大豆球蛋白11S_7S突变体的创造和鉴定

大豆球蛋白11S_7S突变体的创造和鉴定 大豆球蛋白 11S/7S 突变体的创造和鉴定 李雪华，黄方，喻德跃 (南京农业大学国家大豆改良中心，南京 210095) 60 摘要:通过 SDS-PAGE 电泳，从 Coγ射线辐射大豆品种 M4 代家系中筛选出了一个 11S/7S 5 值为 2.8 的高比值突变体，其对照为南农 88-31。此突变体的凝胶电泳图谱中出现了 7S 的 亚基条带变浅，11S 亚基条带加深现象，提高了 11S/7S 比值。并通过 SSR 分子标记鉴定出 该家系在引物 Satt193 和 Satga002 中，其电泳条带和对照(即未经辐射品种)相比具有多 态性。从而为品质育种提供了新的基因型，并且为控制蛋白质亚基含量的基因功能研究提供 了新的研究材料。 10 关键词:突变体;大豆;11S/7S;SDS-PAGE;SSR 中图分类号:S335 Characterization of the mutant with high 11S/7S ratio in soybean 15 LI Xuehua, HUANG Fang, YU Deyue (National Center for Soybean Improvement, Nanjing Agricultural University, NanJing 210095) Abstract: A study was carried on to select elite mutants rich in 11S globulin among the accessions of M4. Specific values of seed storage protein component 11S/7S were analyzed using SDS-PAGE. We obtained one material that had a specific value of 11S/7S with 2.8 Compared 20 with the control(1.9), the difference is significant. 709 SSR primers were applied to reveal difference between the 11S/7S mutants(2.8) and the control(1.09). The result showed that only two primers Satt193 and Satga002 revealed polymorphic bands between these two materials. And the mutant could be considered as an excellent genotype for quality genetics and breeding. Keywords: Mutant; Soybean; 11S /7S; SDS-PAGE; SSR 25 0 引言 [1] 目前，世界上人类所得到的蛋白质 80%来源于植物蛋白，其中 16%来源于大豆 。大豆 是蛋白质含量最高的作物之一，栽培大豆蛋白质含量一般为 40%左右。大豆种子蛋白质的 主要部分是贮存蛋白，贮存蛋白中大部分为球蛋白。球蛋白又分为豆球蛋白(Legumin)及 30 豌豆球蛋白(Vicilin)，其沉降值分别为 11S 及 7S。大豆籽粒中这两种主要的球蛋白约占 总蛋白量的 65~80%。11S 蛋白中含有较多的甲硫氨酸(1.3%~1.8%)及胱氨酸(1.4%~1.7%)， 而 7S 蛋白中它们的含量较少，分别为 0.3%左右。因此选育 11S 蛋白较多的品种，将可能含 有较多的甲硫氨酸及胱氨酸。研究 11S 和 7S 球蛋白也成为了大豆蛋白质研究的主要内容[2-7]。 Kitamura 和 Kaizuma 对 1700 个大豆材料的分析，11S 及 7S 平均值为 1.12，高的为 1.61~2.59[2]。 35 Schuler 等[3]报道，大豆 7S 球蛋白亚基 α’和 α 基因编码序列存在着保守区。有些学者发现一 些大豆品种贮藏蛋白组成发生了较大变化。Kitamura 等[4]发现 Keburi 品种缺少 α’亚基，后 来证明该品种缺失 α’基因。 1 材料与方法 1.1 实验材料 40 60 Coγ射线诱变大豆五个辐射品种的 M4 代的 600 个家系。其辐射品种为 88-31、86-4、 作者简介:李雪华，女，硕士，从事大豆遗传育种研究。 通信联系人:喻德跃，男，教授，从事大豆遗传育种研究。E-mail: dyyu@njau.edu.cn -1- 南春 201、87C-38、菜豆 1 号。 1.2 11S/7S 值突变体的电泳检测 按雷勃钧方法[8]提取大豆球蛋白，并进行 SDS-PAGE 凝胶电泳。在 SDS-PAGE 电泳过 45程中，电流开始设置为恒流 6 mA，待溴酚兰前沿进入分离胶时，改用 12 mA 电流。然后用 考马斯亮兰染色 1 个小时，再用清水清洗，脱色液进行脱色。电泳结果用 Pharmacia Biotech 公司的 ImageMaster VDS 系统进行扫描并保存。 1.3 11S/7S 比值测定 将 SDS-PAGE 凝胶电泳结果用 ImageMaster 1D Elite V4.0 软件进行分析，确定 11S 和 7S 的含量，并计算 11S/7S 值。 50 11S/7S 突变体的 SSR 标记 1.4 按王树林等方法[9]提取大豆 DNA，并进行 SSR 分子标记，引物序列来自 SOYBASE， 由上海申友和上海申能博彩合成，共 909 对引物。PCR 反应总体积 25 μl，其中 MgCl2 1.5μl; dNTP(N=A， ， ， )(上海申能博彩)0.4μl;10×扩增反应缓冲液 2.5μ(100m mol/L Tris-HCl C G T l 55 pH8.0;500mmol/L KCl;0.1%gelatin;上海申能博彩);0.24μl Taq 酶(上海申能博彩); 引物 6pmol;模板 DNA50ng;无菌超纯水加至 25μl。PCR 反应在 PE 热循环仪上进行，温 度循环是 94? 3min;95? 1min，47? 1.5min，72? 1min，30 个循环;接着 72? 8min， 4?保温。扩增产物在 6%非变性聚丙烯酰氨胶上电泳，1×TBE 作为电泳缓冲液，80V 电泳 2 个小时左右。用 ImageMaster VDS 系统进行扫描并保存 SSR 电泳结果。 602 结果与分析 2.1 高 11S/7S 比值突变种质的筛选与鉴定 利用 SDS-PAGE 凝胶电泳技术对五个大豆辐射品种 M4 代家系进行了分析。结果从南农 88-31 中发现一个突变体 M(B)-928。其中，ck 为对照(未辐射的 88-31 品种)的 11S 和 7S 的电泳条带，M 为突变体 M(B)-928 的电泳条带。7S 条带包括 αˊ、α 和 β 亚基;11S 包括 A 3、A1，2，4 和 B3、B1，2，4。从图 1 中可以看出，该突变体的 11S 和 7S 条带较之对照有 65 些变化，其中，7S 条带中 αˊ和 α 亚基条带变浅;11S 条带中 B 条带加深。进一步采用 ImageMaster 1D Elite V4.0 软件自动计算各组分含量，其结果为 11S/7S=2.8(图 2);而对照 11S/7S=1.09(图 3)。 -2- CK M α? α α? α β β A3 A3 A 1，2 ，4 A 1， 2，4 B3 B1 B1，2，4 B2，4 70 图 1 突变体 M(B)-928 与对照的 SDS-PAGE 电泳图 如图 2、图 3 所示，对照和 M(B)-928 的 β 亚基和 A 亚基的含量相仿，而 α 亚基和 α ˊ亚基的含量差异较大。对照中的 αˊ和 α 亚基含量较高，即 7S 含量高;而 M(B)-928 75 的 B 含量较高，即 11S 较高。这种结果与以上电泳图谱条带分析结果完全相符，用实际数 据进一步证明了高 11S/7S 值突变的存在。 2.2 辐射诱变 M4 代 11S/7S 突变体的 SSR 标记鉴定 对辐射诱变大豆 M4 代突变家系从分子水平上进行多态性筛选，分别提取对照品种和辐 射品种的 DNA 进行同一引物的 SSR 分子标记。结果在 909 对引物中只有突变体 M(B)-928 与对照相比有两个多态(图 4, 图 5)。其多态性引物分别为 Satt193 和 Satga002。 80 图 2 88-31 对照品种 11S/7S 值电泳扫描图谱 -3- 图 3 突变体 M(B)-928 的 11S/7S 值电泳扫描图谱 85 图 4 11S/7S 突变体多态性的 SSR 标记 图中箭头所示为多态性片段。编号 1-2 为 SSR 分子标记的 Marker。 扩增结果中，ck 指对照，M 指突变体 M(B)-928。 90 如图 4 所示，11S/7S 值突变体 M(B)-928(11S/7S=2.8)的 SSR 扩增产物 Satt193，在 大约 250bp 左右，出现一条带(如箭头所示)，而在对照(11S/7S=1.09)的相应位置上没 有这条带。并且在 Satt193 引物上，M(B)-928 的大约 400bp 附近的条带较之对照相应位 置的条带有加深现象。 95 100 -4- 105 1 ck M ck M ck M ck M ck M ck M ck M 2 3 bp 400 300 110 200 100 115 80 Marker Satga002 Marker k 120 图 5 突变体 M(B)-928 的 SSR 多态标记性 图中箭头所示为多态性片段。编号 1、2 和 3 为 SSR 分子标记 Marker， ck 示南农 88-31 对照，M 表示其 11S/7S 突变体。 125 从引物 Satga002 的电泳结果(图 5)可以看出，突变体 M(B)-928 在 250bp 左右较之对 照少了一条带(如箭头所示)。而其余引物均无多态性。这可能在 DNA 序列上的某一 位点上发生了突变，导致其多态性的产生，但是否与编码 11S、7S 蛋白亚基的基因有直接 的联系还需进一步的验证。 3 讨论 豆类球蛋白亚基是由单基因控制[10]，这就为大豆蛋白质品质改良带来了方便。筛选不 130 含蛋氨酸或蛋氨酸含量少的亚基基因缺失材料,是对大豆限制性氨基酸进行改良的基础。目 前已筛选到这种材料，如 Keburi 品种，缺失 αˊ亚基，控制该亚基的基因是 Cgy1;Raiden 品种缺失 A4A5A3 亚基，该亚基由 Gy4 基因控制。本研究筛选并鉴定了在 7S 球蛋白中，α ˊ和 α 亚基较之对照含量明显减少的一个家系，其 11S/7S 值为 2.8。经 SSR 分子标记鉴定， 找到了两个可能与之相关的标记:Satt193 和 Satga002。为了进一步鉴定其多态性的真实度 135 可进一步与该性状相同的近等基因系杂交，根据后代分离情况确定基因的异同。 利用 7S 缺失材料可以进行基因表达调控的研究。7S 蛋白基因是转基因植物研究中所采 用的最早的种子贮藏蛋白基因。α′基因被导入烟草中，得到了其表达具有种子特异性的结论。 另外，我们已经知道大豆 β 亚基基因的表达受硫素营养的影响，大豆根据硫营养的多少改变 所合成的种子贮藏蛋白的组成，这种硫素营养对种子贮藏蛋白的调控在其它植物中也存在， 140 因此推测:对硫素营养的应答机制是普遍存在的。 顺式作用元件的研究是以 α′基因为中心进行的。首先得到 α′基因启动子区域 5′端缺失的 变异株;然后利用转基因烟草研究此变异株的基因表达，测定与基因表达调控有关的顺式作 用元件。结果表明:转录起始点上游-257bp 序列的表达量与含有更长区域的基因表达量相 同;如果此序列变短，则表达量下降;而只具有转录起始点至-69bp 序列的启动子几乎不能 145 转录。反式作用因子的研究以 α′及 β 基因的上游序列为探针，利用转膜分析技术，测定出了 大豆未成熟子叶的粗核抽提液部分中存在具有 DNA 结合活性的因子-SEF(大豆胚性因子)。 -5- 经测定，SEF 在大豆成熟中期到后期具有活性，因此，它可能与 S 蛋白基因的表达调控有关。 在 SEF 中检测出 SEF1,4 四个结合活性，其中 SEF1、SEF3、SEF4 都是识别特定的碱基序 列的结合因子。大豆种子贮藏蛋白的合成、积累及营养价值的研究已逐渐深入到基因表达调 150 控的水平，可见基因表达调控的研究仍是今后研究的重要课题。 [参考文献] (References) [1] 郑云兰, 李霞辉. 大豆营养分析技术[M]. 哈尔滨:黑龙江科学技术出版社, 1991 [2] Kitamura K,Kaizuma N. 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