嗜水气单胞菌鉴定、重组外膜蛋白W的制备及免疫原性的研究(可编辑)

嗜水气单胞菌鉴定、重组外膜蛋白W的制备及免疫原性的研究(可编辑) 嗜水气单胞菌鉴定、重组外膜蛋白W的制备及免疫原性 的研究 学校代码: 研究生学号: 上海海洋大学 硕士学位 嗜水气单胞茵鉴定、重组外膜蛋白的制备 及免疫原性研究 ?,英文题目:业: 水产养殖 专 水产动物遗传育种 研究方向: 刘明智 姓 名: 叶星研究员 指导教师: 二。一年六月八日上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明:我恪守学术道德,崇尚严谨学风。所呈交的学位论文, 是本人在导师的指导,独立进行研究:作所取得的成果。除文中已经明确注 明和引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作 品及成果的内容。论文为本人亲撰写,我对所写的内容负责,并完全意识到 本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名: ?嘲纺 口期:年易月 哆日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校 ? 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅或 借阅。本人授权上海海洋人学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文. 保密 ,在郴年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 口 恬 谝 指导教师签名: ? 密、 一: 学日 位期 嘴参日 保一、多, 篇 雠肿 日期矽?年占即日? ?上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 施志仪 上海海洋大学 教授 主席 梁旭方 暨南大学 教授 委员 中国水产科学研究 喻达辉 研究员 委员 院南海水产研究所 中科院南海海洋研 喻子牛 研究员 委员 究所 邹记兴 华南农业大学 教授 委员 全迎春 珠江水产研究所 助理研究员 秘书 .. 答辩地点 珠江水产研究所 答辩日期 ??上海海洋人学硕上学位论文 嗜水气单胞菌鉴定、重组外膜蛋白的制备及免疫原性研究 摘要 ? 是我国淡水养殖的“四大家鱼’’之一,一直以来 草鱼 是巾国人部分地区的主养品种,在我国农业经济中具有重要的意义。由于高密度 养殖以及水质环境的日益恶化,草鱼养殖过程病害的发生日趋严重,其中嗜水气 单胞菌所致的草鱼败血病是危害最大的细菌性疾病之一.本研究采用传统理化鉴 定与分子生物学鉴定方法,对患病草鱼的嗜水气单胞菌分离株进行分类鉴定, 并进行其毒力基因的鉴定。同时研制重组嗜水气单胞菌的外膜蛋白,为草鱼败血 病基因工程业单位疫荫的制备提供理论依据。 .草鱼噜水气单胞菌的分离与鉴定 本研究从患暴发性败血病的草鱼肝脏病灶处分离了株致病菌,分别命名为 ? 和,通过人工回归感染实验显示分离菌株能使草鱼致病死亡.对分离菌株 进行形态观察、选择性培养基培养和理化特性分析,初步判定所分离的株菌 均 为嗜水气单胞茼。进一步对菌株进行分子鉴定,结果显示株荫的 基因、促旋酶亚单位蛋白基因均与上的嗜水气单胞菌相应的基因 具有高度的同源性。在根据已知序列构建的分予系统进化树中株菌均与嗜水 气 单胞菌聚类。同时个菌株均可扩增到气溶素基因和丝氨酸蛋白酶基因 ,提示它们均町能为嗜水气单胞菌强毒株。 .嗜水气单胞菌毒力因子基因的分析 选取菌株,克隆该菌株的气溶素,基因和溶血素 ? ,基因,序列分析显示这二个基因只有.%的同源性。 分析显示,基凶与.卜已登录的序列具有较高的同源性,而 基冈与已髓录的基冈以及一些序列也具有较高的同源性。对与基 因同;性较高的这些序列进行结构域预测,发现它们均具有结构域和气 上海海洋大学硕士学位论文 溶素结构域,说明它们实际上虑是基因,只是命名上与基冈混淆。用 软件预测和的抗原区,显示它们均具有很好的抗原性。用特异 性引物检测菌株的基因和基因,结果显示二株毒力株均有特异条带, 而无毒株则未扩增到特异条带,说明和有可能作为鉴定嗜水气单胞菌 毒力菌株的标记。 .重组外膜蛋白的制备 以菌株基凶组作为模板扩增外膜蛋白基凶。基因全 长为,其中开放式阅读框为,与株的基 因的同源性高达.%。使用蛋白结构分析软件对该框编码的蛋白高级结构进 行预测,发现其编码的蛋白质具有一个由个折叠组成的结构域。根据序列 设计引物进行扩增,将不含信号肽的基因编码序列克隆到表达载体 中,转化至大肠杆菌,经诱导可表达分子量大小为.渤的带外膜蛋白与 标签的融合蛋白毽.。 .重组蛋白免疫原性与保护作用评价 融合蛋白.经过镍柱纯化后,对草鱼进行免疫实验。受免草鱼血清经您 分析显示呈现阳性反应,说明重组蛋白能诱导产生特异性抗体。采用实时荧 光定 量方法分析诱导前后草鱼头肾组织基凶表达水平的变化,结果显示免疫组 的表达量均高于空白组,低浓度免疫组的表达量显著高于空白组的., 说明所表达的融合蛋白可使草鱼产生良好的免疫应答并诱导产生高效抗体。 保护性实验显示,免疫组获得较高保护率%%。本研究结果显示嗜水气单 胞菌外膜蛋白基凶可作为草鱼嗜水气单胞菌疫苗的候选基因。 关键词:嗜水气单胞菌,鉴定,外膜蛋白基因,基因程表达,免疫原性,疫苗 上海海洋人学硕上学位论文,/// ?. , . 过 . . . . 彳/?饿 碱、倍 ? . . .吵 , , . . , , 彳. . 彳 曲 . 陀 . 上海海洋大学硕士学位论文 .. /.识. .%. 、? . 、? 【/, . 妙. . .. .以. ....%. ?上海海洋人学硕上学位论文 层 , . . . .. 忙 霉.?旧. / , 如.. .. . /. : , , , ??上海海洋人学硕上学位论文 目录 引言.....??.??.........................??....?.......? 嗜水气单胞菌与其致病性?. 嗜水气单胞菌的形态特征与培养特性? 嗜水气单胞菌的分类地位? 嗜水气单胞菌的血清型?.. ? 嗜水气单胞菌外毒素的研究进展.气溶素?. .溶血素?.. .细胞毒性肠毒素嗜水气单胞菌外膜蛋白的研究进展?. .外膜蚩白的简介.外膜蛋白的分类.外膜蛋白的免疫原性. 嗜水气单胞菌的检测??. .选择性培养基鉴别培养法.生化方法鉴定??. . 鉴定? 嗜水气单胞菌的免疫防治? .传统疫苗.. .亚单位疫苗. .基因工程疫苗??.. 本论文研究意义.. 第?章噜水气单胞菌的分离与鉴定?.........??....?...?......... 前言.. 材料与方法?.. .实验鱼? .供试宿主菌、质粒以及主要试剂??.. .引物设计与合成?. .细菌分离.上海海洋大学硕士学位论文 .细菌人工回归感染实验??. .选择性培养基鉴定试验??. .生理生化鉴定试验.. . ,,和基因的扩增与同源性分析。?. 结果与分析?.. .细菌分离与人工回归感染实验. .细菌形态特性?.. .细菌生理生化特性.. .基冈克隆与序列同源性分析? 讨论.. 第二章嗜水气单胞菌气溶素和溶血素基因的克隆与结构预测??.... 前言.. 材料与方法?.. .供试菌株、宿主菌和质粒?.. .主要试剂. .引物设计与合成?. . 和基因的扩增.嗜水气单胞菌强毒、弱毒与无毒株基因和基因片段扩增?.. .序列分析与结构预测 结果与分析?.. . 和基因的扩增与序列分析?.. . 和的系统进化分析.. . 和的抗原性预测?. . 和的结构域分析?. . 与基因毒力相关性分析??. 讨论? ? 第三章嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的表达及其免疫原性分析.前言.. 材料和方法?.. .供试菌株、宿主菌和质粒载体. 上海海洋人学硕上学位论文 .酶和试剂.??.. .引物设计与合成?. . 基因的克隆与序列分析? .重组质粒的构建?.. .融合蛋白在大肠杆菌的表达、纯化与检测? .融合蛋白的免疫与攻毒实验? . 测定抗体效价.??. .实时荧光定量检测草鱼 结果与分析?.. . 基因的克隆、序列与高级结构预测.. .重组表达载体的构建、表达纯化与检测.. .融合蛋白对草鱼的免疫保护作用.. . 检测草鱼血清抗体.实时荧光定量检测 水平?. 讨论.. ? 总结..............?..?..?.................................参考 文献?...............??.....?...??.....??.??. 附录常用试剂与缓冲液的配制?.. 附录缩略词表. 附录 载体图谱?. 附录在读期间发表文章.. 致 谢??. ? ×? ?‘上海海洋大学硕士学位论文 引 言 草鱼 属于鲤形/,鲤科. 雅罗鱼亚科,是我国淡水养殖的“四大家鱼”之一,一直以来是中国大 部分地区的主养品种。随着高密度养殖的迅速发展和水质污染的同益严重, 危害 养殖草鱼的各种疾病日趋严重,给草鱼养殖业造成了严重的经济损失。其中 暴发 性败血症是由细菌性病原引起,是目前草鱼养殖期间流行面积最广、流行季节最 长、危害最大的传染性疾病之一,研究显示引起草鱼暴发性败血症的病原菌为嗜 水气单胞菌】。对于嗜水气单胞菌的形态特性、分类地位、检测、毒力基因、和免 疫等方面,都有了较深入的研究。近年分子生物学技术的发展也极大地促进了嗜 水气单胞菌的研究,为防治草鱼暴发性败血病提供了更多的理论依据。 嗜水气单胞菌与其致病性 嗜水气单胞菌 钿普遍存在于淡水、海水、淤泥以及土壤 ? 中,一般认为是条件致病菌,可导致人和动物患病。近年来由嗜水气单胞菌引发 的动物疾病呈上升趋势。该菌是我国水生养殖动物暴发性疾病的主要病原,给多 种水生经济动物尤其鱼、虾和鳖等养殖业造成严重的经济损失。嗜水气单胞菌可 单独或与其它致病菌共同感染,引发人类的腹泻、肝脓肿、外伤性感染和败血症 等,已成为人兽共患病病原。 嗜水气单胞菌可导致草鱼败血症,感染了该菌的病鱼,发病初期病龟的上卜 颌、口腔、鳃盖、体侧和鳍条基部轻度充血,肠内有少量食物。严重病鱼体表充 血严重甚至血,眼眶周围发红充血而出现突眼现象,全身肌肉充血呈红色。肛 门红肿,腹部膨大,腹腔内有淡黄色透明或是血红色混浊的腹水,肝、脾、肾肿 胀,肠膜及肠壁充血,空肠,肠内充气且有大量粘液,部分鱼鳃器官色浅,呈贫 ? 血症状脚。潜伏后期,山现食欲减退、厌食等。严重时其发病牢可高达%,死 亡率可达%以上,我国水产养殖业每年因细菌性败血症蒙受严重经济损失。 嗜水气单胞菌的形态特征与培养特性 嗜水气单胞菌为革兰氏阴性短杆菌,单个或成对排列,直径...,菌体上海海洋大学硕士学位论文 长..。极端单生鞭毛,有动力,不产生芽孢,兼性厌氧。在普通琼脂半板 、 上形成的菌落形态为半透明灰白色、圆形,菌落直径. ,培养 增至 微凸、表面平滑湿润、边缘整齐。在营养肉汤中呈均匀混浊生长,表面有薄菌膜, 或旱环状,摇后即散。最适生长温度为。左右,半小时死亡。适合生长 为到。 嗜水气单胞菌的分类地位 嗜水气单胞菌气单胞菌科、气单胞菌属。气单胞菌属根据运动力情况可分为 两类:一类是嗜温性、有运动力的气单胞菌;另一类为嗜冷性、无运动力的气 单 胞菌。嗜水气单胞菌属第二类,在气单胞菌属中是最重要的,是气单胞菌的模 式 种【。 随着新的鉴定方法的出现,特别是分子生物学方法的快速发展,嗜水气单胞 菌种的分类地位几经变更。在年伯杰氏细菌鉴定手册’ 第七版中,嗜水气单胞菌隶属于假单胞菌科 。该科共有个种,包括液化气单胞菌“、嗜水 ? .和杀鲑气单胞请 气单胞菌.、斑点气单胞菌 .。年伯杰氏细菌鉴定手册第八版中,将气单胞菌属归。:弧菌科 中,包括个种和个亚种。年伯杰氏细菌鉴定手册第九版 中该科已发展为个种个亚种。年的伯杰氏系统细菌学于册第一版的分类。 学大纲, ,气单胞菌属己从弧菌科中分列出来,与海洋气单胞菌属 及属共同成立了气单胞菌科,共个属,个种或弧 种。目前将嗜水气单胞茼归属于气单胞芮科、气单胞芮属 .。 嗜水气单胞菌的血清型 由国际上知名的两个研究所荷兰国立公共健康和环境卫生研究院 和日本国立康复研究院完成了嗜水气单胞菌的系统分型。分 出了个。抗原血清型,分出了个。等又在的基础上增加 了个血清型,并得到、、、、是主要的血清型,其巾、、 上海海洋大学硕上学位论文 是人源分离株常见,而且毒力很强,、、主要对鱼致病】。研究显 示,国内方面的人源茵也主要是、、;而鱼源多为和。。 嗜水气单胞菌外毒素的研究进展 嗜水气单胞菌所产生的外毒素是重要的致病因子【。到目前为止已确定的外毒 素有气溶素、溶血素和细胞毒性肠毒素 等【.。 ? .气溶素 气溶素是气单胞茵属分泌的一种特有的毒素蛋白,具有溶 血性、肠毒性和细胞毒性,能够裂解宿主细胞,使细菌自身获得营养。气溶素以 无活性的可溶的二聚体前体形式分泌,前体毒素通过蛋白酶水解末端肽激活转 变成气溶素。气溶素中的结构域与靶细胞表面的特异性受体结合,促进聚合, 聚合之后气溶素转化成为插入的状态。插入的结果导致分散的细胞膜通道的产生, 使得红细胞的渗透压升高并最终裂解。气溶素基因是研究最为深入的嗜水气 单胞菌的毒力基冈之一.一等最早从嗜水气单胞菌中克隆了气溶素基因的全 ? 序列.;陈怀青等对其基因结构和功能进行了综述,该毒素南氨摹酸硇 组成,分子最为.?【羽.朱大玲等克隆了气溶素全序列,并进行了原核表达, 分析了气溶素抗原表位的分布,比较发现嗜水气单胞菌气溶素存在两处非常 保守 的区域,并在该保守区域设计气溶素通用引物检测气单胞菌属的毒力菌株【。 .溶血素 嗜水气单胞菌的溶血素/由溶血素基凶表达,该毒素埘宿 主的破坏力非常强,是嗜水气单胞菌霞要的毒力因子之一。【】等从罐装牛奶 中分离的彳勿动蝴菌株中克隆测序两个溶血素基因.和 .。前者有一长的,编码个’分子量为的热稳定 蛋白,分析氨基酸序列表明有一段高亲水性的.末端区域具有导肽特征。 ? 基因在不同的.钿/和.菌株中分布。而后者的核苷酸序列的 ,编码.的多肽,在.末端区域未发现导肽。.基因只在 原菌株中检测到,两溶血素基因的相似性非常低,与和 克隆的气溶素基因的相似性也非常低。因.与霍乱弧菌的毒素相似性 上海海洋人学硕上学位论文 比较高,而定名。等对两溶血性基因和测序,其中的 的长度为,编码个氨基酸。使两基因中的任何一个失活,只能减 弱但不能使溶血性和细胞毒性消失,只有当两个基因同时失活,活性才消失。 该 结果表明嗜水气单胞菌.. 的溶血性和细胞毒性是由和共 同作用的结果。等对临床和环境其中包括鱼源中的.进 行研究,%菌株呈阳性,%菌株呈阳性,所有的毒力. ? 菌株是和阳性?。大多数的气单胞菌毒力株至少有两种溶血性毒素, 与菌株的来源无关。和被认为是判断嗜水气单胞菌是否具有毒力的重 要指标。 .细胞毒性肠毒素 具有溶血性、细胞毒性和肠毒性 细胞毒性肠毒素 种生物学活性。具有这三种活性的毒素首先由等从嗜水气单胞菌中提取【, 随后等对细胞毒性肠毒素的基因进行克隆、表达和序列分析:通过缺失突 变分析、抗肽抗体和点突变方法分析了细胞毒性肠毒素中某些氨基酸的生物 学功 能;用、和载体系统高效表达细胞毒性肠毒素,再经转座.了与等 位基因突变证明细胞毒性肠毒素基因与致病性直接相关【?。细胞毒性肠毒 素是与 气溶素相似的蛋白质,分子量为。此外,细胞毒性肠毒素与气溶素的核苷酸 和氨基酸序列有非常高的同源性,但是气溶素没有肠毒素的功能。 综上所述三种毒素均具有相似的性质,都具有溶血性、肠毒性、细胞毒性。 气溶素和细胞性肠毒素均为分子量为左右的单一多肽。有学者认为两者是 株的细胞毒肠毒 不同菌株产生的相似毒素【.等报道. 素基因与气单胞菌的气溶素基因有~.%的同源性,可能囚为种问差异,导致 基因水平和毒素性质有所不同阅。 嗜水气单胞茵外膜蛋白的研究进展 .外膜蛋白的简介 外膜 是革兰氏阴性菌细胞壁巾的特有结构,位于细菌胞浆 膜和肽聚糖的外侧,包围整个细菌,足典型的非对称双层结构,由脂质双层、 微 孔蛋白、脂蛋白、脂多糖等组成。外膜蛋白是革兰氏阴性菌外膜的主要结构, 在细 上海海洋大学硕士学位论文 菌的物质运输、形态的维持和有关物质合成方面起着重要的作用【】。图. 是革兰 氏阴性菌细胞壁结构示意图。 叶 ? ? 图.革兰氏阴性菌细胞壁结构图片摘自 . .外膜蛋白的分类 已报道的外膜蛋白有外膜蛋白、微孔蛋白、脂蛋白 等。外膜蛋白是一类跨膜蛋白,其分子量为~是外膜蛋白 结构中的主要外膜蛋白,在维持细胞膜结构上具有重要作用。经加热 ?再经时,其泳动速度明显减慢,这是因为含有丰富的.折叠结构,在 自然情况下不形成对抵抗的寡聚体,加热时分子构象改变,导致 不对称性增加,故又称热修饰蛋白【】。 微孔蛋白,又称通道蛋白、基质蛋白。它不具有热修饰性,以非共价键与肽 聚糖紧密结合,可形成相对非特异性的通道或透道,具有通透特性。按其功能不 同分为类:第一类为普通外膜主要微孔蛋白,,等,可形 成亲水性孔道.允许非特异性水溶性物质的被动扩散;该类蛋白允许水溶性物质 特别是阳离子溶剂的渗透,并能为聚磷酸所识别;第二类包括、和 上海海洋大学硕士学位论文 ,该类蛋白允许小分子水溶性物质渗入,能被麦芽糖和麦芽糖糊精所识 别;第三类微孔蛋白能摄取介质中含量较低的大分子物质,该类微孔蛋白与被运 输的底物有高度亲和力,本身也参加催化反应。微孔蛋白缺乏的突变株已被证实 可允许营养物质,抗菌素及抑制剂扩散入细胞。 脂蛋白为细菌外膜蛋白中含量最多的结构蛋白,由个氨基酸组成,分子量 约为.,具有高度的叶螺旋结构,分子间可发生交联并形成寡聚体。脂蛋白可 通过个脂肪酸与细菌外膜疏水结合,不暴露在细胞表面,因此脂蛋白不具有噬菌 体与大肠菌素的受体功能。脂蛋白结构基因突变株虽能允许小分子量亲水性分子 通过外膜,但这种突变株细胞壁不稳定,外膜成份可以小泡形式释放出来。故脂 蛋白除作为一种结构蛋白外,不具稳定细菌外膜的功能。 此外还有些微量蛋白,在细胞中含量低却具有重要的生理功能。大部分参与 特异性扩散过程,与细胞生长密切相关。有些酶分布于外膜上,这些酶包括磷脂 酶及蛋白酶。 .外膜蛋白的免疫原性 ? 研究表明细菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性,不仅可以激发机体的体液免 疫,而且还可引起细胞免疫,而且外膜蛋白具有异种血清型的免疫交叉保护性, 是一种潜在的共同保护性抗原。蒋蔚等表达纯化了外膜蛋白免疫 兔子所得血清与株不同血清型的嗜水气单胞菌在 反应中能起较强反 应【】,说明外膜蛋白有很好的免疫原性,并可能是嗜水气单胞菌的共同保护抗原. 等表达纯化了外膜蛋了,通过对印度鲤的免疫试验发现,所得 血清效价达到:,说明外膜蛋白能对鱼体起到很强的免疫作用。董传甫等 天然提取了嗜水气单胞菌的主要外膜蛋白?通过免疫鱼后的攻毒实验发 现,各免疫组免疫保护率都在%以上,说明嗜水气单胞菌的外膜蛋白是重要的保 护性抗原】。等从嗜水气单胞菌菌株中克隆表达并纯化,通过免疫 兔子发现能产生很高效价的抗体,抗体能识别包括.菌株在内的多株不同血清型 的嗜水气单胞菌。等从鲮鱼病灶处分离了嗜水气单胞菌并从中首次克隆了 嗜水气单胞菌基因,对其在气单胞菌属种的分布进行了研究,并且进行了 免疫试验,免疫的兔血清出有能与嗜水气单胞菌结合的高效抗体。 上海海洋人学硕上学位论文 嗜水气单胞菌的检测 嗜水气单胞菌的检测方法很多,包括传统方法与分子生物学方法,主要有生 化方法检测、选择性培养基检测、免疫学方法检测、检测法,核酸探针技术 等。 .选择性培养基鉴别培养法 ? 选择性培养基鉴别培养法是利用不同培养基成分和培养条件,抑制多数细菌 生长,只利于某一种或某一类细菌生长的检测方法。选择性培养基制作容易,使 用方便是常规的细菌诊断方法之一。目前用于分离水中及食品中的气单胞荫的选 择培养基种类较多,主要以培养细菌颜色变化加以区别【柏,这种方法简单实 片. 但使用选择培养基时温度和时间要求较严格,培养时间较长,且只能用于初步判 断。常用有培养基,和使用培养摹检测腐皮病病原?培养 后,嗜水气单胞菌菌落呈黄色,其它菌落呈其他的颜色【.】。 .生化方法鉴定 生化鉴定包括生化鉴定管和细菌自动签定仪鉴定。主要根据伯杰氏细菌貉定 手册第九版记载的嗜水气单胞菌的主要理化特性进行分类鉴定。将嗜水气单胞 菌分成两个生物型,型反应,葡萄糖产酸;型反应?,葡萄糖不 产酸。型的毒力大,可使人、鱼、蛙、蛇等致病。陆承甲等【】认为鉴定嗜水气单 胞菌的主要理化特性为:的短杆菌,有运动力氧化酶,葡萄糖产酸产气,对新牛 霉素或弧菌抑制剂/不敏感,发酵甘露醇、阿拉伯糖、水杨侍、蔗糖,试 验,赖氨酸脱羧”,精氨酸双水解,鸟氨酸脱羧,抗氨苄青霉素。王 增福等通过试验补充了几项生化项:氧化酶【,/试验发酵型,吲哚试验, 精氨酸双水解,赖氨酸脱羧,水解七叶灵产牛褐色素,产牛:,发酵葡绚糖 产酸产气,发酵果糖、蔗糖、麦芽糖, 试验,不发酵肌醇,硝酸盐还原, 尿素酶。 ? . 鉴定 是年代巾期发展起来的一项分子生物学技术,被广泛应用于细菌的诊断 上,可使病原菌的鉴定更快速、更准确。靶基因生要分为两类,即非蚩白编码基因 与蛋白编码基因。榆测法以核苷酸序列为基础,要求选抒合适的靶基因进钆:比 上海海洋人学硕上学位论文 较分析。目前用于嗜水气单胞菌签定的靶基因主要有 和等,用于鉴别 嗜水气单胞荫毒力的基因有气溶素基因、丝氨酸蛋白酶基因和溶血素基因等。 .. 基因 细菌 基因核酸序列具有高度的保守性, 由于 大小适中, 约.左右。不同科、属、种间具有一定的变异性,基冈序列中存在.个变异 区分布在保守区间。因此可在序列保守区内设计通用引物进行变异区的扩增,以快 ? 速鉴定不同细菌【,,或直接利用变异区设计引物通过有或无的结果直接判断,如 储卫华等设计了特异性引物只有嗜水气单胞菌可有扩增条带,而其他气单 胞菌则无扩增带【】。 另外,也可利用 基因和嗜水气单胞菌的其他基因进行多重检测。 增强特异性。比如任燕等采用 与嗜水气单胞菌的气溶素基凶多重的 检测方法,提高了准确性【町。 ..促旋酶基因 基因相比具 基因是编码促旋酶亚单位蛋白的基因之一,与 有较高的替换率,且遗传密码予由于兼并性发生的碱基替换通常并不改变编码的 氨基酸,因此该基因适合亲缘关系较近的菌种的鉴别。同时该基因序列长约.~ . ,包含可变区和保守区,利用通用引物可以从较大范围细菌谱中扩增获得此 基因.。越来越多的研究证明了该基凶序列在区分和鉴定细菌近缘种方面比非 蛋白编码基因 具有较强的优势。等分析了株气单胞菌的 基因序列,结果表明该属可与霍乱弧诸、人肠杆菌以及志贺邻单胞荫区分开来, 其种间序列相似率为./%,碱基替换速度足 的倍。 嗜水气单胞菌的免疫防治 嗜水气单胞菌世纪年代末引发暴发性败血病导致大面积养殖鱼类死产. 至今该菌仍危害着水产养殖业。化学药物和抗生素对该菌引发的病害可有一 定的 ? 控制,但化学药物对环境带来的负皿影响以及抗牛素的耐药性问题给人类社会带 来威胁。因此开发高效、安全的疫苗进行免疫防治是对付该病害的关键途径之一. .传统疫苗 嗜水气单胞菌的传统疫苗主要包括灭活茁和弱毒苗。灭活苗是指利用某种方 上海海洋人学顾上学位论文 式灭活烈性野生病原的感染性,但保留其免疫原性而制备的疫苗。灭活疫苗的制 备方法是通过细胞或生物接种,大量扩增和收集病原体,然后以物理或化学方法, 在确保免疫活力的情况下,将病原灭活。常用疫苗大都属于灭活疫苗,灭活苗制 备简单,成本低廉,但成分复杂,对鱼体生理有较大影响;弱毒疫荫是指用致病 性己大为减弱的菌株或变异的弱毒株制备的疫苗。它有类似于自然感染形成免疫 能力的优点,有较好的免疫原性,且免疫剂量小,免疫持续期长,但存在回复突 ? 变而引起疾病的缺点。用致病性的嗜水气单胞菌火活制成疫苗分别以浸泡和注射 的方式免疫鲫鱼后,注射的保护率为%’浸泡的免疫率为%。用福尔马林直接 灭活嗜水气单胞菌免疫异育银鲫可得到.%的免疫保护率【。用嗜水气单胞菌溶 血素缺失突变株活菌免疫印度鲤鱼,免疫组对同种菌的攻击保护率在%以上, 对不同菌攻击的交叉免疫保护率在%左右【。 .亚单位疫苗 亚单位疫苗是通过提取病原菌的某些成分而制成的疫苗,其优点是除去了病 原核酸,安全性好,同时去除一些不能产生保护性免疫的抗原,避免抗原间的竞 争,提高免疫效果。因此具有接种剂量小、免疫原性强的优点。蕈传甫等制备了 嗜水气单胞菌主要外膜蛋白免疫刺激复合物亚单位疫苗,腹腔注射免 疫欧洲鳗鲡,结果表明对倍半致死剂量的攻击的免疫保护率为%以上,只.没 有明显的血清型特异性。沈智华等比较了不一菌株毒素荫埘不同来源、不 同血清型嗜水气单胞菌的免疫保护率,认为其中一种菌株.的毒素苗小仅对 同型菌而且对异型菌株的攻击有较高的免疫保护作用.等证实经嗜水气 单胞菌主要外膜蛋白免疫的金鱼能够耐受较高剂最同源菌株的攻击。虽然亚单 位疫苗在实验室取得较好的免疫效果,但提取工艺复杂,成本较高,推“应用有 一定的难度。 .基因工程疫苗 ? 随着现代分子生物学技术的兴起,特另是重组技术的现,为疫苘的研 制提供了新的方法。目前利用基冈程技术研制的新型疫苗主要有基冈程弧单 位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗等,这些疫苗统称为基因工程疫苗或 重组疫苗。基因工程疫苗只含病原的部分成份,安全性好。与传统的疫苗相比, 基凶工程生产成本较低,易大批量生产。司时由于基凶工程疫苗只含有病原的一 上海海洋大学硕上学位论文 部分蛋白成份易于区分感染鱼类和免疫鱼类、利用活载体可研制多价疫苗。 ..基因工程亚单位疫苗 基因工程亚单位疫苗是指利用重组技术,将病原的保护性抗原基因在不 同的表达系统中体外表达,生产能诱导机体产生保护性免疫反应的病原蛋白质, 再经分离纯化而制备的疫苗。基因程?单位疫苗除了具有传统?单位疫苗的优 点外,还有制备简单、成木较低等优点。 ? 嗜水气单胞菌的基因工程亚单位疫荫方而已有相关研究报道,但未见嗜水气 单胞菌基因工程亚单位疫苗的商业化应用。谢俊锋等用嗜水气单胞菌外膜蛋白 基因在大肠杆菌中表达,表达产物稳定且表达量高达%,具有原外膜蛋 白的免疫原性【】。叶巧真等用大肠杆菌表达温和气单胞菌的部分细胞毒肠毒素基 因片段,表达产物免疫中华鳌,对嗜水气单胞菌有较好的交叉免疫保护作用【】. 何鸣筱等将去除部分毒性活性编码区的细胞毒性肠毒素基因与去除信号肽 的外膜蛋白基因在原核中高效表达,重组融合蛋白保留了外毒素和外 膜蛋白的反应原性,为进一步研究融合蛋白作为多联重组亚单位疫苗候选提供理 论依据【,】。但未见嗜水气单胞菌基因工程亚单位疫苗的商业化应用。 .. 疫苗 疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗,是由等于年首次提出。它是 指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内,使外源基凶 在活体内表达,诱导宿主产生对抗原蛋白的免疫应答,以达到预防和治疗疾病的 目的。与常规疫苗相比,核酸疫苗通过宿主细胞表达目的抗原,蛋白表达时间较 长,既可诱导体液免疫也可诱导细胞免疫。单一剂景的核酸疫苗即可激发长 时间 的免疫,且其免疫原性单一,只有抗原基因被导入细胞中表达,载体本身没有免 疫原性。 近年来鱼类疫苗的研究已取得进展。跫等针对病毒蛋 白构建的疫苗能够诱导%的虹鳟产生较高水甲的免疫保护性即。编码细菌 病原彳外膜蛋白和基冈的疫苗,用于免疫斑点鲈鱼 疫苗后和周 ?锄勉船删彤堋饿删,肌肉注射单一的和 后检测,与对照组比较发现血清抗体水平有显著提高,对/.腹腔注射攻毒 后的存活率也得到提高%。 上海海洋人学硕上学位论文 疫苗易于制备、稳定性高、具有高效性。但也存在缺陷,前为止, 疫苗的接种多采用肌肉注射,这种方法耗时费力,在实际生产应用中具有一。定的 局限性。 ..基因缺失活疫苗 基因缺失活疫苗是将病原体致病力相关的基因删除后构建的活疫苗。其优点 是接种后可在活体内增殖,由于其接种过程与自然的感染过程相似,可刺激机体 ? 产生长期的中和抗体以及诱导良好的细胞介导应答,一次接种后即可产生较 好的 免疫。储卫华等用转座子将嗜水气单胞菌的蛋白酶缺失后,发现其毒力下降,能 够使鲫鱼产生一定的保护力。等将杀鲑单胞菌的基因删除构建了 减毒活疫苗.等将斑点叉尾鲴病毒的基因中删除一段 的序列,成功构建了减毒株。但是减毒活疫苗可能保留部分毒性,是否会 对鱼类造成危害需进一步研究。 本论文研究意义 草鱼是我国晕要的淡水鱼类养殖品种,是全国也是,“东省最大宗的养殖品 ? 种。由于高密度养殖以及水质环境的日益恶化,草鱼养殖过程病害的发生日趋严 重,其中嗜水气单胞菌所敛的草鱼败血病足危害最大的细菌性疾病之一.快速准 确鉴定嗜水气单胞茵是防治该病的重要前提。本研究采用传统理化鉴定方法与分 子生物学鉴定方法,对患病草鱼的嗜水气单胞菌分离株进行分类鉴定,并进行其 毒力基因的鉴定。同时本研究选用外膜蛋白基因进行嗜水气单胞菌的基因 工程亚单位疫莆的研究,为有效预防嗜水气单胞菌所致的草鱼败血病奠定基础。 ?上海海洋大学硕上学位论文 第一章嗜水气单胞菌的分离与鉴定 前言 嗜水气单胞菌广泛存在于水环境中,其养殖过程极易引发鱼类败血病,可导致 草鱼等经济鱼种大量死亡,给水产养殖业带来巨大损失。该菌可通过饵料,水源, ? 外伤等各种途径在鱼群中“泛传播,冈此极易大规模暴发流行,且难以彻底控制 或治愈,严重时可导致草鱼人批量死亡。因此建立快速、准确地鉴别嗜水气单胞 菌方法称为预防草鱼败血病的重要前提。 本研究从患出血病的草鱼病灶处分离了两株病菌,通过对其进行生理生化鉴 定和分子鉴定,建立了快速准确鉴定嗜水气单胞菌毒力株的方法,为防治草鱼败 血病提供了理论依据。 材料与方法 .实验鱼 取自,“东省江门市、福建省龙岩市养殖场的患典型出血病病鱼,体重 ,症状:腔、肌肉严重充血,肠道充血成紫红色并伴有腹水,眼睛四周充 血突出。供感染的试验鱼为本所培育的健康草鱼,规格。 .供试宿主菌、质粒以及主要试剂 ..所需的主要试剂 嗜水气单胞菌无毒对照菌,为木实验分离、人工感染不致病的嗜水气单胞 菌菌株;大肠杆菌 宿主菌由本实验室保藏:克隆用质粒是惫嵋 ,购自公司:提取试剂盒... ;质粒提取试剂盒... 和胶回收试剂盒... . 为美公司产品;时增试剂盒憎 ? 购白宝生物大连工程有限公司。 ..所需的缓冲液 上海海洋人学硕上学《:论文 电泳缓冲液.: 茜 眦 .. 上样缓冲液: ? 溴酚兰 . 型匍聚糖 二甲苯青 . ..所需的培养基 液体培养基 胰蛋白胨 . . 酵母提取物 . 蒸馏水 ? / 上述试剂溶解混匀,用 调节.。然后分装、高压灭菌 ,常温保存。 固体培养基 在液体培养基中加入琼脂粉 /,高雎灭菌,待温度降 至时,在无菌工作台上,加入终浓度为/,摇匀后立即将其倒 入预先灭菌的培养皿中铺平,培养基厚度。隔夜后用保鲜膜包好,置 冰箱保存备用。 普通琼脂培养基 蛋白胨 . . ? 牛肉膏粉 . 琼脂 . 蒸馏水 上述试剂溶解混匀,用溶解至。调节.。高压灭菌 ? 上海海洋人学硕士学位论文 待温度降至时,在无菌工作台上,加入终浓度为/,摇匀后立 即将其倒入预先灭菌的培养皿中铺平,培养基厚度。隔夜后用保鲜膜包好, 置冰箱保存备用。 同体培养基 盐酸鸟氨酸 . 盐酸赖氨酸 . ? 硫代硫酸钠 . 枸橼酸 . 脱氧胆酸钠 . . 酵母提取液 . 新生霉素 . 溴麝香草酚蓝 . 琼脂 . 上述试剂溶解混匀,用溶解至, 调节.。高压灭菌,待温 度降至?时,在无菌工作台上,入终浓度为./,摇匀后立即将其 倒入预先火菌的培养皿中铺平,培养基厚度~。隔夜后用保鲜膜包好,置? 冰箱保存备用。 .引物设计与合成 根据卜已登陆的基因序列保守区设计引物表.扩增基因使 用引物和;扩增 基因使用和;扩增基凶使用引物和;扩 增气溶素基因使用引物和。引物由上海生工生物技术有限公司合成。 .细菌分离 在广东、福建畴省各取尾病鱼,以无菌操作直接从肝脏组织取样在普通琼 一 脂半板上划线分离,培养 ,挑取生长占优势的单个菌落进行纯化培养, 纯化出株茼分别命名为、,培养后的细菌做革兰氏染色在显微镜下观 察其形态。 上海海洋人学硕上学位论文 州 . ? .细菌人工回归感染实验 离心收集培养的菌体,经.%无菌生理盐水洗涤并配制成细菌恳液。 / %/、 /、 /和 个 人工浸泡感染实验设 菌液浓度.每组尾,浸泡后移置另一水族箱巾饲养。 / 人工注射感染实验设 /、 /、 /和 个博液浓度,腹腔注射健康草鱼。每尾注射.,每组尾。对照组注射等量 ? 的无菌牛理盐水。实验期间水温?,每人观察及实验鱼的症状和死亡 情况,连续观察。 重复分离和感染试验:将从上述人工感染出现有明显症状的病鱼巾再次分离 菌株,重复.:述感染试验,方法同.卜。 .选择性培养基鉴定试验 将分离的细菌和木实验室保藏人肠杆诸在 培养 基上进行划线,划线后?培养观察结果。 .生理生化鉴定试验 将分离纯化后的细菌?培养,根据伯杰细菌鉴定手册;用细菌牛化微 ? 量鉴定管和 自动细菌鉴定仪 试剂条进行测定法国 公司鉴定细菌。 . 基因的扩增与同源性分析。 ..细菌基因组的提取 将纯化的、菌株与嗜水气单胞菌对照菌接种十营养肉汤培养基,摇床 上海海洋大学硕士学位论文 。过夜培养, /离心 收集菌体。使用试剂盒公司并按其操作说明提取细菌基 因组。具体 方法如下: 取约..的菌液,离心为分钟,尽量吸尽上清。 在细菌沉淀中加入 舵和 溶液,振荡悬 浮秒,彻底混匀,?温浴分钟。 ? 和 ,震荡混匀秒于 加入的结合液 的 ?水浴分钟对于革兰氏阳性菌延长至分钟,期间间歇混匀几次. 加入异丙醇,颠倒次,振荡秒,充分混匀. 将混合液转移到一个已经套入收集管的吸附柱内, 离心分钟。弃 去收集管中的废液,将吸附柱放入同一收集管中。 加沈涤液 ’于离,秒,倒掉收集管 巾的废液,将吸附柱放入同一收集管中。 加入洗涤液 于离,秒,倒掉收集 管中的废液,将吸附柱放入同一收集管中。 重复步骤。 ‘:空柱离心分钟。 吸附柱放入一个干净的.离心管中,室温放置.分钟以确保乙醇完全 挥发干净 ,室温 在吸附柱的膜中央小心加..“经?预热的 静置.分钟,离心分钟得到洗脱液。将洗脱液再加入吸附柱中, 室温放置分钟后,离心分钟重复洗脱一次,即可得到高质量的 细荫基因组.于?保存。 .. ,和基因的扩增 根据上已登陆的 ,和基因的序列保守区设 计引物。引物由上海生工生物技术有限公司合成引物序列见表。 基因,使用引物和 分别以、菌株基因组为模板扩增 ? .体系为: ..,.,上游引物., 下游引物.,模扳., 聚合酶.。扩增条件为:预变性 后进入循环,?变性,退火,?延伸,共个循环,最后一个 循环结束时?延伸,产物?保存。 ? 一?上海海洋人学硕上学位论文 一个 柱子最多可容纳的溶液,如果琼脂糖混合 物的体积大于,可先转移溶液至柱子,离心完后,将余下的 溶液继续加上柱子上。但是每一个柱子最多可以结合 。如果预期产量较大,则把样品分别加到合适数目的柱中。 至 柱子 将柱子重新套回收集管中,加 中;室温下,,×离心,完全去除滤出液。 至 将柱子重新套回收集管中,加入 柱子中,室温下,,×离心,去弃滤出液。至 将柱了重新套回收集管中,重复加入? 柱子中,室温下,,离心,去弃滤出液:弃去液体,将 牢柱子重新套回收集管中,,离心以甩干柱基质残余的液体. 把柱子装在一‘个干净的.离心管上,加入洗脱液或灭菌水 上柱子膜上,,离心,离心管中的溶液就是纯化的产物。 保存于?。 用%琼脂糖凝胶电泳检测回收产物。 ...大肠杆菌感受态制备 用接种环从. 菌平板.卜挑取单克隆菌落,接种于装有 液体培养基的试管巾,? 振荡培养过夜。 过夜菌液接种到装有 液体培养基三角瓶中,?, 取. 振荡培养~,隔~测量值,至值为.~.. 无菌条件下将细菌转至.离心管中,每管菌液,按需要决定管 数。 ?, ,以收集细菌。 ,离心 弃上清液,倒置离心管于滤纸上,使残留的痕量培养液流尽。每管加 冰预冷的./ 悬浮细胞,冰浴 。 。 ?, , 冰预冷的. / 弁上清液。每管加 重悬细胞,即成感受 态细胞悬浮液,放置冰上后即可使用。 ? ...目的基因的连接 扩增的产物,其双链前后末端都有一个游离 末端游离的碱基互补形成环状重组质粒. 的碱基,可以与. 连接,反应产物混匀后于 按载体说明书进行胶回收产物与. 上海海洋人学硕上学位论文 下连接。体系如下: 成分 体积此 . . 线性化载体 胶回收产物 共 ...目的基因的转化 加入感受态细胞悬液 到连接产物中. 轻轻旋转离心管以混匀内容物,冰浴,促进分子在感受态细 ’ 胞农皿的吸附。 转入?水浴,通过热刺激增强的作用,使细胞膜产生通道. 便于分子的吸附进入,提高转化率。 迅速转入冰上冷却,修复细胞膜。 无抗生素的液体培养基,摇匀后于?, 加 ,振荡培 养。 取 菌液涂在含的平板,恒温培养箱培养,平 ? 板先平置至液体被吸收,再倒置培养~后观察结果.注: 其余菌液保存于。若平板上没有长出菌落,可将之置于?恒温培养 箱继续培养,同时将剩下的 荫液离心,倒掉大部分上清,留 左右,用移液器吹打晕悬,再全部涂于含的平板上,置? 培养。 观察并记录转化子出现的数目,计算转化率。 阳性重组质粒由广州英骏牛物技术公司测序。测序结果用分析软件.和上的 程序进行分析比较。 ...小量制备质粒 . 按照. 试剂盒提供的说明书操作,步骤如下: 挑取十余个白色菌落和个蓝色菌落,接种于含浓度为/的液体培养基中,,振 荡培养过夜。并将菌落 存对应的含平板上划线,?倒置培养过夜,冰箱保存。将 衍液转入.离心管中,,离心,弃上清液。 用己加入的 悬浮细菌沉淀,震荡使细菌充分均匀 分敞。 上海海洋人学硕上学位论文 加 ,温和并充分地上下翻转混合.次使菌体充分裂解。 直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过。 加入 ,温和并充分地上下翻转混合次,,离 心。 吸取步骤中的离心上清并转移到制备管置于离心管中。 离心,弃滤液。 将制备管置回离心管,加 ,离心,弃滤液。 将制备管置回离心管,加 ,离心,弃滤液. 重复步骤。 将制备管置回离心管,离心。 将制备管移入新的.离心管中,在制备膜正中央加.去 离子水,室温静置。离心。 ...序列分析 .和上的程序进行 测序结果用分析软件 分析比较及系统进化树的构建。 结果与分析 .细菌分离与人工回归感染实验 从病鱼样品中共分离出个菌株,分别进行人工注射感染试验,其中歪 和菌株感染浓度为×和×时,均导致草鱼在内%死亡. 浸泡感染感染浓度在×和×时则在内%死亡.主要症状表现为 肌肉和内脏充血并糜烂,肠道充血,有腹水。从感染死亡的草鱼体内再次分离出 二个荫株,分别命名为和,进行感染试验,获得与和类似 的感染结果,空白对照组鱼均健康存活袭,表 .细菌形态特性 和菌株在普通营养琼脂甲板?恒温培养 ,其菌落均为圆形, . 中央隆起,半透明,呈灰白色,表面光滑,边缘整齐,直径为. 。在血 ? 液琼脂平板上显示溶血圈。经革兰氏染色。两株菌株均为阴性。将分离的两株菌 株与大肠杆菌分别划线于鉴别培养基?培养,分离菌株菌落呈黄色无黑 心,再培养分离菌株菌落呈深绿色【柚。 .细菌生理生化特性 生理生化测定显示。和两株菌的最适生长温度为??,生长适上海海洋人学硕上学位论文 宜范围.。两株菌均为葡萄糖产酸产气:阿拉伯糖、蔗糖、水杨苷和. 阳性:氧化酶、精氨酸双水解酶和赖氨酸脱羧酶阳性:鸟氨酸脱羧酶阴性:弧菌抑制 剂/不敏感表。根据伯杰氏细菌鉴定手册第九版,判定犯和 属气单胞菌科/、气单胞菌属的嗜水气单胞菌 。 衰曹株人工浸泡感染草鱼 ? :菌液感染浓度/ 龋株 空对 嗡日 。的。 淼而广鬻净竿黑卜丽广?‰ 夕‘数/总数尾 / / / / / 荻好 弱 死、:牢% 死’:数,总数尾 猢 蚴 蝴 / ? 啪 柏 死’:牢% 死’:数,总数尾 撇 呦 脚/ ? ? ? 死产率% 死数/总数【尾 螂 蚴 陀 撇厅 ? ?, ? 啪 够 如 夕匕亡率% 衰曹株人工注射感染草鱼 兰坠;丝苎塑 丝绝壁垒垒坠坚苎宝壅巴璺虫.醴受翌垒丝邑 死’:数,总数尾 啷 忍 / 忍 改 ,。 岱 ? 啪 ? 笱 死’:牢%哺 死’:数,总数尾 眈 啷 零 锄 岫 / ?伊 ,. 临 死’:牢% ? 的 加 死’:数,总数尾 枷 啷 呦?/ ,. 塔 ? 啪 鲐 加 死’:牢% 死’:数,总数尾 蚴眈 蝴 瑚 ,.触/ ? 啪 如死’:牢%上海海洋大学硕上学位论文 表.两株菌株的生理生化特性 戡堋 菌 阳锄‘ 嬲帅 嬲。帅排产徽证目压。岍嗜水芎胞菌 压岍一二.../ 葡萄糖产酸 氧化酶 . . . , 葡萄糖产气 西蒙氏枸橼 ?. 酸盐一??? 鸟氨酸脱羧酶 甘露醇一 一 一 精氨酸双水解酶 阿拉伯糖醇 赖氨酸脱羧酶 肌醇 羽蔗糖 ?? 醇 已 侧金慧 阿拉伯糖 水杨苷纤维?糖 七叶苷 . 陆 蛐豳 海藻糖 , . 乎 . 麦芽糖 伪己 鼠牟糖 吲哚产生 ?一 豫 一 / 一 一 一 溶血 注:“一”为阴性反应;“”为阳性反应;“,’为嘟血;“,’为种问存在差异 :“一’’哪;“’ ;“矿 ;‘‘” ; .基因克隆与序列同源性分析 瓦和菌株间基因序列具有很高同源性,所得 基因、基上海洋人学硕上学《:论文 因、基因和基因序列的同源性分别为.%、.%、.%和%. 见表.。用分析结果显示两菌 基因序列均已登录 株的 基因与已登录的嗜水气单胞菌的同源性高于.%,与同 属的气单胞菌的同源性均高于.%’且与大肠杆菌五?‖的也高达.%。两 菌株的基因与登录的嗜水气单胞菌的同源性高于.%’与同属的 ? 气单胞菌司源性高于.%,且与属外菌的同源性较低,如与.分别为.% 和.%。菌株均可扩增到基冈和基因,对照菌株无毒株的二个 基因的扩增均没有特异性条带图.。 基因序列与已登录的其它 根据及、菌株和 嗜水气单胞菌序列分别建立系统进化树,结果显示两个菌株均与嗜水气单胞 茵聚 类。图一是根据基因序列建立的系统进化树。 ? ? 一 ?一 ? ? 图.分离菌株基因的扩增 : ;一:茸株.和对照茸株 ? ? . : . ;’: