药食昆虫九香虫AFLP遗传多样性研究

药食昆虫九香虫AFLP遗传多样性研究 AFLP 药 食 昆 虫九 香 虫 遗 传 多 样 性 研 究 1 2 1 1 3 1*,,,,,范 钦朱刚利孙学刚蔡红兵廉振民王启瑞 ( 1, ,510515; 2, ,510655; 3, ,716000)南方医科大学中医药学院广东广州 广东环境保护职业学院环境工程系广东广州 延安大学陕西延安 摘要 ,目的,对广州鼎湖山和罗浮山药食昆虫九香虫( Aspongopuchsi nensis Dallas) 种群进行遗传多样性分析。,,利用扩增片段长 ( AFLP) ,AFLP ,。,,4 362 ,293度多态性标记建立九香虫 指纹图谱分析其种群遗传多样性参数结果个引物组合共揭示了 个位点其中 ,80, 94% 。Nei's 0, 246 7,Shannon 0, 3687 ,个位点具有多态性多态性位点所占比例为 种群 基因多样性指数平均为 多态性信息指数为 种 G0, 1701 ,N3, 157。,,AFLP ,群间基因分化系数 为 种群每代迁移数 为 结论标记具有很高的多态性检测效率适合用于分析九香虫种ST m ; ,DNA 。群遗传多样性九香虫种群内的遗传变异程度较高种群具有丰富的 遗传多样性水平 ; ; ; 关键词 半翅目九香虫扩增片段长度多态性遗传多样性 R 282, 74A0517 ) 6611( 2011) 08 ) 04732) 02中图分类号 文献标识码 文章编号 AFLP Analysis on the Genetic Diversity of Physic-edible A, chinensis Dallas FAN Qin et al ( College of traditional Chinese medicine,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong 510515) Abstract ,Objective, To study thgee netic diversity of thep hysic-edible A, chinensis Dallas in Dinghu Mountain and LuofuM ountain of Guangzhou, ,Method,sThe fingerprint of A, chinensis Dallas was setablished througha mplified fragmenlte ngth polymorphism ( AFLP) ,so as to analyze the genetic diversity parameters Ao, f chinensis,,Results,362 clear bands with 293 polymorphic ones wereob tained from4 primer combinations,and the polymorphic bands covere8d0 , 94% of total, Nei's genetic diversity index was0 , 2467,Shannon oplymorphic informa- tion index was0 , 368 7,the genei ffderentiation index ( G) among theo ppulations was0 , 170 1,and the imgration number of eacgenhe ration ST was3 , 157( N) ,, Con clusion, The results showed thaAtFL P analysis was ohf igh efficiency and suitable for analyzing the genetic diversity of m A, chinensis Dallas; Greatg enetic variation and diversity exists in the population of A, chinensis, Key s Hemiptera; A, chinensis Dallas; AFLP; Genetic diversity ASPONGOPU) Semiptera) ? 。( ( HDNA 4 中药材九香虫系半翅目蝽 冷藏待用 取 或于无水乙醇中 ( Pentatomidae) ( Aspongopus chinensis Dallas) 科昆虫九香虫的 1, 1, 2。Taq Plus 、Eco RI、Mse I、T、主 要 试 剂酶连 接 酶 4 ,1,,,、18 干燥体是中国特有种分布于我国东洋界古北界 个 省EcoR I 、Mse I ,TaKaRa 接头接头及引物均购自大连 生物工 。,,。 市九香虫药用历史悠久属常用昆虫类中药材及保健食 品程公司 。《》: 具有较高的药用和营养价值本草纲目对之描述为1, 1, 3。MJ, Research PCR ,UVP主要仪器美国 扩增仪美国 “,,,”。《咸温无毒用 于 膈 脘 滞 气脾 肾 亏 损壮 元 阳本 草 GDS7500 PAC300 ,BIO-RAD 紫外凝胶成像分析系统美国 型 》: “,,新 编中记载虫中之至佳者亦兴阳之物以扶 衰 弱 最 ,ABI 3730XL 。 电泳仪测序仪 ”。 ,宜随着中药现代化研究和动物药研究的不断深入九香虫1, 2 方法 ,已成 为治疗多种疾病特别是某些疑难病症和滋补保健的重要1, 2, 1 DNA 。,总 的提取以个体为单位将活体或冷藏标本 ,2,,3,,4,,5,,6, ,、、药 物如内科疾病胃炎肝癌结肠炎和病毒性肝炎SDS DNA,DNA TE 用 裂解法制备基因组 得到的 重悬于 缓 ,7,、,,等还可用于治疗外科疾病如血管瘤男科疾病肾阳虚阳 痿( 10 mmol / L Tris,0, 1 mmol / L EDTA,pH 8, 0) ,冲液值 中作为 ,8,,9,,10,,11,、、。妇科肿瘤盆腔炎和痛经等 PCR ,1, 2% DNA 扩增模板用 琼 脂 糖 胶 电 泳 检 测 的 质 量 和 ,,然而有报道指出在近几年内我国特有中药材九香虫 。 含量,12,,14, ,将受到灭顶之灾但该虫药的生态现状及多样性保护仍 1, 2, 2 AFLP 。Vos ( 1995) 。试验参照 等的方法进行经 ,、、未引起重视其形态细胞蛋白质和分子等水平的遗传多样 EcoR I / Mse I 、、,8 AFLP 过 酶切连接预扩增后从 对 引物中 ,。,性均未见报道种群现存背景仍不清楚因此为了更有效 、、4 筛选出能获得清晰条带多态性高具有可重复性的 对引 、,地监测管理和保护该药食两用昆虫对其进行遗传多样性 ( EcoR I-ACC / Mse I-CTG,Eco RI-ACC / Mse I-CAA,Eco 物组合 。,AFLP 分析是刻不容缓的为此笔者应用 技术对广州九香 RI-ACC / Mse I-CAC,Eco RI-ACC / Mse I-CAG) AFLP 进行 选择 2 ,虫罗浮山和鼎湖山 个种群进行遗传多样性分析评价其遗 ,Eco RI-ACC 6-FAM 。性扩增其中 为 荧光标记荧光选择扩 ,。传状况旨在为今后的研究工作提供重要参考资料 1, 5% 增产物经 琼脂糖凝胶电泳检测合格后送往上海生工生 1 材料与方法,ABI 3730XL 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司于 测 序 仪 上 以 1, 1材料 6- FAM ,GENEMAPPER v 荧光标记进行毛细管电泳以 1, 1, 1 。试 验 动 物成 年 九 香 虫 采 自 广 州 罗 浮 山 和 鼎 湖 3, 7( Ap- plied Biosystems) ,软件进行全自动数字化片段分析山 13; : 1116) ,( : 9?鼎湖山?鉴定依采集情况为罗浮山 、。进行数据 收集分子量内标校正和迁移片段大小测量 ,13,《》,24 h 据萧采瑜等的中国蝽类鉴定手册饥饿 后直接提 1, 3Hardy-Weinberg 数据分析 在假定种群处于 平衡的状 ,DNA ,态下根据 区带之间的同源性通过测序仪进行图像收 2009263,2010223) 。( 基金项目 广东省中医药局科研课题 ,,1 集和数据分析精确计算出片段大小误差在 个碱基范围( 1969 ) ) ,,,,作者简介 范钦男湖北京山人博士从事中药药理学及分 。* ,,,子遗传学研究通 讯 作 者博 士讲 师从 事 中 药 资 源 及 0、1,,,DNA ,内记为相同的带将测得的各 条带转化为数据 ,E-mail: wqrv@h otmail, com。药理学研究 POPGENEv 1, 32 : 2010-12-20用 计算种群遗传多样性参数多态位点百 收稿日期 Nei's ( H) 、Shannon ,( P) 、分数基因多样性指数多态性信息指 获得的每个多态性位点的出现频率进行数理统计分析可衡 ( I) 、( G) ( N) 。 。4 数各种群间基因分化系数和基因流等量种群的遗传多样性或者遗传变异性基于 种引物组合 ST m 2,APLP 结果与分析统计数据分析明技术可以很好地揭示九香虫种群 2, 1 8 AFLP DNA ( 2) 。个体的选择性扩增结果 从 对 引物中筛选得水平的遗传多样性表 罗浮山种群遗传多样性较 ( H = 0, 258 0,I = 0, 372 1) ,( H、4 , 高鼎湖山种群遗传多样性次之 到条带清晰呈现多态性的 对引物对我国广州鼎湖山和 49 DNA AFLP 罗浮山九香虫种群 个 个 体 的 基 因 组 进 行 分 = 0, 221 2,I = 0, 341 5) 。2 AFLP 基于这 个种群给出的 多态 ,Nei's ( H) , ,1。1 ,362 ,性信息对 基因多样性指数的分析结果显示九香析扩增结果见表 由表 可知共得到 条条带其中 293 80, 94% ; ,2 0, 246 7,多态性条带 条多态性位点百分数为 引物组合 虫 个种群平均遗传多样性即种群内遗传多样性为 I-ACC / Mse I-CAGR,Eco,Shannon 0, 368 7,,中 多 态 性 条 带 比 例 最 高达 多态性信息指数显示种群遗传多样性为 85, 71% ,EcoR I-ACC / Mse I-CAC ,74, 47% 。0, 170 1,最低的是 组合为 种群间基因分化系数为 表示基因交度的种群 DNA 80 : 500 bp。 3, 157,2 ,扩增出的 带的分子大小在 每代迁移数为 表明 种群间有频繁的基因交流种 AFLP 1 表 九香虫种群 扩增结果 。群间的遗传分化较低这些多样性指数提示九香虫种群内 Table 1 Polymorphism of AFLP bands of A, chinensis Dallas ,的遗 传 变 异 程 度 较 高遗 传 变 异 主 要 存 在 于 种 群 内 polymorphic bands多态条带 ( 占 引物组合 扩增条带数?条 %?比例数量条? Primer Combinationsnumber of nbdas 60, 98% ) ,。 种群具有较高的遗传多样性 number Eco RI-ACC / Mse I-CTG83, 6798823 讨论与结论Eco RI-ACC / Mse I-CAA 79, 75 79 63 ,九香虫系我国特有常用中药材之一目前九香虫在药用 Eco RI-ACC / Mse I-CAC 74, 47 94 70 Eco RI-ACC / Mse I-CAG 91 78 85, 71 ,和保健领域药源均系野生资源因生态环境变化和连年大量 ,12,total 362 293 80, 94 总和 ,,。,无序采收资源逐年减少甚 至 濒 临 枯 竭近 年 来其 上 : 49。注样本总数为 ,、市量不断下降而用药量特别是乌龙丸癌痛克和九香胃康 Note: Sample numberi s 49, ,2,,。胶囊等制药用量在逐年增加市场呈现供不应求的态势 2, 2 AFLP ,种群遗传多样性水平 通过 扩增结果分析对所 2 2 表 九香虫 种群遗传多样性水平 Tabe 2 Genetic divesity of two popuations of A, chinensis Daas lrlll 样本数 多态位点数 Shannon I种群 多态性信息指数 P%Nei's HSampleNumber of oplymorphic多态位点百分率 ?基因多样度指数 Population numberbands 2228779, 280, 258 0 ? 0, 183 10, 372 1 ? 0, 274 0罗浮山 鼎湖山 2727375, 410, 221 2 ? 0, 197 60, 341 5 ? 0, 281 9 Population level 0, 246 7 ? 0, 173 3 0, 368 7 ? 0, 255 9 种群水平 Nei's ,,笔者在广州清平中药材专业市场了解到其价格近几年持续走 基因多样性指数分析的九 高的多态位点百分率根据 ,2010 11 200 / kg。,高截至 年 月已达 元 药用已成为导致我国九 香虫种群遗传多样性结果显示种群内平均遗传多样性指数 。0, 246 7,Shannon 0, 368 7,香虫中药资源生物多样性危机的主要因素随着人们对九香 为 多样性指数平均水平为 种群间 ,,0, 170 1,3, 157。虫新的药理学作用认识的不断深入需求将进一步扩大如果 遗传分化系数为 种群每代迁移数为 这些遗 ,,2 资源供给问题得不到有效解决九香虫野生生态系统就难以得 传多样性参数表明该研究涉及的九香虫 个种群内的遗传 ,、,。到维持和保护这必将导致其生物资源的减少遗传多样性资 变异程度较高即提示了九香虫丰富的遗传多样性由于九 。,,2 源的丧失和药材市场伪劣产品的充斥因此有必要选择适当 香虫为广布种仅根据 个种群还难于评估其物种多样性及 ,,各地理种群间的遗传距离需进一步扩大地理种群样本的采 的研究方法对九香虫的遗传多样性和种的真实性进行分析鉴 。,DNA ,,、。集总之深入开展九香虫多样性研究获得 指纹图谱 定为其保护养殖育种及可持续性利用提供理论依据 AFLP 、AFLP 如 指纹图谱等将对九香虫中药资源保护及持续利用 分子标记技术被广泛应用在种群遗传结构和遗传 、,RFLP RAPD ,后继人工养殖种质资源的选择优化实现中医药现代化以及 多样性的研究之中兼有 和 技术的优点具有所 。 DNA 、、、更好地指导临床安全用药有着十分重要的参考价值需 量少多态性丰富对基因组的覆盖比较广不需要 参考文献。预先知道扩增基因组的序列特征等特点但在半翅目昆虫 ,1, 贺云彪,李立荣, 中药九香虫及其伪品的性状和鉴定,J,, 湖南中医药,Tartarotti Rhod- 的研究上应用较少目前仅见 等用该技术对 1997,3( 1) : 46,,导报 nius、Triatoma Panstrongylus 3 DNA 和 属的种类核糖体 转 录 ,2, ,,, 、、J,,,张颖陈建伟高源九香虫资源鉴定化学药理与药食应用研究 2009,5( 9) : 44 ) 47,,亚太传统医药 ( Intergenic spacer,IGS) ITS-1 ( Internal 间隔区的 内 转 录 间 隔 ,3, , ,J,, 2005,36( 3) : 47 ) 48,,裘叶忠浅谈慢性胃炎诊治江西中医药 transcribed spacer,ITS) ,Rhodniini Triato- 进行分析验证了 和 ,4, ,,,, HepG2 、徐波朱光辉夏金堂等中药癌痛克对人肝癌细胞 增殖凋亡 ,15,Rb ,J,, ,2007,11及 基因表达的影响中国组织工程研究与临床康复 mini 。族多种系发生起源假说 ( 12) : 2253 ) 2256, AFLP 该研究对九香虫罗浮山及鼎湖山种群 指纹 图 谱 ,5, 潘智明, 溃疡性结肠炎中西医结合治疗进展,J,, 中华实用中西医杂 2005( 6) : 811 ) 813,,志 ,AFLP ,的初步研究表明标记具有很高的多态性检测效率适 ( 4767 )下转第 页 。合用于九香虫种群遗传多样性分析九香虫种群内具有较 2 ( a) ( b) 图 不同柱温对出峰时间和面积的影响 Fig, 2 Effect of different column temperatures on peak time ( a) and peak area ( b) : 1, ; 2, L-; 3, ; 4, 。注酒石酸苹果酸柠檬酸琥珀酸 Note: 1, Tartaric acid; 2, L-malic acid; 3, Citric acid; 4, Succinic acid, 3 ( a) ( b) 图 有机酸标样和莲雾样品的色谱图 Fig, 3 Chromatogram of organic acid samples ( a) and Eugenia javanica Lam sample ( b) ,J,, 1995,21( 1) : 39 ) 43,,有机酸北京农业大学学报 2, 7( 0, 4 g / L) 、L-0, 8( 方法的 精 密 度 对 酒 石 酸 苹 果 酸 ,2,KAFKA E,KOSAR M,TUREMIS N,et al, Analysis of sugars,organic acids g / L) 、( 0, 8 g / L) ( 1, 2 g / L) 4 柠檬酸和琥珀酸种混合酸的标 and vitamin C contents obfl ackberry genotypes fromT urkey,J,, Food Chemistry,2006,97( 4) : 732 ) 736, ,5 ,4 样进行分析测定峰面积重复 次进行精密度 试 验得 到 ,3, 胡志群,王惠聪,胡桂兵, 高效液相色谱测定荔枝果肉中的糖、酸和维 RSD 1, 99% 、1, 71% 、2, 13% 、2, 44% 。 种有机酸的 分别为 C,J,, 2005,22( 5) : 582 ) 585,,生素 果树学报 ,4, ,, ,,J,, 干宁葛从辛毛细管区带电泳分离电化学检测果汁中有机酸营 3结论 2006,28( 3) : 255 ) 258,,养学报 Zorbax Eclipse XDB C( 4, 6 mm ×25 0, 0 mm,5 采用 18 ,5, ,,, ,J,, 贺家亮李开雄刘海燕高效液相色谱法在食品分析中的应用食 2009,29( 11) : 175 ) 177,,m) ,10% CHOH )0 , 01 mol / L NaHPO( pH 品研究与开发 μ色 谱 柱以 值 3 2 4 ,6, , ,J,, ,1999,21( S2) : 110 )王常糯天然果汁的分析现状云南大学学报 2, 28) 0, 8 ml / min,210 nm ,, 溶液作流动相流速为 在 波长下 111,。,7, ,,,, 可以较好地分离和定量热带水果中的有机酸该方法具有 张晋芬袁冰徐华龙等高效测定水果中有机酸的反向液相色谱法,J,, : 2008,47( 4) : 473 ) 477,,复旦学报自然科学版 、、、,前处理简单灵敏度高测试组分多速度快等优点对于控 ,8, ,,,, 金高娃章飞芳薛亚兴等反相高效液相色谱法测定山楂的有机酸 。制果品质量具有重要的意义 ,J,, 2006,34( 7) : 987 ) 990,,分析化学 ,9, ,,,, 黄红心张玉奎卢佩章等智能搜索用于实际样品的液相色谱分离 参考文献,J,, 1992,10( 3) : 125 ) 128,,条件的优化色谱 ,1, 崔雨林,戴蕴青,韩雅珊, 高效液相色谱法测定水果及其果汁中的几种 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 fingerprinting,J,, Nucleic Acids Research,1995,23( 21) : 4407 ) 4414, ( 4733 )上接第 页 ,15, TARTAROTTI E,CERON C R, Ribosomal ITS-1 DNA intergenic spacer ,6, , ,J,, 李慧琴中医治疗慢乙肝方药的筛选研究现状及展望中国中医药 poymorphism in Triatomines( Triatominae,Heteroptera) ,J,, Biochemica ll2003,10( 5) : 83 ) 85,,信息杂志 Genetic,2005,43( 7 /8) : 365 ) 373, ,7, , ,J,, 1996,17( 6) : 24,,孟景春九香虫为治血管瘤专药江苏中医 ,8, ,, J,, ,2005,27,毕丽娜沈先荣中药治疗勃起功能障碍研究进展中成药 ,16, ,,,, HSP70 3-,杜方磊王洪梅黄金明等中国荷斯坦牛 基因 非翻译区多 ( 7) : 818 ) 820, ,J,, 2010,25( 3) : 14 ) 18,,态性与耐热性的关联分析华北农学报 ,9, , ———( 12)李祥云中医妇科肿瘤的研究概况李祥云教授妇科系列经验 ,17, ,,,, AFLP刘科伟王述彬刁卫平等辣椒细胞质雄性不育恢复基因的 ,J,, 2005,32( 7) : 636 ) 638,,辽宁中医杂志 ,J,, 2010,22( 6) : 58 ) 60,64,,标记江西农业科学 ,10, ,, J,, ,,韩丽李绍波盆腔炎的中医治疗进展现代中西医结合杂志 ,18, ,,,, SYBR GreenPCR 温立斌何孔旺杨汉春等?荧光定量 检测类猪圆 2004,13( 17) : 2364 ) 2366, P1,J,, 2009,24( 4) : 31 ) 35,,环病毒因子 华北农学报 ,11, , 68 ,J,, ,2005,23黄美珍疏肝止痛汤治疗青春期痛经 例四川中医 ,19, ,,, T-srd AFLP蔡刘体胡重怡郑少清航天诱变获得的烟草突变体 的 ( 6) : 74, ,J,, 2010,22( 7) : 14 ) 16,20,,分析江西农业科学 ,12, , ,J,, ,2008,26孟智斌中药濒危物种资源可持续利用对策科技导报 ,20, ,,,, ,J,, 韩烨周志江王培培等片球菌素基因的克隆及表达华北农学 ( 14) : 40 ) 47, 2009,24( 2) : 32 ) 35,,报 ,13, ,,,, ( ) :萧采瑜任树芝郑乐怡等中国蝽类鉴定手册半翅目异翅亚目 ,21, ,,, 1 ,M,, : ,1977,张四才李正跃肖春几种常用分子标记及其在昆虫学研究中的应 第 册北京科学出版社 ,J,, 2006,18( 4) : 66 ) 71,,,14,VOS P,HOGERS R,BLEEKER M,et a, AFLP: A new technique for DNA l用江西农业科学