烟草新病害茎黑腐病及安徽省烟田土壤几种病原物的分子检测的研究（可编辑）

烟草新病害茎黑腐病及安徽省烟田土壤几种病原物的分子检测的研究（可编辑） 烟草新病害茎黑腐病及安徽省烟田土壤几种病原物的 分子检测的研究 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文,是在导师指导下,独立进行科学研究所取得 的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体,均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定,同意学 校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版,允许论 文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文 论文和汇编本学位论文, 收录到《中国学位论文全文数据库》,并向社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名: 导师签名: 羞 日目录 摘要??. 引言? .安徽烟草病害发生为害情况 .烟草主要根茎类病害概况? ..烟草黑胫病 ...烟草黑胫病的症状特点 ...烟草黑胫病病原 ...烟草黑胫病病原的侵染循环及侵染机理...烟草黑胫病的防治 ..烟草青枯病 ...烟草青枯病的症状特点 ...烟草青枯病病原 ...烟草青枯病病原的侵染循环及侵染机理...烟草青枯病防止方法? ..烟草根黑腐病...烟草根黑腐病的症状特点...烟草根黑腐病病原?一 ...烟草根黑腐病病原的侵染循环及侵染机理一 烟草根黑腐病防治方法??.. ... .由镰刀菌引起的黑腐病病害..镰刀菌引起的烟草病害. 层出镰刀菌引起的作物病害?. .. .镰刀菌属分类系统的发展 .分子生物学方法在土壤检测应用.本课研究的目的和意义. 材料和方法? .试验材料? ..生化试剂和药品. ..供试菌株和植物一 .. 引物?. ..培养基的配制?. ..主要仪器. .试验方法?一 ..烟草茎黑腐病株和烟田土样的采集?. ..病原菌的分离?. ..分离菌株的接种试验?. ..病原菌鉴定??. ...病原真菌形态鉴定?一 ...病原真菌分子鉴定?一 ..病原真菌生物学特性研究??. ...病原菌生长量的测定一 ...菌落生长适宜碳源与氮源的确定?.. ...温度对病原菌营养生长的影响??.. ... 值对病原菌营养生长的影响..不同药剂对病原菌菌丝生长的抑制作用??. ..不同烟草品种抗性测定. ..土壤中病原菌的分子检测??. ...基因组的提取? ...土壤病原菌检测??一 结果与分析一 .田间病害调查??. .菌株的分离培养?. .分离菌株的接种试验??. .病原菌种的鉴定?. ..病原菌的形态鉴定??.. ..病原菌的分子鉴定?? 一 .病原菌的生物学特性..生长量测定??...病原菌对碳、氮源的利用??. ..温度对病原菌营养生长的影响. .. 对病原菌营养生长的影响? .病原菌的平皿药效试验 ..不同药剂对病原菌菌丝生长的抑制作用??. ..四种杀菌剂的毒力比较. .不同烟草品种抗性测定? .土壤病原菌的分子检测? ..土壤中烟草层出镰刀菌的分子检测? ..土壤中烟草黑胫病菌的分子检测??. ..土壤中烟草根黑腐病菌的分子检测?. ..土壤中烟草青枯病菌的分子检测??. .. 份土壤样品四种病原菌的检测结果 讨论: .烟草茎黑腐病病原菌鉴定及其生物学特性究?. .安徽省烟草根茎病害种类及分布. .烟草根茎病害症状诊断的复杂性与问题 .四种土传病原菌特异性引物的筛选总结和展望? .全文总结?. .特色与创新 .研究展望?. 参考文献??一 致谢?. 攻读学位期间发论文情况.. 山东农业大学全日制硕士专业学位论文 摘要 烟草是安徽省重要的经济作物,病害的发生一直是影响其优质稳产的重要限制因 素。根茎类病害是影响烟草生长的一大类病害,尤其在多年连作影响下,根茎部病害对 烟草生长和烟叶品质有极大的危害。安徽省烟草根茎部病害主要有青枯病、黑胫病、根 黑腐病等。由于烟草连作,烟株根际附近微生物群落的演变更替,土传病害种类也逐年 增加。.年我们在安徽省四个县采集病株和病田土壤,对皖南烟草产区发生的 一种新的病害?烟草茎黑腐病病组织进行分离、纯化及病原鉴定。 由于烟草根茎类病害种类较多,且常常混合发生,给病害诊断造成较大困难,本研 究利用分子检测方法对烟草根茎类病害进行检测,明确了安徽省烟区主要根 茎病害种 类,为烟草病害的防治提供理论依据,对烟草的稳产优质和持续发展具有重要意义。通 过上述研究,结果如下: 、对安徽省烟草主产区的烟草根茎病害进行了系统的调查与鉴定,描述了病害发生的 症状和对烟草造成的危害。烟草茎黑腐病害的主要症状表现为烟草根茎部变黑,拔出感 后期叶子变黄,萎蔫下垂,严重时整株枯死。 病烟株可见根部变黑腐烂, 、采用组织分离法对发病组织进行分离,获得株真菌性分离物。通过在显微镜下 观察分离物的孢子形态、颜色、产孢结构等,根据分离率的大小把分离物初步划分为三 大类:一类为链格孢,另外两类为镰刀菌。 、通过室内接种试验,确定病原菌。对编号为的致病菌株进行形态学及分子生 物学检测,鉴定引起烟草茎黑腐病的病原为层出镰刀菌。 、对编号为的致病菌株进行了生物学特性研究。菌株生长温度为 ?,最适生长温度为,高于?则停止生长,在 ..均能生长,为 最适生长的酸碱度,最适生长碳源为蔗糖,氮源为甘氨酸,碳源对该菌营养生长的影响 较为稳定,而氮源对其营养生长影响的变幅较大。 、采用生长速率法测定了.羟基一.甲基异恶唑、多菌灵、甲基托布津和代森锰锌种 杀菌剂对致病菌株的室内抑菌效果,并对实验结果进行回归分析。结果表明, 种药剂对烟草茎黑腐病菌的分别为.、.、.和. /, 分别为.、.、.和. /。根据和确定最好的两种烟草新病害?茎黑腐病及安徽省烟田土壤几种病原物的分子检测研究 用药为一羟基一一甲基异恶唑和多菌灵。 、种不同烟草品种的抗性研究结果表明,云烟抗病性最好,病情指数为., 红花大金元病情指数最高,为.,其余种抗病性由低到高依次为:、、 、云烟、中烟、、云烟、碧翠一号。 、采用分子生物学方法对采集的份烟田土壤进行分子检测,检测结果表明,份土 样中层出镰刀菌的检测率为.%,烟草青枯病菌和根黑腐病菌检出比率分别为.% 和.%,黑胫病菌检出比率为.%。其中部分烟田四种病菌都被检出,占总土样的 .%。 关键词:烟草茎黑腐;鉴定;层出镰刀菌;分子检测 山东农业大学全日制硕士专业学位论文 。 , , . , ? . . ., . . , : . .. , , . . . , , . 【: , . .. , . . .~?诵. ..。 . . . . .烟草新病害?茎黑腐病及安徽省烟田土壤几种病原物的分子检测研究 . ,,一 .、. 、. ./.、.、. ./. .. 谢 .,晰 ., :,,,, ,,,. . . “, ,.%,.%, .% .%, .., .% . :;; ; 山东农业大学全日制硕士专业学位论文 引言 烟草,原产自美国,属于茄科 烟草属一年生 草本植物,是卷烟生产的主要原料。我国是当今世界最大的烟草生产国, 左右。近年来,年均增长超过%,烟草己成为 据报道我国烟叶总产量占世界的% 重要的经济作物之一任怀玉,。我国的烟草生产主要以烤烟为主,尼古丁、柠 应用到轻工业、医药业等行业,烟草行业檬酸、木质素等可以从烟草中提取, 已成为全 球一个非常大的产业郑新章等,。年我国卷烟生产创税亿,居各行业 之首。在我国,烟草的种植面积约占全国面积的%,但烟制品的税利在国家财政收入 中占有重要的位置。自年以来,我国烟草行业每年为国家实行财政积累亿元。 烟草在世界上种植时间较早,已有多年的历史,在我国也有近年。随着烟草种 植面积的扩大,烟草病害的发生也日益严重,造成了巨大的经济损失。我国因病害所造 成的损失一般年份约占总产量的%%,给我国经济造成巨大的损失朱亚滨等, 。 .安徽烟草病害发生为害情况 烟草是安徽省重要的经济作物,近年来随着烟草栽培和生产技术的推广,烟草连作 种植面积越来越大,一些病害的发生也逐年加重。病害的发生是影响其优质 稳产的重要 限制因素。据报道安徽省烟草侵染性病害有种高正良等,。其中,根茎类病 害是烟草的一大类重要侵染性病害,尤其在多年连作影响下,根茎部病害严重影响了烟 草生长和烟叶品质。安徽省烟草根茎部病害主要有黑胫病、青枯病、立枯病、低头黑病、 根黑腐病、根结线虫病等。烟草黑胫病、根黑腐病和青枯病是安徽省烟草病害中发病率 较高、毁灭性的土传病害高正良等,;陈瑞泰等,,近年在皖南烟区发病 呈上升趋势。烟草新病害?茎黑腐病及安徽省烟田土壤几种病原物的分子检 烟草主要根茎类病害概况 ..烟草黑胫病 烟草黑胫病俗称烂腰、黑根,测研究 . 是烟草上一类土传真菌病害,病原菌属于鞭毛菌亚门 卵菌纲疫霉属 .朱贤朝,。最早是由 于年在印度爪哇发现和描述的,并将其命名为烟草疫霉 。在我国,随着上世纪年代以后烟草种植面积的扩大,烟草黑胫病迅速蔓 延。黑胫病从发现到世纪年代末,已成为中国烟草生产中危害最大的病害,其中 山东、河南、安徽和四川西部为历史上的重病区朱贤朝,:云南、贵州、湖南、 广东、广西、福建等烟区的发生也相当普遍,并多与烟草青枯病混合发生,使其危害迸 一步加重袁宗胜等,。该病平均发病率为%%,严重田块发病率高达%, 有的地块会造成绝收刘晓侠等,。据不完全统计,在我国,每年烟草黑胫病发 病的面积大约在 左右,产量损失约万千克苏德成,。 ...烟草黑胫病的症状特点 成株期是烟草黑胫病发生的高峰期,主要侵染茎基部和根,在其上形成黑色凹陷的 病斑,故称“黑胫病”。幼苗发病时,先在根、近地面的茎部产生黑色斑,病部向上下 扩展,然后蔓延至全部茎、叶和主根。在病苗茎基部绕一圈,产生“猝倒”症状。但与 猝倒病不同的是,在苗床期,黑胫病的病苗部分或全部根系受侵染腐烂变黑,而猝倒病 在发病前、中期根系较少受到侵染朱贤朝,;王志愿等,。在高湿多雨时, 黑胫病苗全部腐烂, 表面产生白色绵毛状霉,并迅速蔓延到附近的苗上,造成烟苗成片 烂死。 当烟苗移植大田,遇到高温多湿环境,极易发病。发病烟株主要表现为大症状: 黑胫、腰漏、穿大褂、碟片状、黑膏药。根茎交接处先开始变黑,病斑向上扩展,可高 达~ 。成株期发病时,在茎基部先出现黑斑,然后向四周、上下及髓部扩展, 使水分运输受阻,叶片由下而上变黄萎蔫,最后枯萎死亡。拔起病株,可发现病株的根 部发黑,部分侧根、须根腐烂。纵剖茎部,可发现髓部干缩成碟片状,碟片之间有棉絮 状白色菌丝体。通常,叶片上发病较少,但如果条件适宜,雨点飞溅也可以将孢子传播 到下部叶片上,引起叶片侵染,使中下部叶片常产生圆形黑褐色的大块病斑,似沸水烫 山东农业大学全日制硕士专业学位论文 状,病斑无明显边缘,有水渍状淡绿相间轮纹,病斑可很快扩展到茎部。 烟草黑胫病病原 ... 烟草黑胫病的病原为烟草疫霉 抬 ,隶属于鞭毛菌亚门卵菌纲、霜霉 目、疫霉属。病菌菌丝无色透明,无隔膜,有分枝, 宽度为..岫,孢囊梗从病组织气孔中伸出,无色透明,无隔膜,单生或~ 根束生在一起。孢子囊项生或侧生,通常为梨形或椭圆形,顶端有一乳突,少数为个, 孢子囊大小为~ ?一 ,无色透明,内含有颗粒。孢子囊顶生,常 不对称,成熟脱落后湿度适宜即可萌发,产生、一个游动孢子,大多呈圆形,不 圆形或肾形,内含许多颗粒,有侧生鞭毛两根,可以在水中游动。病株残体中亦能产生 厚垣孢子,异宗配合,配对培养时可产生大量卵孢子。藏卵器较小,球形,壁光 滑,基 部呈棍棒状,直径约为 左右,宽约 左右。雄器围生,近圆形或卵形,高约 左右。卵孢子满器或不满器,直径约岬左右。 烟草黑胫病菌为喜高温、高湿的兼性腐生菌,因此在热带、亚热带或暖温带容易发 生。其菌丝在燕麦培养基上生长最好,菌丝呈为白色,最适生长温度为?~?, 不同生理小种稍有差异,美国发现的号小种,最适生?以下或?以上不生长, 长温 度比、、号小种偏低,黑胫病菌生长最适宜值为.~.。湿度对孢子囊萌发 有影响,孢子囊在光线下萌发受阻。孢子囊在遇冷的环境下,会释放出大量的游动孢子, 浓度越高,游动孢子活动力越强,活动时间也越长。毒力强的菌株产生的孢子囊数量也 多,游动孢子释放的时间也越集中,毒力弱的菌株,产生孢子囊的数量比较少,游动孢 子活动时间比较短。如果长时间培养黑胫病菌,其孢子囊形成能力降低,有可能完全丧 失,其致病力容易丧失。 据报道,己发现的烟草黑胫病菌生理小种有、、、号四个。我国也分离出许 多菌种,经试验表明,它们的致病力有较大的差异,不同菌株在菌落的颜色、形状、生 长适温上都存在一定的差异。贵州、云南等地区菌株的生长温度比黄淮烟区的菌株要高 一些。号和号小种在我国也存在苏德成,,烟草黑胫病菌的寄主范围比较广 泛,可侵染多种植物。烟草新病害?茎黑腐病及安徽省烟田土壤几种病原物的分子检测研究 ...烟草黑胫病病原的侵染循环及侵染机理 烟草黑胫病菌是一种土传真菌病害,病菌通常以菌丝体、卵孢子及厚垣孢子在土壤 或植株残余组织上越冬蔡红艳等,。病原菌可以在土壤中腐生,特别在寄主残 余组织存在时,可达年以上。卵孢子和厚垣孢子对不良环境有很强的抵抗力,能在土 壤或肥料中存活年以上,主要生存在在~ 的土层内周嘉平等,。初侵 染源主要是带病的土壤,其次是含有病菌的雨水和农家肥料,此外,风雨也是病害传播 的媒介。土表及土面以下 深的茎基部是烟草黑胫病菌侵染的主要部位王革等, ,一般苗期越小越容易感病。苏德成的研究表明,游动孢子的侵入并不 需要伤口。游动孢子受弱电流吸引 多,它们在 内便可产生芽管并穿入表聚集在根表面马国胜,,以根冠及伤口处最 皮,菌丝可以迅速进入皮层细胞。条件适宜时, 在侵入 之内幼苗就会表现症状,大点的幼苗则~ 就可以萎蔫,周左右死亡。 据陈瑞泰的报道,烟草黑胫病菌侵入寄主植物后会分泌多种酶和毒素,它 们会分解寄主细胞中胶层和导管壁,阻碍导管对水分的运输,使烟株产生凋萎死亡。 ,研究结果表明,在病组织中存在烟草黑胫病菌毒素,可引起健康叶 片和烟苗萎蔫。 ...烟草黑胫病的防治方法 烟草黑胫病的发生流行主要取决于寄主抗病性、病原菌的数量和致病力及环境条件 三个因素的相互作用。总的来说,种植感病品种、病原菌初侵染源数量大或在烟草生长 季节高温多雨,可能引起烟草黑胫病害。 种植抗病品种和抗病育种 目前生产上推广的大多数品种,高抗黑胫病的品种有、一、、云烟 号、云烟等,中抗品种有、、、、、、、 一、一、、 、等品种来自美国,庆胜号、单育 号、云烟号、中烟、革新号、革新号等是国内品种徐美玲,。 利用细胞工程中杂交的技术向某种作物引入抗病基因这一细胞工程育种手段在国 内已有研究周嘉平,;王荔等,。王荔等建立了一套对抗黑胫病 突变体的鉴定体系,陈廷俊等,在试管中筛选烟草抗黑胫病的突变体,为 提供了一些高效实用的方法。通常,寄主抗性变异比菌系的变异 要慢,抗病品种容易丧 山东农业大学全日制硕士专业学位论文 失抗病性。烟草转基因技术受到烟草制品安全性问题的困扰,所以在黑胫病的抗病育种 中应用也尚未见报道。利用杂种一代防治烟草黑胫病具有较好的发展前景。目前国外已 培育出一些高抗烟草黑胫病号小种的品种和品系,如、、等,将 它们作为杂交亲本进行杂交一代的培育。 农业防治措施 烟草黑胫病菌是高度专化的土传病菌,实行轮作对于防治烟草黑胫病的发生具有较 烟稻轮作的地方,在淹水条件下的高的实用价值。尽量与禾本科作物轮作,在 病组织腐 烂较快,一般存活年左右。因为烟草黑胫病菌孢子可在土壤生存较长时间,旱地要收 到较好的防病效果需要一年轮作朱贤朝,。目前生产上大多数实行地膜覆盖, 虽然烟田覆盖地膜对于烟草生长有多种好处,但是由于膜下土温较高、土壤湿度较大, 较有利于黑胫病的发生,因此在气温条件已满足烟株生长的时期应及时揭去地膜。 实行漂浮育苗,进行统一管理,减少土壤病菌带来的一系列麻烦,节省大量的人力、 物力、财力。漂浮育苗的基质和营养液,不但可以供给烟苗苗龄期所需的营养元素,还 可以防止烟苗带菌,减少田间烟草病害的发病率朱银峰,;时向东,;马聪, ;马京民,。 对黑胫病的防治,要高垄宽行栽培,使病田流水不与烟株茎基部接触,减少病菌对 根系的接触侵染的机会。适时早栽,使烟株感病阶段避过高温多雨季节,可减少病害的 发生。把好育苗关,保证培育的烟苗健壮无病,防治将病菌带入大田。 化学防治措施 目前大多采用药剂熏蒸苗床,所以苗床上较少发生该病。如果苗床没有药剂处理, 则可喷施甲霜灵锰锌可湿性波尔多液次。防治烟草黑胫病常用的杀菌剂有% 粉剂、 %甲霜灵可湿性粉剂、%乙磷铝可湿性粉剂和%杀毒矾。%甲霜灵可湿性粉剂 或%甲霜灵锰锌可湿性粉剂用量.~. /,%磷铝湿性粉剂用药量 /,%杀毒矾用药量. /袁宗胜,;孙计平,;张永春,。 目前已发现一些土壤中连续使用甲霜灵类药剂,其药效降低,说明该病菌对甲霜灵产生 了抗药性,因此要周期性轮换使用不同的杀菌剂并且几种防治方法联合使用才能取得理 想的防治效果刘勇,;,。 生物防治 生物防治是对病害进行防治的措施之一,假单胞菌菌株对烟草黑胫病病原菌有 较好的抑制效果,该菌株可抑制烟草黑胫病菌菌丝体生长,并且对于烟草黑胫病菌游动烟草新病害一茎黑腐病及安徽省烟田土壤几种病原物的分子检测研 究 孢子侵染幼苗也有抑制作用王远山,。 等报道,哈茨木霉 可吞噬黑胫病菌,对黑胫病菌号小种具有较强的抗性。据报道内生细菌 菌株对烟草黑胫病的防效达.%王万能,。赵蕾、徐后娟 等也分别报道了壳聚糖、二氢茉莉酸丙酷能诱导烟草对疫霉菌的抗性。赵秀香 等报道侧孢短芽孢杆菌 菌株对烟草黑胫病的 预防作用可达.%,链霉菌 .对烟草黑胫病菌有抑菌活性王清海, 。顾金刚等发现假单胞杆菌 .和芽孢杆菌 .对烟草黑胫病有防病促生作用。 烟草黑胫病原菌主要在植株的根部完成侵入和发展,病菌靠土壤传播并在土壤中越 冬。烟田土壤微生物对烟田生物物质循环、养分及物质转化等方面起着关键作用,而且 土壤中一些有 有的微生物还具有促生 作用。益微生物及其产生的抗生素对病原菌有抑制作用, 因此,发掘根际微生物资源,通过调节植物的微生物环境阻抑病原物的生长繁殖, 甚至有目的的基并使病原物与微生物的相互作用结果利于寄主而不利于病原物,因改造 以提高生防和促生潜能,对于控制烟草土传病害和提高产量具有重要的理论和实践意 义。作为病害综合防治技术和农业生产的措施之一,这种防治手段应得到广泛的重视。 总之,目前烟草黑胫病的防治仍不能靠单一的防治措施,要结合多种防治措施,坚 持以农业防治和生物防治为主,结合化学防治,利用各种措施的有效性,相辅相成,取 长补短,充分发挥其防治作用,把黑胫病造成的损失降到最低限度。 ..烟草青枯病 烟草青枯病是世界烟草生产的一威胁较大的毁灭性病害,于年在美国的北卡 罗来纳州格兰维尔,县名被发现,现已成为各个烟区主要的病害之一,目 前造成的损失已居各类侵染性病害前列,是威胁世界烟草生产的一大毁灭性病害。在中 国,此病在河南、山东、江苏、云南、广西、河北、湖南、福建等地普遍发生,其危害 是毁灭性的,经济损失严重何礼远,;陈瑞态,;,。 ...烟草青枯病的症状特点 青枯病菌主要危害烟株的根、茎、叶,是典型的维管束病害肖田,。条件 适宜下,感病烟株的叶片迅速凋萎,发病初期这些叶片仍为绿色,故称青枯病。田间的 山东农业大学全日制硕士专业学位论文 烟株常会呈现一侧叶片枯萎,而另一侧叶片正常的的状态。在田间烟株叶片 凋萎,植株 死亡,茎杆有黑色条斑,维管束变为深褐色,用手挤压可见白色菌脓,镜检可观察到大 量细菌。烟株感病后,首先变黑的是茎和叶脉里的导管,随后病菌侵入皮层和髓部,外 表出现黑色条斑,条斑有时能延伸到病株的顶部周本国,;孔凡玉,。 ...烟草青枯病病原 年,美国著名植物病理学家..通过对青枯病原的鉴定与描述,定名 . 为 。年,正式提出以青枯雷尔氏菌..命名。菌体短杆状,两端盾圆,无芽孢,无荚膜, 大小为.~ ×.. ,极生鞭毛~根。在琼脂培养基上,菌落形状呈圆 形,表面光滑,初为乳白色,后为褐色,在,,一氯化三苯基四氮唑,不培养基 上,菌落不规则圆形或近圆形,稍隆起,流动性强。有粉红色中心的白色菌落为有毒的 菌株,而无毒菌株则是奶油状、红色的菌落:在酪蛋白胨葡萄糖培养基上,菌 落不规则圆形或近圆形,有较强的流动性,乳白色有光泽朱贤朝,;,。 ...烟草青枯病病原的侵染循环及侵染机理 青枯茵主要在土壤中及遗落在土壤中的病残体上越冬,也可以在寄主体内越冬。据 何可佳等报道,从烟根组织、烟苗根围土壤及烟田土壤中都能分离到青枯菌, 其带菌率分别为.%、.%和.%,说明烟草青枯病的主要侵染源是烟田土壤带菌。 病原菌也可以借排灌水以及入畜和生产工具带菌传播,其中病田流水是病害再侵染和传 播的最重要方式。 烟草青枯病原菌通常从植物根部或茎部的伤口侵入,直接进入导管系统,亦可以从 没有受伤的次生根的根冠部侵入,侵入皮层后在细胞间隙生长,细胞间的中胶层被其破 坏,细胞质壁被分离,木质部被侵染,使导管附近的小细胞受刺激形成侵填体,当填体 受到破裂后,病原菌就被释放进入导管,青枯菌在导管内就会大量繁殖菌体,其代谢产 生的大分子物质会堵塞导管,并在导管内快速生长繁殖,阻碍植物体内水分运输, 青枯病菌还向胞外分泌多种细胞壁降解酶,破坏导管组织,从而引起植株萎蔫和死亡何 荆.远,。 烟草新病害?茎黑腐病及安徽省烟田土壤几种病原物的分子检测研究 ...烟草青枯病防治方法 对于防治烟草青枯病的研究目前主要集中在抗病品种选育、农业防治、药剂防治、 生物防治和生态防治等方面。 选育抗病品种 郑继法等研究表明利用抗病品种是控制青枯病发生有效途径,对烟草青枯 病抗性较强的品种有、和等。此外,、、、等烤 烟品种都对烟草青枯病菌有较强的抗病性周本国等,。 农业防治 旱地烟轮作间隔至少要在年以上,可与禾本科作物轮作,如绿豆、甘薯等,不 要和花生、番茄、马铃薯及姜类等作物轮作。烟苗移栽后,要经常进行田间检查,病株 应立即被拔除并带出田外烧毁,在病穴处撤少量石灰消毒,减少青枯病菌的传播。收摘 烟叶后,为了防止病菌潜存,应立即对病田进行消毒,减少明年病害的侵染来源朱贤 朝等,。 施足基肥,避免迟施或偏施氮肥,适当增施磷钾肥,以提高植株抗病性。氮磷钾的 施用比例以::或为好。氮源应以硝态氮 为宜。如果烟区的土壤偏酸性,则在栽 烟前可旌用适量的石灰朱贤朝等,。 药剂防治 卢洪兴等研究表明,%乙霜青可溶性粉剂对烟草青枯病有较好的防治效 果,其防治效果可达%以上。邓正平等选择植物性药物山苍子和大蒜对烟 草青枯病进行了田间防效试验,表明山苍子平均防效为.%,大蒜为.%,均高 于农用链霉素和烟病克两种农药的对比防治效果。江忠明等实验表明,石硫合 剂可有效防治烟草青枯病,防治效果可达.%.%。姚旺家等通过试验 发现以%粉剂,对青枯病菌能达到较好的防治效果。 生物防治 生物防治通过利用各种生物之间相互依存、相互制约的关系,以一种生物抑制另一 种生物。易有金等从病区健康烟草植株茎杆内分 有强拮抗作用的内生细菌,鉴定为枯草芽孢杆菌,并进行了田间试验, 离到一株对 防治效果可达.%.%,效果良好。很多学者也报道了根际分离或烟草茎秆内 生的芽孢杆菌对青枯病菌的抑制和防治作用罗宽等,,;尹华群等,; 山东农业大学全口制硕士专业学位论文 彭细桥等,;易有金等,。孔凡明等从安徽等地的烟草、番茄和辣 椒等茄科作物根标、根围土壤和植株组织中,分离纯化筛选出个对烟草青枯病菌具 有一定拮抗作用的菌株,并通过接种实验发现拮抗菌的防病作用主要是减轻青枯病的发 病程度,对降低病害的发病率则不起作用。之前对烟草青枯病的生物防治的研究是将拮 抗菌直接导入土壤中,但此方法对青枯病的发生有一定的推迟作用,随着植物生长期的 延长,生防效果下降。土壤添加剂也有报道用于防治烟草青枯病的研究。此外,黎定军 、李清飞、周燕等也分别从烟草根际、根表和组织内部的内生 菌株中分离到相应的拮抗菌株,为生防菌的选择提供了参考。 生态防治 生态防治将生态学原理应用于病害的防治。合理施用有机肥或将有机肥与生物防 治应用相结合,起到改善和修复土壤生态环境,提高土壤和烟株自身抗御病害的能力, 减少肥料和化学农药使用,改善烟叶品质和实现烟叶生产的可持续发展。 ..烟草根黑腐病 烟草根黑腐病是一种常见的土传病害。年由首次在美国报道了此病 的症状,但未指出它由真菌引起;年在对此病症状等做了详细描述; 年对其病原、症状等做了详细的描述。根黑腐病害给烟草的生产造成了巨大的经 济损失,但后来成功培育了抗根黑腐病的白肋烟品种,使病情得到较大控制,随着各类 烟草抗病品种的成功培育,根黑腐病的危害也大大减轻。但适宜条件或品种抗性较低时, 该病仍是世界各产烟国经常发生的主要根部病害,仍然会造成不同程度的危害和损失。 目前,在我国湖北、贵州等省根黑腐病仍然发病较重,严重地块发病率可达% 以上。河南、福建、山东、安徽等省也有发生,并且有加重危害的趋势陈瑞泰等,。 烟草的病虫害发生情况调查统计显示,年我国烟草根黑腐病发生.万亩,造成 经济损失高达.万元。 ...烟草根黑腐病的症状特点 烟草根黑腐病在烟草的整个生长期均可发生,尤以幼苗期至现蕾期发病较重,主要 侵染烟草根系,呈特异的黑色。进入成熟期,田间气温升高,病情减轻,轻病株可长出 新根,恢复生长。 烟草新病害一茎黑腐病及安徽省烟田土壤几种病原物的分子检测研究 幼苗时期,病菌从近土表的茎部侵入,病斑环绕茎部,向上向下侵染,呈“猝倒” 症状。感病后的幼苗,其小根系变黑腐烂,大根系上呈现黑斑,病部粗糙,严重时腐烂, 拔出幼苗时会发现大部分根系断在土壤中,仅看见变黑的茎基部和少数短而粗的黑根与 主干相连。幼苗长势不均,叶子变浅绿色至黄色,病株一般不会死,有时在根系的侵染 部位以上产生不定根,新根仍可被侵染;发病轻的地上部症状不明显。病苗移栽田间其 生长会减慢,遇到潮湿天气病情会加重,重病株的大部分根 中下部叶片变黄、枯萎朱贤朝,。 ...烟草根黑腐病系变黑腐烂,植株严重矮化, 病原 烟草根黑腐病原为根串株霉 . .,属于半知 菌亚,丝孢纲,丝孢目,根串 珠霉属。 菌丝初生透明无色,后变褐色,有分隔,双叉分枝,菌丝直径~岬。在 上培养的菌落平展,呈粉状,主要有两种类型,一种为灰色到淡黑色,另一种为黄棕色 到浅褐色。刘延荣等发现在人工培养条件下,该病原菌可以产生白化菌,并初 步确定正常菌的致病力要高于白化菌。内生分生孢子呈管形,单个或成簇产生于菌丝上, 基部是一个或几个短桶状细胞,顶端是一个细长的逐渐变细的抛掷管状细胞,淡褐色, 分生孢子梗的基部细胞直径~ ,顶端细胞长度在 .范围内,管底直径 ~,管直径 .。在抛掷管内形成内生分生孢子,分生孢子的前端逐渐变 细,基部稍膨大,释放出的分生孢子圆柱状或杆状,两端钝圆,单细胞,薄壁,无色透 明,孢子大小为 ~. ,在人工培养的早期菌丝上大量生成内生分生孢 子。 如果根部初期受侵染,就可观察到大量的内生分生孢子。厚垣孢子在菌丝的顶端或 菌丝任何部位出生的短侧枝上产生,初期透明,后逐渐变成褐色。刘延荣等研 究表明在多种培养基和合成培养基上烟草根黑腐病菌适合生长和产孢,藕一葡萄糖和 培养基生长最好,适当增加一些离子对菌丝生长和产孢有利。菌丝生长的范围 为.~., 最适 ..,生长的温度范围为,最适生长温度为。 内生分生孢子最适萌发温度为一,碳、氮营养可促进孢子萌发,碳源以葡萄糖、 果糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖为宜,氮源以谷氨酸、天门氨酸、丙氨酸为宜。但是 在病原茵的最适培养温度方面,不同地区的病原菌变异较大,从肯塔基、 山东农业大学全日制硕士专业学位论文 加利福尼亚、北卡罗来纳等地采集的分离物,试验测得病原菌的最适培养温度为 ?, 等和等报道病原菌的最适培养温度为~.。在田 间,该病的发病流行温度为~?,超过。病情大大减轻,这与病原菌的适宜生 同样与寄主和环境长温度有差别。说明该病害的流行不仅与病菌活力有关, 有关,当环 境不适宜时,植株的抗病能力降低,易被病菌侵染。 ...烟草根黑腐病病原的侵染循环及侵染机理 烟草根黑腐病菌主要以厚垣孢子和内生分生孢子在土壤、病残体中越冬,越冬后的 孢子萌发产生菌丝,沿根表面形成侵入丝,然后在根表上形成大量的厚垣孢子和内分生 孢子。这些孢子落入土壤中或存在于病残体上,成为明年的初侵染源陈克贽等,。 此外,孢子也会随降雨或灌溉的流水传播,增加了田间的发病率。 根黑腐病的致病机理,主要由果胶甲基酯酶、内多聚半乳糖醛酚酶、内多聚半乳糖 醛酚酶转换消解酶等三种酶在烟草根系受到病菌侵染时,对细胞起降解和浸解作用。果 时活性最大,内多聚半乳 胶甲基酯酶在 时活性最大,内多聚半乳糖醛酚酶在 时活性最大。前两者酶在病菌侵染穿入根组 糖醛酚酶转换消解酶经钙刺激后,在 织的早期起重要作用,而内多聚半乳糖醛酚酶转换消解酶和果胶甲基酯酶在君德定殖期 .时,磷脂酶活性可被钙离子、钾离子和 间对跟组织的广泛降解起作用。同时,在 镁离子激活,通过磷脂酶引起细胞膜内脂类和亚细胞微粒的改变,直接损伤细胞膜的半 ,并影响细胞内线粒体的呼吸功能。 透性 ...烟草根黑腐病防治方法 防治烟草根黑腐病除选用抗病品种外,主要应控制发病的土壤条件,包括土壤湿度、 温度、以及土壤中存菌量等,再配合化学防治、农业措施等综合防治,才能有效地 控制病害发生。 选用抗病品种 目前各类型烟草都有一些抗病品种。如烤烟品种有红花大金元、、、、 、白肋、 等,白肋烟有白肋、、、、、、白肋 、 、 等都对根黑腐病有较好的 鄂烟号等,香料烟有 抗性。烟草新病害一茎黑腐病及安徽省烟田土壤几种病原物的分子检测研究 在烟草品种的抗病性检测方面,饶应勇等对我国当前种植的四个主栽品种 云烟、云烟、红花大金元、等的抗病性进行了田间试验。但是我国各地主 栽品种多样,目前烟草的主栽品种对根黑腐病抗病性的鉴定和评价尚缺乏适宜的分级标 准。 加强农业措施防治 施用有机肥,及时铲除病残体,减少施用石灰性肥料或碱性肥料。氮肥以硝态氮、 尿素制作复合肥为佳。合理轮作,实行年轮作,最好与禾本科作物为最佳,避免与豆 科、茄科作物轮作。提倡高垄栽培,避免低洼积水,造成低温高湿引起发病,如遇低温, 应加强中耕,以提温散湿,促进根系发育,及时清除田间杂草,减少土壤菌源。 培育无病壮苗 烟草幼苗期是生育期中最易感病的阶段,许多抗病品种在幼苗期也易感病,且感病 的幼苗移栽到大田后,也是引起大田发病的主要病源。控制苗床发病是防病的关键。 药剂防治 在化学防治方面,自世纪年代以来,各国科学家试验筛选出了许多对烟草根 黑腐病防治有较理想效果的药剂,如多菌灵、甲基托布津和福美双等 ,。赵永强等在室内测定了种杀菌剂对烟草根黑腐病菌的抑制作用,结 果表明,多菌灵在 和对孢子萌发的抑制率分别为%和.%,多菌灵、大 生、甲基托布津和杀毒矾种药剂对根黑腐病菌的菌丝生长有较强的抑制作用, 且效果稳定。饶应勇等研究发现用%甲基托布津可湿性粉剂灌根,再用% 甲霜灵?锰锌可湿性粉剂灌根,二者结合,就可减少病菌对烟株的侵染。此外,%甲 基托布津和%福美双也可用于防治烟草根黑腐病,但是如果长期使用药剂,病原菌就 会产生抗药性,所以药剂防治尚需进一步改善。 .由镰刀菌引起的黑腐病病害 是真菌中一个庞大的家族,普遍存在于土壤及动、植物有机体内。在地理 上分布极为广泛,其中一些种、变种和生理专化型是导致多种植物病害的病原,甚至摧 毁某些地区的作物生产,。 山东农业大学全日制硕士专业学位论文 ..镰刀菌引起的烟草病害 烟草镰刀菌根腐病是一种具有潜在危害性的根部病害。贵州省、云南省个别县有零 星发生,在苗床期和烟草生长后期比较见,一般株率在%~%。镰刀菌普遍存在于烟 株根、茎、叶和花等部位,但根部尤其显著。病株生长衰弱矮小,早期枯萎。幼苗受害 后萎蔫倒伏死亡,叶片皱缩变褐,基部软腐状,潮湿条件下有粉红包霉状物,病株比健 株显著矮小,色黄,生长慢,茎杆纤细。病重植株上部枯死,根部腐烂。拔起病株,可 见根系明显减少,根系皮层极易破碎脱落,仅剩木质部,且明显变黑,并伴有粉红色、 ,潮湿时可见有白色至粉红色霉层桑维钧,。接近地表部分常出现新生 紫色等 根,极易与根黑腐病混淆。据桑维钧等报道引起烟草镰刀菌根腐病的镰刀菌有 种以上,其中以茄病镰刀菌 .为主。过去国内外学者研究烟 草枯萎病的镰刀菌有多人,如认为引起烟草枯萎的是甘薯尖孢镰刀菌 .和蚀脉镰刀菌 ,但他在烟草上未找到烟草的专化型。 云南农业大学阮兴业教授报道,蔗草镰孢霉 能引起烟草萎蔫症状的出 现,但亦需要伤口才有利侵人,致病性不强,所做的两株 ,从伤口接种后能产 生萎蔫枯死,但致病性也不强。 ..层出镰刀菌引起的作物病害 目前还未有报道由层出镰刀菌引起烟草上的病害。但据黄世文等报道层出 镰刀菌可引起水稻穗腐病,水稻穗腐病过去也称颖枯病、谷枯病、黑穗病、穗褐变病、 褐变穗。水稻穗腐病常常引起稻穗、谷米粒腐坏、变色、畸形,结实率降低 或不实。 水稻感染穗腐病后不但影响产量,还改变稻谷外观,降低稻米品质,危害人畜禽的健康。 粳型常规粳稻、粳型杂交稻、籼/粳杂交稻、大穗型、紧穗型品种特别容易感染该 病。目前我国粳型水稻品种年均种植面积约为万一万,穗腐病常年发生面积 万~万,该病已成为影响水稻高产、稳产和优质生产的重要因素。在欧洲、 非洲等地,有关玉米穗腐病的致病镰刀菌及其毒素种类的研究较多,其中拟轮枝镰刀菌 异名:串珠镰刀菌 和 、层出镰刀菌 亚黏团镰刀菌 , 被认为是引起玉米穗腐病的主要病原菌 报道玉米穗腐病主要是由层出镰刀菌引起 ; ,。据鲁维红等 的,穗腐病又名玉米粒腐病,是由多种病原菌引起的世界性玉米病害。镰刀菌是引起玉烟草新病害?茎黑腐病及安徽省烟田土壤几种病原物的分子检测研究 米穗腐病的主要病原菌,不仅直接造成玉米产量损失, 其分泌的毒素还影响玉米的品 质,对玉米的食品安全性构成威胁。不同气候带玉米产区中,玉米穗腐病致病镰刀菌的 种群结构可能发生改变陈婕,。?等认为层出镰刀菌可引起芦 笋的根腐病,并且由于病原菌生活在土壤中,是一种土传真菌,所以病害的防治十分困 难。病菌可从植物的根部分离出来。病菌繁殖速度较快,所以应在幼苗时期要加强保护。 .镰刀菌属分类系统的发展 年首先在锦葵科植物上发现第一株镰刀菌,并定名为粉红镰刀菌 ,至今对于镰刀菌的分类研究已有多年的历史,鉴定依据不 断发展并完善。然而,由于镰刀菌在生理方面对于环境具有极强的适应性,本身富 于变 异,这为识别和鉴定工作带来许多困难,。关于镰刀菌的分类,历史上众 多学者提出了不同的分类系统。 曾根据大型分生孢子和厚垣孢子的有无,小型分生孢子及大型分生孢 子的形状,以及形成色素的差别等特点,来说明它们的系统发育和亲缘关系,从而建立 了镰刀菌的分类体系。与合著的《镰刀菌属》中有比较全面的介绍。 将镰刀菌划分为个组或群、个亚组和个种、变种和小种。首次明确提出了镰刀菌 的分类系统。该系统根据分生孢子的特征,如长宽比、大小、形状、分割数目、顶胞及 脚胞结构以及一些培养特征,将镰刀菌属多个种、变种划分为个组或群、亚组 或亚群、个种、个变种和个型。这一分类系统是镰刀菌分类系统不断发展的基础 ,。 和对、?的分类系统进行修正之后,将镰刀菌属分为个种, 指出了镰刀菌的变异性,在系统内不设组,提出用单孢分离进行镰刀菌分类,认为大孢 子的形状、小孢子及厚垣孢子的有无是最可靠的鉴定性状,将美丽组行 和马特组 分别改为尖孢镰刀菌 和茄镰孢菌 。但是,这个分类系统没有检索表,并且种的界限比较宽泛,在使用过程中仍有许多的不 便。俄国镰刀菌研究学者对的分类系统加以修订,将大孢子的弯曲 度和顶细胞的形状作为区分种的主要依据,将镰刀菌属划分为个组,个种,个变 种和个专化型。这一鉴定系统并没有精简的分类系统,因为镰刀菌的变 异较大,孢子弯曲度及顶细胞等性状也不太稳定,所以不能作为鉴别依据,。 山东农业大学全日制硕士专业学位论文 其他一些研究学者,如德国的和、和法国的等,都曾提 出关于镰刀菌的分类系统,但都未能脱离和的分类体系。年, 发表了《 ,也是根据的分类系统,部分的沿袭了 、和的概念,对菌的变异性进行描述,建议用单孢分离纯系,在标 准环境采用规格化的标准培养基进行菌株的培养鉴定。 强调了有性世代在分类学中的重要作用,将小型分生孢子梗的形态与产孢细 胞的形状从半知菌的分类中引入镰刀菌分类。分类系统采用了分生孢子形态 和分 生孢子梗以及有性世代作为分类标准,还常常采用菌落色素和大型分生孢子体积等性状 作为辅助。他将该属分为个组,个种与变种和个专化型,并附以详尽的检索表 ,。年,,和合著了 : ,把之前的几个系统进行了优化组合形成了一个新 的分类系统,对个组,个种,其中包括常见的个种进行了描述。主要依据 ,其中美丽组、马特组和腹状组中对于种的描述主要 和对种的描述 根据和的分类,李瑟组的种类描述按照的描述,同 对镰刀菌的分 时参照和的描述。优化后的分类系统种下不设分类单位, 类系统进行了讨论并辅以图片说明。年,和将分类系统中 、 的串珠镰刀菌 进一步细分为 胞 和两个变种。 我国许多学者如俞大绂,、陈鸿苏、陈庆涛、阮兴业等都对镰刀菌进 行了研究,但都未提出一个较为完善的分类系统。王拱辰、郑重、叶琪明、章初龙等 合著的《常见镰刀菌鉴定指南》,描述了我国常见的个种,个变种的培养特征、菌种 形态、分布及产毒等特性。随着分子生物学技术的发展,根据微生物基因组的保守区段 设计特异引物用于检测病原菌的方法已得到了广泛的应用为了及时准确掌握病害进行 预防 ,; ,; ,; ,。在进行 形态学鉴定的同时,常辅以分子生物学方法再次鉴定,以期望取得更为准确的鉴定结果。 .分子生物学方法在土壤检测应用 传统的真菌分类方法主要依据真菌的生物学特性,如菌丝体的形态、分生孢子的形 状、菌落形态、以及培养条件等等。但由于真菌种类多、分布广、形态特征复杂,对未烟草新病害?茎黑腐病及安徽省烟田土壤几种病原物的分子检测研究 知菌株进行准确鉴定往往是专业真菌学家的工作。另外,由于真菌的形态特征和生理生 化指标易随环境条件的变化而表现不稳定。因此,传统的真菌分类和鉴定 。真菌在区段既具有保守性,又在属间及 方法常使人们 产生意见分歧匡治州等, 同属不用种间存在着广泛的多态性,利用这一特性针对区特异性片段进行特 异性扩增的技术,不仅能够对病原真菌的纯培养物进行分类鉴定和病原检测,而且对病 原菌所致的真菌病害的病组织和土壤中病原菌的孢子检测也能达到很好的效果刘春来 等,。 谢勇等根据从获得的疫霉属真菌 .? 序列,设计合成了烟草寄生疫霉的特异性引物,并从不同病组织及土壤中均检测到烟草 寄生疫霉,而参试的其它菌株如交链孢菌菌株、镰刀菌菌株、炭疽菌菌株、立枯丝核菌 菌株、稻瘟病菌菌株和野火病菌菌株均没有扩增产物。 . 扩增了 辣椒疫霉 的区序列,测序后与上已发表的种 不同的疫霉属真菌以及其它卵菌的序列进行比对,设计了一对辣椒疫霉的特异性 引物./一。经过对种尸和种不同的、、 和的扩增发现,该特异性引物只能从 中扩增出一 条约为 的特异性条带。另外,该特异性引物也能从侵染的寄主组织、病田土壤 以及污染的灌溉水中特异的检测到尸基因组的存在。灵敏度测试表明, 该特异性引物利用传统的方法在一止反应体系中能检测到 的基因组 相当于一个游动孢子基因组的一半。而用真菌通用引物/作为 第一轮扩增的外引物,一/一作为第二轮扩增的内引物建立的巢式反应体系, 检测的 灵敏度可以达到 .江反应体系的水平。 .本课题研究的目的和意义 近几年,皖南地区又出现一种新的茎黑腐病,部分烟田大面积死亡,给烟农造成很 大损失。为了做好烟草病害的防治工作,有助于烟农有针对性的科学防治病害。我们对 发病烟区进行了调查、采样,对病原菌进行了分离、室内接种、鉴定和药剂防治试验。 根茎类病害是安徽省烟草病害中发病率较高、毁灭性的土传病害,近年在皖南烟区发病 呈上升趋势。分子生物学的发展为快速、准确检测病原菌提供了基础,为安徽省烟草种 植和烟草根茎类病害的药剂防治提供科学依据,为烟农节省劳动力和生产成本,增加烟 山东农业大学全日制硕士专业学位论文 草行业的社会效益和经济效益。 材料和方法 试验材料 . ..生化试剂和药品 供试试剂:限制性内切酶 聚合酶、 连接 和等、 酶、 等分子生物学试剂购自大连宝 ,、 生物公司,琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自公司。特异 性引物由上海生工生物工程有限公司合成。土壤总基因组提取试剂盒 ?购自公司。 供试药品:%甲基托布津可湿性粉剂浙江威尔达化工有限公司、%代森锰锌 可湿性粉剂四川福尔康有限责任公司、%多菌灵可湿性粉剂河南省金亮精细化 工有限公司、恶毒灵青岛星牌作物科学有限公司。 ..供试菌株和植物 烟草黑胫病菌、烟草根黑腐病菌和烟草青枯病菌三种病原菌均由山东农业大 学烟草 研究室保存。烟草,红花大金元,种子由本研究室提供,烟草品种云烟, ,中烟,,云烟,,云烟,碧翠一号种子均由安徽省农业科学 院烟草研究所提供,育苗床培育,常规管理。 烟草新病害一茎黑腐病及安徽省烟田土壤几种病原物的分子检测研究 表.烟草根茎类病害分子检测所用的引物 ’ /..培养基的配制 培养基:马铃薯 葡萄糖 琼脂粉 水 培养基:牛肉浸膏 胰化蛋白胨 酵母提取物 葡萄糖 琼脂粉 水 培养基:羧甲基纤维素 硝酸钠 磷酸二氢钾 硫酸镁晶体. 酵母提取物 水 燕麦培养基:燕麦片 琼脂粉 水 山东农业大学全日制硕士专业学位论文 ..主要仪器 公司、型凝胶扫描仪 扩增仪 公司、刚扩增仪公司、台式冷冻离心机 公司、电泳仪、恒温水浴锅德国、 恒温摇床上海智城仪器公司。 。试验方法 ..烟草茎黑腐病株和烟田土样的采集 于年和年每年的~月采集于安徽省东至县、青阳县、宣城市、芜湖 市共株病株和份土壤样品。采样时,按照五点取样法,在每块田的个不同位 置取其根际土壤 左右,混合后,留下其中 做为该田病土。各土壤采集后 均于保存备用。在实验室中对烟草病株进行病原菌的分离。 ..病原菌的分离 植物病原真菌的分离采用组织分离法方中达,。首先切取病健交界处的一 小块植株或器官组织,放入%的酒精中~ ,然后用.%的升汞溶液进 行表面消毒.~ ,然后用无菌水洗涤次,移置到培养皿中,培养~ 。 病原菌的纯化:从分离出的菌落边缘挑取一小菌丝块,转移到新的平板上,纯化培 养后 ,取小块组织转移至试管中,培养 至菌丝长满斜面时,保存。 ..分离菌株的接种试验 按照柯赫氏确定病原菌,进行了接种试验。将部分的分离物接种,本研 叶期的烟草,将所得病 究采用分生孢子悬浮液伤根浸根接种法。选用苗龄周~ 原菌接到平板上培养 后,用灭菌水配制孢子悬浮液,在显微镜下采用血球计 数板法,计算孢子浓度,分生孢子数为个/的悬浮液,伤根浸根接种,对照用清 水浸根后置于?温室中培养。观察并记录发病状况,持续周,待处理后的烟苗发病 烟草新病害一茎黑腐病及安徽省烟田土壤几种病原物的分子检测研究 后,对病原菌的进行再分离,并镜检观察分离物是否与接种物一致。 ..病原菌鉴定 ...病原真菌形态鉴定 以病原菌菌落及分生孢子形态为鉴定依据,将在上培养 的具有致病性的菌 株,沿菌落的边缘切取× 的菌丝小块,移入平板培养基中央,每皿一块。 移后置于?的恒温箱中培养 ,观察菌落形态及菌落的颜色变化。切取× 的菌丝小块,移入培养基,?, /振荡培养~ ,取出菌液,制作玻片, 在显微镜下随机测量个分生孢子的大小,记录其形态特征,并与相关文献描述进行 比对。 ...病原真菌分子鉴定 .病原菌