iPS细胞中，多能性相关基因启动子区，H3在第4位赖氨酸甲基化，在第9位赖氨酸去甲基化。成纤维细胞中含有相反的组蛋白修饰模型。但是，胚胎干和iPS细胞都有称为发育基因的二价染色体结构，组蛋白H3赖氨酸27位和4位上都是甲基化状态（文献40）。这些组蛋白的甲基化状态，是为iPS细胞的形成建立起来的。iPS技术目前仍处在初期，然而它的潜能不可小觑。病人的和疾病特异的iPS细胞为了解发病机理、研发更加安全有效的药物提供了空前的细胞资源。而且，将来iPS技术可以将细胞移植技术变为现实，用来治疗各式的伤病，并且可以防止发生伦理问题和免疫排斥。为了达到治疗的目的，我们必须获得完全均一重编程的iPS细胞。如果这点失败，将会导致无法分化，提高成瘤的危险。随机模型预测iPS细胞可以用多种体细胞，用不同的方法得到。我们需要评估不同的细胞和不同的诱导方法，确定能够形成应用于临床的最安全的iPS细胞。文献来源：Nature图一解释iPS细胞形成效率低的两种模型。在原种模型中，只有一少部分的细胞，不论在逆转录病毒转导之前还是之后，就能够部分或完全的被重编程。在随机模型中，大多数的细胞开始都可以开始重编程过程，只有少数能够获得完全的重编程。黄色，能够重编程的细胞；粉色，部分重编程细胞；红色，iPS细胞。图2随机模型。全能的受精卵通过多能状态分化成各种不同的种系。在此，Yamanaka把这个过程描述成ConradWaddington所提到的表观遗传斜坡。iPS细胞就像个沿山谷滚下坡的球，重编程的因子共同将它们沿坡推到了多能区。一些细胞被表观遗传的状态（矩形所示）所阻挡在坡上，并且开始自Yamanaka更新（1）。另外一些细胞只有被部分重编程，并没有被挡住；因此在没有外源因子的时候，它们会重新滚下2）。当这些重编程因子表达不合适的时候，细胞有可能转变成另一种细胞类型（3），甚至走向凋亡或衰老的道路（4）。那些在山谷中部的细胞（体细胞），可能比较容易回到多能性的状态。图根据Waddington修改，1957（文献26）三、产生诱导性多能干细胞的指导方针和技术直接将体细胞重编程为多能干细胞为再生医学提供了及其宝贵的资源，它使得用非胚胎材料获得病人特异的任何谱系的细胞成为可能。虽然现行的获得诱导性多能干细胞（iPSC）的方法各异，但其核心都依赖于一组经选择的转录因子。我们比较了目前所有文献报道的方法流程，确定了这些流程中必要的共同步骤，并推荐定义完全重编程细胞的最低标准。此外，还列举了一些旨在优化iPSC过程可重复性的特殊的处理方式，重点强调了对某些参数的标准化以方便对不同的独立实验进行精确的比较。由成体分化细胞诱导而来的多能干细胞具有广阔的应用前景，尤其是在体外疾病模型、药物筛选、细胞取代治疗等领域。此外，将体细胞回复为胚胎干细胞的这种技术为探索一种细胞类型转换另一种细胞类型的分子机制提供了独特的手段。先前设计的多能性诱导策略，比如体细胞核转移（克隆）或者体细胞与胚胎干细胞（ESC）融合,都遭受到技术、伦理和材料保障上的障碍，从而阻碍这些多能性细胞在理论研究和治疗上的应用。因此，采用非胚胎材料直接产生多能性干细胞被认为是一个更加恰当的策略。这种策略更有利于机制的分析，也不会牵涉过多的伦理问题。直接将体细胞重编程为胚胎干细胞的技术完成于2006年。Takahashi和Yamanaka通过外源表达一组选择性的转录因子将成体小鼠成纤维细胞逆转为诱导性多能干细胞（iPSCs）。后续的报道优化了这一技术，同时通过一组严格的分析，证明iPSCs事实上与胚胎干细胞（ESCs）高度类似。2007年，直接重编程在人类细胞中取得成功，为再生医学作出了无法估量的贡献。尽管iPSCs细胞系的建立在概念和技术上都很简单，直接重编程依旧是一个包含大量未知事件的缓慢而低效的过程。为了可重复的获得PSCs，几个可变因素必须考虑，包括：1）选择用于重编程细胞的因子；2）运送这些因子的方法；3）靶细胞类型的选择；4）重编程因子的表达参数，比如表达持续时间和水平；5）获取iPSCs的培养条件；6）识别和（7）鉴定重编程细胞的方法。这篇综述将详细的讨论以上的每一个环节，并将结果概括在图1里。此外还包括一个重编程效率的讨论，目的是为了推动计算和效率报道的标准化。重编程因子的选择直接重编程最初通过在小鼠成纤维细胞中用逆转录病毒转导24个候选基因完成，这些候选基因都与多能性的确立和维持相关。这个24基因的小库最终被发现缩减到四个转录因子：Oct4（Pou5f1）,Sox2,c-Myc,andKlf4，就足以介导重编程。这组核心的转录因子后来被证明在多种小鼠细胞、恒河猴及人的细胞中均能介导重编程。后来，各种不同的四因子鸡尾酒都被成功的用于体细胞的重编程。在小鼠的成纤维细胞中，Sox1和Sox3能取代Sox2,尽管伴随着一定程度的重编程效率的降低；Klf2能取代Klf4；L-Myc和N-Myc能取代c-Myc。同时一组部分不同的转录因子组合，OCT4,SOX2,NANOG和LIN28,也被报导足以重编程人的成纤维细胞。不同细胞中某种重编程因子的内源性表达可使该因子在上述鸡尾酒配方缺席。例如，成纤维细胞表达c-Myc和Klf4,后来证明外源性的c-Myc在重编程小鼠和人的成纤维细胞过程中不是必须的，尽管重编程效率更低及需要更长的时间。神经前体细胞表达比ESC细胞更高水平的Sox2和c-Myc,结果被证明仅需要Oct4/Klf4或Oct4/c-Myc就可以重编程，尽管效率比采用四因子时低。尽管最初的四因子依旧是重编程的标准因子，后来有报导发现少数的几个小分子和额外的因子能提高重编程效率或功能上取代某种标准因子。这种介导物的存在为重编程发生的机制提供了新的见解，大量类似的研究也可能即将展开。使用小分子和可溶性因子的独特的魅力在于它们的运用及其方便同时不会对基因组造成永久性修饰，而这种基因组的改变正是采用逆转率病毒或慢病毒的局限性所在。然而，现在还不清楚小分子是否可以囊括由四因子带来的转录和表观遗传学的一系列改变。对越来越多表观遗传学修饰物使用的一个重要的忠告在于它们广泛的或非特异性的作用可能会引起基因组整体表达的紊乱。比如5胞氮核苷是一个诱变剂，会导致小鼠全基因组DNA甲基水平的改变而导致高频率的肿瘤产生。总体上讲，可供选择及有辅助作用的因子数量正在上升，而新的方法必须经过严格的测试来确保最终产生的iPSCs细胞系的质量。重编程因子运载系统迄今为止iPSCs的产生均通过重编程因子的核酸运载系统获得。最初小鼠和人的iPSCs产生采用的是逆转录病毒载体和组成性的慢病毒载体，而后来则采用可诱导的慢病毒载体。然而，这些病毒系统因其会永久整合进基因组而受到质疑。为了使得PSCs更具治疗的可适性，必须追求非整合的方法。两套该类，腺病毒转运和瞬时转染，已经成功运用于小鼠细胞的重编程，使得最终运用瞬时转运方法获取人的iPSCs细胞成为可能（编者按：目前已经有报道用随体质粒转染或者用穿膜蛋白成功重编程人类体细胞）。最初的直接重编程尝试采用的是基于莫洛尼氏白血病毒改造的逆转录病毒载体。这种载体在干细胞中处于沉默状态。这种自我沉默的特性为初期重编程的尝试提供了便利，因为那时对外源转录因子表达时间的需要尚不明确。然而，除基因组整合以外的几个缺陷阻碍了这些病毒的应用：1）只能感染分裂的细胞，这限制了可被用于重编程的细胞范围。2）沉默在iPSCs诱导过程中逐步发生，使得转化效率较非沉默病毒方法相比低。3）用逆转录病毒制备的iPSCs也常保持着病毒基因的表达，从而限制了其应用性。尽管慢病毒可感染非分裂的细胞并维持高水平的外源表达，但其在多能性状态下的沉默却不尽人意，这种持续的翻译在重编程的尝试中不大可取。尽管采用持续表达的慢病毒载体诱导iPSCs已经被报道，但不清楚在转基因持续表达状态下细胞如何进行分化。药物诱导的慢病毒系统提供了一种更有吸引力的方案，因为它可对重编程因子表达水平进行即时控制。尽管这些病毒也整合进宿主细胞的基因组，但不可否认它们特别适合应用于机理研究。例如，这种病毒的采用已导致“第二次系统（SecondaryiPSsystem）”的出现，在这个系统中，由iPSCs分化来的细胞拥有同样的由初次诱导的iPSCs所赋予的原病毒整合位点。通过再次诱导，病毒携带的转录因子被均匀的重新激活，导致了二次PSCs效率较先前增加100倍以上。这个系统为在化学和遗传水平上筛选促进重编程的因子及优化iPSCs形成条件提供了一个强有力的工具。基于这种方法可能建立的新技术包括定位重编程因子DNA在基因组上的位置以用于排除随机整合的位置效应；将四种重编程因子连在一个转录本上以有利于这种靶标作用。整合型病毒的使用是妨碍iPSC细胞走向临床相关应用的主要障碍，因为有迹象表明基因组的插入可影响基因功能，而病毒基因的重新激活则会导致肿瘤发生。对整合位点的分析没有发现共同的靶标和通路，这表明重编程过程中基因组的整合并非必须。用瞬时转染方法成功获得小鼠iPSC细胞进一步证明了这已观点，同时也为优化人的PSC技术提供了坚实的基础。细胞类型的选择在最初小鼠和人细胞的重编程尝试中，成纤维细胞被作做起始细胞群。成体成纤维细胞之前被证明可以在小鼠中通过核移植重编程，小鼠和人细胞均可中通过细胞融合重编程。另外，分离成纤维细胞在技术上十分简便，而病人特异的成纤维细胞通过像^oriell这样的细胞库也可以很方便的获取。成纤维细胞不仅可以与胚胎干细胞的培养条件兼容，还可以用作胚胎干细胞生长的饲养层细胞，所有这些都让它成为直接重编程作用比较切实可行的初始候选细胞群。至成功的重编程成纤维细胞以来，多种小鼠细胞类型包括胃细胞、肝细胞、胰腺0细胞、淋巴细胞、神经前体细胞及人的角质细胞都被成功地重编程。多数这些实验都采用了遗传标记或其它相关技术来确定供体细胞来源，从而排除了被原有成纤维细胞污染的可能。在这些研究中一个事实浮出水面，细胞类型强烈影响着重编程，包括重编程效率、动力学过程以及简化的重编程因子。例如，重编程小鼠胃和肝细胞的过程中，干细胞特异表达的Fbx15基因的激活比在成纤维细胞中快的多，同时含有更少的病毒整合位点。人的角质细胞比人的成纤维细胞重编程更快更高效。在给定的细胞类型中，重编程因子的有效运送也起着很重要的作用。用腺病毒载体重编程小鼠的成纤维细胞需要的病毒滴度比重编程肝细胞所需要的病毒滴度高出100到200倍。在一个给定的应用中考虑用那种最佳的细胞类型必须考虑到以下几个方面：1）采用哪些简便的重编程因子。2）给定细胞类型的可能性和简便性。3）细胞的代数和来源。衰老细胞或经过几代传代培养的细胞可能包含遗传上的损伤，从而会损害最终获取的iPSCs细胞的治疗潜能；同样的道理，来源于不同组织的细胞等有可能存在DNA损伤，比如皮肤细胞更有可能积累了紫外线诱导的突变，因此不大适合作为临床应用的供体细胞。总体说来，成纤维细胞依旧是研究重编程过程机制的基础研究的首选，而用于应用研究的iPSCs细胞则需供体细胞容易获取、含有较少的遗传紊乱以及容易被瞬时转染方法重编程。表达因子的参数向非整合运送策略的转移使得更好的理解转录因子间的是如何协调进来完成重编程成为必要。为了改进iPSCs细胞的获取过程，详细地说明转录因子的即时需要，以及最优的因子水平和剂量变得十分重要。另外，重编程因子运送的量化对探究这些信息十分关键，同时也可确保实验的重复性，以方便不同的独立实验间比较。细胞不依赖重编程因子外源表达所需的时间长度已经通过采用Dox诱导系统解决。在小鼠的成纤维细胞中，重编程因子需求的动力学已经被量化，重编程过程至少需要重编程因子持续作用8-12天。在人的角质细胞中则大约需要10天。尽管将外源重编程因子的表达时间延长到超过最低限度的时间可以提高克隆得率，持续的外源因子的表达可能反而对多能性造成损害。因此，一个大概的指导方针是一旦出现真正的iPSCs外源表达就必须终止了（在方法与重编程细胞的鉴定中将详细讨论）。在所有的已知案例中，尽管重编程的动力学受初始细胞类型的高度影响，重编程都需要经历好几天时间完成。目前所有已报道的细胞类型资料表明，细胞状态是除细胞类型外影响动力学的另一个原因。这最可能是由于分化因子所导致，但也可能是由于细胞内在的不同，比如细胞周期状态，分化状态和代数。重编程过程对重编程因子所需要的精确表达水平和剂量是很难检测的。重编程因子运载系统的多样性加上逆分化的低效率使得很难详细分析每个重编程因子在致使单个分化细胞细胞获取多能性过程中的作用。然而达到最优的表达水平对重编程相当重要；例如把Sox2从四因子的鸡尾酒中去掉后，将神经前体细胞逆转为PSCs的效率会更高。这表明，外源驱动的Sox2的表达再加上高水平的内源表达对重编程是有害的。二次系统的建立为探索单独的重编程因子的精确作用提供了一个更加可靠的工具，在这个系统中，每个克隆具有同一个独特而可信的重编程因子激活方式。尽管重编程因子的最佳的表达水平和剂量还没有得到很好的阐述，但必须承认细胞接受所有重编程因子在完成重编程的过程中是非常重要的一步，在一定的运载系统中量化单个因子的表达水平对可重复性的获取iPSCs也十分关键。目前还没有报道对所运送的因子进行彻底的量化。在大多数例子中，这些都是通过单独运送报告因子间接的给予解决，比如编码GFP的载体。然而，这些替代指示物的使用提供的是一个不准确的结果。比如，报告蛋白拥有较长的半衰期而变得相当稳定，此外这些蛋白没有经过与转录因子同样的细胞内加工。这些区别部分反映在瞬时运载策略中。在这种策略中需要多重运用重编程因子，而且每个因子重复运用的时间与每个因子表达时间长短相关。在基于病毒载体的方案中，滴度会受到目的基因的影响，因为在包装过程中基因产物高水平的表达，将很有可能改变包装细胞的功能。因此，即便采用固定的转染参数，病毒的滴度仍然是高度可变的。最佳的量化方式是在目的细胞中直接对表达水平进行分析。这种分析可以通过采用连接报告基因来完成，比如使用旧ES-GFP，或通过免疫染色。这些方法的优点在于都可以进行单细胞水平的分析。对重编程因子更加精确的测量可通过评估共感染效率来测定接受所有因子细胞的比例。尽管测试每批产物中每种因子的表达量需要相当大的工作量，但这可以在实验的重复性上获得高回报，此外对各个因子输入量的控制将有利于不同运载方案之间的转换。由于基于病毒基因的运载方法在iPSCs的制备中仍然很受欢迎，产生高滴度病毒的能力就变得尤其重要。详细的专门针对PSCs制备的实验流程提供了一个很好的起始资源。尽管仅局限于逆转录病毒，这些基本的实验流程具有极高的可适性，可以应用于其他不同形式转运系统的优化。其它更大范围的与病毒方法有关的综述也可作为参考。一种可供选择的思路是将病毒生产商业化。这对应用来讲将更加合适，因为应用追求的是获取iPSCs后的下游分析，而不是获得iPSCs过程中手段的灵活性。培养和分离条件小鼠和人iPSCs的分离过程是在维持胚胎干细胞的培养条件下进行的。在此过程中必须确保这种选择性的条件支持胚胎干细胞的生长。尽管可供选择的重编程培养条件还没有被报道。但创造一个确定的、无动物源的培养条件将对建立更适应于临床应用的iPSCs起到推动作用。尽管胚胎干细胞的培养条件足以从多种细胞类型中获取PSCs，但推测认为有利分离胚胎干细胞的培养条件也会增强iPSCs的分离。比如采用血清替代物（KOSR）代替血清极大的促进了胚胎干细胞的分离，同时这种培养条件也被报道可以促进重编程。血清替代物的使用为多种不适合采用标准的血清重编程的细胞类型提供了一个可供选择的重编程培养条件。然而，值得重点强调的是，采用成分不明确的培养基比如血清会引入批与批的差异，可能会引起不可重复性的效果。因此筛选不同批次的血清对胚胎干细胞的支持能力变得十分重要。胚胎干细胞依赖成纤维细胞分泌的细胞因子来支持它们的生长，尤其是人的胚胎干细胞（hESCs）。小鼠的胚胎干细胞可以在凝胶包被、无饲养层细胞及添加额外生长因子的条件下分离和培养。同样，小鼠的PSCs细胞也可以在无饲养层条件下分离。尽管成分确定的人胚胎干细胞培养条件已经建立，但在无饲养层条件下分离人的PSCs还没有被报导过，尽管这一直是临床上避免使用动物源产品的目标。创造合适的分离条件很重要的方面在于取得最优的细胞密度。细胞种植在低密度的培养条件下可能很快衰老而变得不太容易重编程，而细胞种植在高密度的条件下则会很快达到过饱和而阻碍新的克隆的形成，同时还会引起细胞层飘起的风险，尤其是在重编程所需要的漫长的培养时段后期。这种风险已经在高效的第二次系统中得到阐明。在高密度条件下，尽管表达同等的重编程因子，克隆形成率会下降，这表明细胞密度与重编程效率之间是一种非线性的关系。尽管最优的细胞密度有待实验的进一步证实，但一个大概可依照的参考是感染后的细胞种植在约10%的密度，饲养层细胞密度不超过2.5万到5万每平方厘米为宜。确定非成纤维细胞重编程培养条件的特殊性在于其必须同时满足供体细胞和产生的iPSCs细胞的需要。因此，必须在供体细胞原初环境下将重编程因子导入细胞后，逐渐在重编程过程中转化为胚胎干细胞的培养条件。这个过程的时间需要通过实验确定。例如，重编程小鼠的神经前提细胞需要从无血清培养条件到有血清的胚胎干细胞培养条件的转换，如果转换得太早，将无法获得iPSCs细胞。在一些案例中，必须采用同时满足支持供体细胞和iPSCs生长条件的培养基。例如在重编程淋巴