华中农业大生物化学题库（附详细答案）05 第5章 核酸化学

第5章 核酸化学 1、 学大纲基本要求 DNA、RNA的结构和性质以及研究技术。核酸的化学结构，碱基、核苷、核苷酸，DNA的结构,DNA的一级结构, DNA的二级结构, DNA结构的不均一性和多形性, 环状DNA, 染色体的结构。RNA的结构, RNA的类型和结构特点,tRNA的结构和功能, mRNA的结构和功能, rRNA的结构和功能。核酸的性质, 解离性质, 水解性质, 光吸收性质, 沉降特性,变性、复性及杂交。核酸研究技术,核酸的分离纯化,限制性核酸内切酶,DNA物理图谱,分子杂交,DNA序列分析,DNA的化学合成，DNA聚合酶链式反应—PCR。 二、 本章知识要点 (一) 核酸的化学组成 1．元素组成 核酸分子主要由碳、氢、氧、氮和磷等元素组成。与蛋白质相比较，核酸的元素组成中一般不含有硫，而磷的含量较为稳定，占核酸9％～10％。可通过测定磷含量来估计样品中核酸的含量。 2．物质组成 核酸在核酸酶的作用下水解为核苷酸，核苷酸完全水解可释放出等摩尔量的含N碱(碱基Base)、戊糖和磷酸。因此构成核酸的物质成分有三类：包括磷酸、戊糖和碱基。戊糖可分为核糖和脱氧核糖，碱基又分为嘌呤碱和嘧啶碱两类，DNA中的戊糖和碱基与RNA有所不同。 DNA分子中的戊糖是β-D-2-脱氧核糖,RNA中的戊糖是β-D-核糖。 DNA分子中存在的碱基主要有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。 RNA分子中除含有A，G，C外，还含有尿嘧啶(U)，而不含有T。因此，DNA和RNA的碱基组成上，嘧啶的组成有所不同。在DNA和RNA分子中尚含有少量的不常见的其他碱基，称为稀有碱基，它们大多数是常见碱基的甲基化衍生物。 3．核酸的基本单位——核苷酸 组成DNA的核苷酸(nucleotide)称为脱氧核糖核苷酸，组成RNA的核苷酸称为核糖核苷酸。核苷酸则是由磷酸、戊糖、碱基组成。碱基和核糖或脱氧核糖之间脱水通过糖苷键(glycosidic bond)缩合形成核苷或脱氧核苷，戊糖的第1位碳原子与嘌呤的第9位氮原子相连构成l，9—糖苷键，而与嘧啶的第l位氮原子相连构成1，1-糖苷键。核苷中戊糖的游离羟基与磷酸之间脱水通过磷酯键缩合生成核苷酸。因核糖核苷的糖基在2＇，3＇，5＇，位上均有游离的羟基，故能分别形成2＇-3＇-或5＇-核糖核苷酸，而脱氧核糖核苷的糖基上只有3＇，5＇两个游离的羟基，所以只能形成3＇-或5＇-脱氧核糖核苷酸。生物体内游离存在的多是5＇-核苷酸。5＇-核苷酸的磷酸基上往往可以再接一分子或两分子磷酸，生成二磷酸或三磷酸核糖核苷(NDP或NTP)和二磷酸或三磷酸脱氧核糖核苷(dNDP或dNTP)。四种NTP和四种dNTP分别是合成RNA和DNA的原料。在生物体内还有一些游离的核苷酸及其衍生物，如供能物质ATP、多种激素的第二信使cAMP，cGMP等，在生物代谢过程中起重要作用。 4．核苷酸的连接方式 核苷酸之间靠3＇，5＇-磷酸二酯键彼此连接而组成多核苷酸链。即核苷酸戊糖的第5位碳上的磷酸基与另一个核苷酸戊糖的第3位碳上的羟基脱水缩合形成酯键。因一个磷酸基形成两个酯键，故称为磷酸二酯键。多核苷酸链是核酸的基本结构形式，由四种核糖核苷酸(NMP)通过磷酸二酯键连接而成的多核苷酸链为RNA链。由四种脱氧核糖核苷酸(dNMP)通过磷酸二酯键连接而成的多核苷酸链为DNA链。DNA链和RNA链都具有两个游离末端，其核苷酸残基中戊糖的5位碳上带有游离的磷酸基的一端称为5′末端，戊糖的3位碳上带有游离的羟基的一端称为3′末端。多核苷酸链是以糖—磷酸构成骨架，碱基在骨架内侧。在写核苷酸链核苷酸残基(或碱基)排列顺序时，则从5＇→3＇方向(由左至右)描述。 （二）DNA的分子结构 核酸的分子结构大体分为三级，DNA和RNA在分子的构象和碱基组成上有着显著的差异。 1．DNA的一级结构 DNA的一级结构是指多脱氧核糖核苷酸链中核苷酸残基的排列顺序，也就是核苷酸链中碱基的排列顺序。 DNA对遗传信息的携带和传递是依靠核苷酸中的碱基排列顺序变化而实现的。自然界基因的长度在几十至几万个碱基之间，由于碱基的排列方式不同，因而提供的DNA编码能力几乎是无限的。 2．DNA的二级结构 DNA的二级结构是典型的双螺旋(double helix)结构。Watson-Crick双螺旋结构模型(B-DNA)的特征是： (1)反向平行双链：由两条长度相同、互为反向平行的脱氧多核苷酸链组成。碱基位于两条脱氧核糖和磷酸形成的长链骨架的内侧。 (2)碱基互补配对：两条链通过碱基间形成的氢键相连，具有严格的碱基配对关系。始终是A与T配对、G与C配对。A，T之间形成二个氢键，G，C之间形成三个氢键。碱基对(bp)平面垂直于螺旋轴。 (3)右手双螺旋：两条反向平行的脱氧核糖核酸链围饶同一中心轴盘饶成右手螺旋。每10个bp为一周，螺距为3.4nm，螺旋直径为2.0nm，相邻的bp平面沿轴旋转36°，上升0.34nm。双螺旋面具有深沟和浅沟(大沟和小沟)。深沟是蛋白质识别DNA碱基序列的基础。 (4)维持双螺旋结构稳定的力量：bp之间的氢键维持双螺旋结构的横向稳定，碱基平面间的疏水性堆积力维持纵向稳定。 DNA的二级结构尚存在Z-DNA，A-DNA等螺旋形式。在DNA分子中碱基组成有着显著的特点：既嘌呤碱的数目与嘧啶碱的数目相等。A=T，G=C，A+G=C+T：不同种生物细胞中的DNA，碱基组成不同：同一个体不同组织器官中DNA的碱基组成相同：DNA分子的碱基组成不受年龄、营养状况的影响。 3. DNA的三级结构 DNA的三级结构是在二级结构基础上进一步盘饶形成的超螺旋结构。如真核细胞DNA的双链缠饶在组蛋白上构成核小体。参与核小体形成的组蛋白包括H1，H2A，H2B，H3，H4五种亚基，一个完整的核小体由核心颗粒及连接区组成。每两分子H2A，H2B，H3，H4构成八聚体与DNA形成核小体的核心颗粒，H1亚基形成核小体的连接区。 DNA分子围饶核心颗粒盘饶1圈大约140bp，连接区DNA长度约为60bp，完整的核小体DNA约含200个碱基对，它是染色体的基本单位。由许多核小体形成的串珠状结构再进一步卷曲呈螺线管状排列，即为染色质纤维，染色质纤维再经几次卷曲才能形成染色单体。超螺旋结构的形成使细胞核内DNA的长度压缩了近一万倍。 （三）RNA的分子结构 1．RNA的类型和结构特点 是指多核苷酸链中核苷酸残基的排列顺序，RNA的结构一般是以一条单链形式存在，单链折叠盘饶时存在着一些能够互补配对的核苷酸区，形成局部双螺旋结构。碱基间也有互补配对关系，A对U，G对C，A，U之间形成两个氢键，G，C之间形成三个氢键。但是，在整个RNA分子中嘌呤碱和嘧啶碱之间没有严格的相等关系。单链内不能配对的部分则被排斥在双链外，形成环状突起。这就是RNA的二级结构。细胞内含有三种主要的RNA即mRNA，rRNA，tRNA。 2. mRNA的结构和功能 mRNA可从DNA转录遗传信息，并作为指导蛋白质合成的模版。mRNA含量最少，仅占RNA含量的3％。但作为不同蛋白质合成模版的mRNA种类却最多。其一级结构差异很大，核苷酸数变动范围在500～6000bp之间，其分子为线形单链结构。成熟的mRNA来自于其前体核不均一RNA(hnRNA)的剪接而成。5＇-末端有一个7-甲基鸟苷三磷酸(m7-GTP)的“帽”，3＇-末端有多聚腺苷酸(Po1yA)的“尾”，该尾由30～200个腺苷酸聚合而成。其帽和尾是在转录后加上去的。中间部位为编码区，从5＇→3＇每三个相连的碱基为一组密码，称为“三联体密码子”。组成mRNA的碱基共四种，每3个组成一组密码可组成64组。其中6l组为有意义密码子，分别代表20种不同的氨基酸。 3. tRNA的结构和功能 tRNA的功能是在细胞蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的载体，并将其转呈给mRNA。其分子最小，由60—90个核苷酸组成，约占RNA总量的16％。其分子组成特点是含有较多的稀有碱基和稀有核苷，包括双氢尿密啶(DHU)、假尿苷(ψ)和甲基化的嘌呤(mG，mA)。其二级结构呈三叶草型。其主要功能部位有二个，一个是3′-末端的-CCA-OH结构，起特异结合氨基酸的作用，称为“氨基酸臂”。另一个是反密码环，环上有三联的“反密码子”，它与mRNA上的密码子反向互补。于是，由tRNA携带的氨基酸可被转运到与密码子相对应的部位上。所以，tRNA尚有阅读mRNA密码子的功能。tRNA的三级结构为倒“L”型，是天然状态下的构象。 4. rRNA的结构和功能 rRNA是细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的80％。rRNA不单独存在，它与蛋白质结合为核糖体(核蛋白体)。核糖体由大、小两个亚基组成，在原核和真核生物细胞内，构成大、小亚基的rRNA的种类和数目各不相同。核糖体存在于粗面内质网和胞浆中。 （四）核酸的理化性质 l. 一般理化性质 由于DNA和RNA的多核苷酸链上即有酸性的磷酸基团，又有碱基上的碱性基团。因此，它也是两性电解质。在一定pH溶液中可带某种电荷，可用电泳将其分离。核酸通常显酸性，易与金属离子生成盐。可加入乙醇或异丙醇使其沉淀析出。核酸是生物大分子，具有大分子的一般特性。如易沉淀、因呈线性结构，具有一定的粘度。因核酸分子中的碱基结构中也存在着共轭双键，所以核酸具有紫外吸收特性。核酸溶液在260nm波长处具有最大光吸收，该性质可用于核酸的定量分析。 2. DNA的变性、复性和分子杂交 DNA的变性是指在理化因素作用下，DNA分子中的氢键断裂，碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体，双链分开形成单链的过程。DNA变性后表现为粘度降低、紫外吸收增加(增色效应)。在实验室使DNA变性的最常用方法是加热。加热时DNA双链逐渐发生解链，紫外吸收能力逐渐增加。当紫外吸收达到最大值一半时的溶液温度称为DNA的变性温度(Tm)，亦称解链温度或熔解温度。DNA Tm值的大小与分子中的G—C配对含量多少及分子的长度有关。G，C含量越高Tm值越大，DNA分子越长Tm值也越大。 所谓DNA的复性是指变性分开的两条单链，按照碱基互补配对原则重新形成双股螺旋的过程。通常采用降温的方法使其复性，所以DNA的复性亦称为“退火”。退火温度一般比Tm值低25℃。 而分子杂交是指不同来源的核酸单链合并在一起，形成杂化双链的过程。只要这些核酸链含有可以形成碱基互补配对的序列，就可以形成部分双链。核酸分子杂交在分子生物学研究中是一项应用较多的重要实验技术。 （五）核酸研究技术 1.核酸的分离纯化 （1）分离DNA最重要的方法有3个：一是用盐抽提，用苯酚和氯仿除去蛋白质。二是SDS存在下保温消化细胞悬液，再用苯酚和氯仿去蛋白，用RNase除去少量的RNA。三是用氯化铯密度梯度离心法分离纯化DNA。 （2）制备RNA要防止RNase的降解。①器皿要高温处理或用DEPC除去RNase。②破碎细胞的同是使蛋白质变性。③RNA反应体系中加入RNase抑制剂(RNasin)。常用的RNA分离方法有两种，用酸性胍盐／苯酚／氯仿抽提。其二，用胍盐／氯化铯密度梯度离心。分离Poly(A) mRNA可用寡聚(dT)n亲和层析法。核酸的测定常用紫外分光光度法、定磷法和定糖法。测定生物样品中的核酸需要预先处理，定量提取出核酸或其成分再作测定。 （3）核酸的超速离心是研究核酸的重要方法。常用的是密度梯度离心法。可用来测定核酸密度、测定G十C含量和研究核酸的构象。 （4）核酸的凝胶电泳是最常用的核酸研究方法。通常用的是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 2.限制性核酸内切酶 （1） 限制修饰系统，限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对存在，构成一个限制修饰系统，甲基化酶使细菌自身的DNA带上标志，限制性内切酶专门用于降解入侵的外源DNA。 （2）限制酶的命名：E.coRI,第一位：属名E（大写）, 第二、三位：种名的头两个字母小写co, 第四位： 菌株R, 第五位：从该细菌中分离出来的这一类酶的编号。 (3) 修饰一限制酶主要有三类, ①类型I酶为多亚基双功能酶，对DNA甲基化和切割由同一酶完成。该酶共有二种亚基，S亚基为识别亚基，识别位点分为两部分序列，中间隔以一定长度的任意碱基对。R亚基具有限制酶活性，可在远离识别位点至少1kb以上处随机进行切割。由于切割是随机的，这类酶在基因操作中并无实际用途。②类型Ⅱ酶的修饰和限制活性由分开的两个酶来完成。通常这类甲基化酶由一条多肽链组成，限制酶由两条相同的多肽链组成。类型Ⅱ酶的识别序列常为4—6bp的回文序列。甲基化酶能使半甲基化DNA，识别位点上特定碱基甲基化，甲基化酶每次作用只引入一个甲基。DNA两条链都已甲基化时无反应，两条链都末甲基化则被限制酶降解。限制酶的切割位点或在识别位点内，或靠近识别位点。切割DNA或是将两条链对应酯键切开，形成平末端，或是将两条链交错切开，形成单链突出的末端。切开的两末端单链彼此互补，可以配对，故称为黏性末端。由不同微生物分离得到的限制酶。如果识别位点和切割位点完全一样，称为同裂酶。如仅仅是黏性末端突出的单链相同，称为同尾酶。③类型Ⅲ酶为两个亚基的双功能酶，M亚基负责识别与修饰，R亚基负责切割，其修饰与切割都需要ATP提供能量，切割位点在识别位点下游24～26bp处。 3.DNA物理图谱 在研究某一种DNA时，弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础。限制酶图谱的制作十分简单。 将纯化的DNA(往往用分子克隆法，从单一克隆中扩增而制备)，用不同的限制酶切割，进行凝胶电泳分析。根据测量凝胶电泳图上各酶切片段的长度，就可以决定各切点的位置。 4.分子杂交 在DNA复性时，如把不同DNA分子或DNA与RNA分子放在同一溶液中，只要这些核酸单链分子之间存在一定程度的碱基配对关系，就可在不同分子间形成杂化双链，这种现象称核酸分子杂交。 （1）Southern blotting 将限制性内切酶酶切电泳后的DNA转移至NC膜上，再与核酸探针杂交的技术。Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和基因定位。 （2）Northern blotting 将电泳后的RNA转移至NC膜上，再与核酸探针杂交的技术。研究对象是RNA。 （3）Western blotting 将聚丙烯酰胺凝胶电泳后的蛋白质转移至NC膜上，再与另一标记蛋白质分子(如抗体)杂交的技术。抗原与抗体的杂交，研究基因表达产物的常用技术。 5.DNA序列分析 （1）化学法 化学法的原理是用特异的化学试剂修饰DNA 分子中的不同碱基，然后用哌啶切断多核苷酸链。所以，用四组不同的特异反应，就可以将末端(3’或5’ 端)用放射性标记的DNA分子形成不同长度的寡核苷酸。用凝胶电泳将这些不同长度的寡核苷酸分离开来，即可读出所测定的DNA的序列。 （2）双脱氧法(dideoxy method)也称酶法(enzyme method)，是由Sanger于1977年建立的。其原理是利用2’，3’-双脱氧三磷酸核苷(2’，3’-ddNTP)来终止DNA的复制反应。大肠杆菌DNA聚合酶(或K1enow片段)在DNA复制过程中催化多核苷酸链的延伸，单核苷酸是接在延伸链的3’-0H上。所以，如果掺入的底物中有2’，3’-ddNTP，延伸反应即告终止。这样设计四组反应，每组反应中都含有正常的四种脱氧核苷酸dNTP(其中一种为32P标记的)，单链DNA(即待测的DNA)和引物(Primer)，各组反应还加入一种2’，3’-ddNlP。反应结果，在加入2’，3’-ddATP的反应中，凡碰到需要dATP的时候，如果掺入的不是dATP，而是2’，3’-ddATP时，链延伸反应即告终止。用凝胶电泳分析这四组反应的产物，即可从放射自显影上读出DNA的序列。 （3）RNA的序列分析 ①酶裂解法，从胰脏提取的Rnase A水解嘧啶核苷酸的键，所产生寡核苷酸的3’端均为嘧啶核苷酸。米曲霉中提取的RNase Tl特异水解鸟苷酸与相邻核苷酸的键。黑粉菌中提取的RNase U2在一定条件下特异水解腺苷酸的键。从多头粘菌中提取的RNase Phy I水解A、G、U 3种核苷酸，但不水解胞苷酸。利用上述4种酶可测定RNA的序列。②用化学试剂裂解RNA 基本原理与DNA化学测序法相似。③逆转录成cDNA 即可用DNA测序法来测定序列。 6.DNA的化学合成 DNA的化学合成已有自动化仪器来完成，目前采用的是亚磷酸三酯法。 7.DNA聚合酶链式反应 DNA的聚合酶铤反应(PCR)是一种快速简便的体外DNA扩增技术，能在很短时间内，将几个拷贝的DNA放大上百万倍。是应用最广泛的生物技术。 （1）它的基本步骤为：①设计一对引物。②优化反应体系。③选择热循环温度。④鉴定扩增产物。 （2）工作原理：以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5’末端和3’末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按半保留复制的机制沿模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，使目的DNA片段得到大量扩增。 （3）用途 目的基因的克隆、基因的体外突变、DNA微量分析等。 三、重点、难点 重点：本章应重点掌握核酸的分子组成、核酸的分子结构、特别是DNA的二级结构特点以及三种RNA的结构特点及功能，DNA的变性、复性及杂交的概念及意义。为基因信息的传递各章节的学习打好基础。还应该了解核酸的分离纯化,限制性核酸内切酶及DNA物理图谱,分子杂交,DNA序列分析,DNA聚合酶链式反应（PCR）等现代的核酸研究技术。 难点：DNA的二级结构特点以及三种RNA的结构特点及功能，DNA序列分析和DNA聚合酶链式反应（PCR）。 四、典型例题解析 例题5-1：DNA热变性有何特点?Tm值表示什么? 解：将DNA的稀盐溶液加热到70-100℃几分钟后，双螺旋结构即发生破坏，氢键断裂，两条链彼此分开，形成无规则线团状，此过程就是DNA的热变性。DNA的热变性有很多特点如：变性温度范围很窄；260nm处的紫外吸收增加；粘度下降；生物活性丧失；比旋度下降；酸碱滴定曲线改变。Tm值代表核酸的变性温度(熔解温度、熔点)。在数值上等于DNA变性时紫外吸收达到最大值半数时所对应的温度。 例题5-2：简述DNA双螺旋的结构特点。 解：DNA分子为两条多核苷酸链以相同的螺旋轴为中心，盘绕成右旋、反向平行的双螺旋；以磷酸和戊糖组成的骨架位于螺旋外侧，碱基位于螺旋内部，并且按照碱基互补的原则，碱基之间通过氢键形成碱基对，A-T间形成二个氢键、G-C间形成三个氢键；双螺旋的直径是2nm，每10个碱基对旋转一周，螺距为3.4nm，所有的碱基平面都与中心轴垂直；维持双螺旋的作用力是碱基堆积力和氢键。 例题5-3：在pH7.0，0.165mol/L NaCI条件下，测得某一DNA样品的Tm为89.3℃。求出四种碱基百分组成。 解：因为 (G+C)％=(Tm-69.3)×2.44×％ =(89.3-69.3)×2.44×％ =48.8％ G=C=24.4％ 而(A+T)％=1-48.8％=51.2％ A=T=25.6％ 例题5-4：有一噬菌体DNA长17μM，问它含有多少对碱基? 螺旋数是多少? 解：因为17μm=17000nm 所以此核酸分子的碱基对数：17000/0.34=5×104(对) 螺旋数：5×104/10=5×103(圈) 例题5-5：将核酸完全水解后可得到哪些组分?DNA与RNA的水解产物有何不同? 解：将核酸完全水解后可以得到：磷酸、戊糖、碱基三种组分。DNA水解后得到的戊糖是2-脱氨核糖，碱基有胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)。RNA水解后得到的戊糖是核糖，碱基有尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)。 例题5-6：DNA与RNA的一级结构有何异同? 解：DNA的一级结构中组成成分为脱氧核糖核苷酸，核苷酸残基的数目由几千至几千万个；而RNA的组成成分是核糖核苷酸，核苷酸残基的数目仅有几十到几千个。另外在DNA分子中A=T，G=C；而在RNA分子中A≠U，G≠C。 二者的相同点在于：它们都是以单核苷酸作为基本组成单位，核苷酸残基之间都是由3，5—磷酸二酯键相连接的。 例题5-7：简述tRNA二级结构的组成特点及其每一部分的功能。 解：tRNA的二级结构为三叶草结构。其结构特征为：①tRNA的一级结构由四臂、四环组成。已配对的片断称为臂，未配对的片断称为环。②叶柄是氨基酸臂。其上含有CCAOH3'，此结构是接受氨基酸的位置。③氨基酸臂对面是反密码子环。在它的中部含有三个相邻碱基组成的反密码子，反密码子可以与mRNA上的密码子相互识别。④左环是二氢尿嘧啶（DHU环)，它与氨酰-tRNA合成酶的结合有关。⑤右环是假尿嘧啶环(TψCG环)，它与核糖体的结合有关。⑥在反密码子环与假尿嘧啶环之间的是可变环，它的大小决定着tRNA的分子大小。 例题5-8：一个单链DNA与一个单链RNA分子量相同，你如何将它们区分开? 解：①用专一性的RNA酶与DNA酶分别对两者进行水解。 ②用碱水解。RNA能够被水解，而DNA不被水解。 ③进行颜色反应。二苯胺试剂可以使DNA变成蓝色；苔黑酚(地衣酚)试剂能使RNA变成绿色。 ④用酸水解后，进行单核苷酸的分析(层析法或电泳法)，含有U的是RNA，含有T的是DNA。 例题5-9：为什么大多数核酸酶受金属螯合剂EDTA的抑制? 解：．绝大多数核酸酶在发挥作用时需要Mg2+的参与。当加入金属螯合剂EDTA后，Mg2+将被螯合，从而抑制了核酸酶的活性。 例题5-10：计算下列碱基的浓度：(以摩尔/升表示，溶液的pH为7.0，按260nm处的摩尔消光系数：G=7.2×103；T=7.4×103计算) ①鸟嘌呤溶液的A260=0.325 ②胸腺嘧啶溶液的A260=0.090 解：由公式：A260=εCL公式中A260为光密度(嘌呤碱及嘧啶碱对紫外吸收的最大吸收峰是260nm) ε为260nm处的碱基摩尔消光系数 C为每升溶液中碱基的摩尔数 L为比色杯内径的厚度 已知： A260(G)=0.325 ε(G)=7.2×103 A260(T)=0.090 ε(T)=7.4×103 L=lcm 所以C=A260/εL C(G)=0.325/(7.2×103×1)=4.5×10-5(mol/L) C(T)=0.090/(7.4×103×1)=1.2×10-5(mol/L) 例题5-11：如果人体有10TM个细胞，每个体细胞的DNA量为6.4 ×109个碱基对。试计算人体DNA的总长度是多少?这个长度与太阳—地球之间的距离(2.2×109公里)相比如何? 解：每个体细胞内DNA的总长度为： 6.4×109×0.34nm=2.176×109nm=2.176m 人体内所有体细胞内的DNA的总长度： 2.176×1014m＝2.176×1011km 这个长度与太阳一地球之间的距离相比为： 2.176×1011/2.2×109=0.99×102=99(倍) 例题5-12：说明在pH2.5、pH3.5、pH6、pH8、pHll.4时，四种核苷酸(AMP、GMP、CMP、UMP)所带的电荷数(或所带电荷数多少的比较)，并回答下列问题： ①电泳分离四种核苷酸时，缓冲液应取哪个pH比较合适?此时它们是向正极还是向负极移动?移动的快慢顺序如何? ②当要把上述四种核苷酸吸附于阴离子交换树脂柱上时，应调到什么pH值? ③如果用洗脱液对阴离子交换树脂上的四种核苷酸进行洗脱分离时，洗脱液又应调到什么pH值?这四种核苷酸的洗脱顺序如何?为什么? 解： PH2.5 pH3.5 pH6 pH8 pHll.4 UMP 负电荷最多 -1 -1.5 -2 -3 GMP 负电荷较多 -0.95 -1.5 -2 -3 AMP 负电荷较少 -0.46 -1.5 -2 -2 CMP 带正电荷 -0.16 -1.5 -2 -2 ①电泳分离四种核苷酸时应取pH3.5，在该pH时，这四种单核苷酸之间所带负电荷差异较大，它们都向正极移动，但移动的速度不同，依次为： UMP>GMP>AMP>CMP ②应取pH8.0，这样可使各核苷酸带较多负电荷，利于吸附于阴离子交换树脂。虽然pHll.4的核苷酸带有更多的负电荷，但pH过高对树脂不利。 ③洗脱液的pH应取pH2.5。当不考虑树脂的非极性吸附时洗脱顺序为CMP>AMP> GMP> UMP (根据pH2.5时核苷酸负电荷的多少来决定洗脱速度)，但实际上核苷酸和聚苯乙烯阴离子交换树脂之间存在着非极性吸附，嘌呤碱基的非极性吸附是嘧啶碱基的3倍。静电吸附与非极性吸附共同作用的结果使洗脱顺序为： CMP>AMP>UMP>GMP 例题5-13：试述三种主要的RNA的生物功能(与蛋白质生物合成的关系)。 解： mRNA是信使RNA，它将DNA上的遗传信息转录下来，携带到核糖体上，在那里以密码的方式控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序，作为蛋白质合成的直接模板。rRNA是核糖体RNA，与蛋白质共同构成核糖体，核糖体不仅是蛋白质合成的场所，还协助或参与了蛋白质合成的起始。tRNA是转运RNA，与合成蛋白质所需的单体氨基酸形成复合物，将氨基酸转运到核糖体中mRNA的特定位置上。 例题5-14：线粒体电子转移链中的一种重要蛋白质：酵母细胞色素氧化酶由7个亚基组成，但是只有其中的4种亚基的氨基酸顺序由酵母核内DNA编码，那么其余三种亚基的氨基酸顺序所需的信息来自何处? 解：除了核内DNA外，酵母细胞的线粒体内还含有少量DNA，这些DNA编码其余三种亚基的氨基酸顺序。 例题5-15：胰脱氧核糖核酸酶(DNase l)可以随机地水解溶液中的DNA的磷酸二酯键，但是DNase I作用于染色体DNA只能使之有限水解，产生的DNA片段长度均为200bp的倍数。请解释。 解：真核生物染色体DNA含有核小体结构，核小体是由大约200bp的DNA双链围绕组蛋白核心组成的，彼此相连形成念珠状结构，即染色体DNA。围绕组蛋白核心的DNA不被Dnase I水解，而核小体与核小体之间起连接作用的DNA的磷酸二酯键对DNase I敏感，因此水解产生长约200bp的DNA片段。 例题5-16：什么是细菌的限制-修饰系统（Restriction-modification system, R-M system） 解： 细菌中有作用于同一DNA的两种酶，即分解DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。而且，这两种酶作用于同一DNA的相同部位，把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统。 例题5-17： 细菌的限制-修饰系统有什么意义？ 解： 不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统。修饰的本质是通过甲基化酶将DNA中某些碱基进行甲基化修饰，由于外来的DNA在相应的碱基上没有被甲基化，宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我，并将入侵的外来DNA分子降解掉。所以DNA限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。 例题5-18：什么是限制性片段长度多态性？ 解： 当DNA序列的差异发生在限制性内切核酸酶的识别位点时，或当DNA片段的插入、缺失或重复导致基因组DNA经限制性内切核酸酶酶解后，其片段长度的改变可以经凝胶电泳区分时，DNA多态性就可应用限制性内切核酸酶进行分析，这种多态性称为限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism, RFLP）。 例题5-19：计算下列三种酶各自在某染色体DNA序列上识别位点间的平均距离。 Alu I: 5’AGCT 3’ EcoR I: 5’GAATTC 3’ 3’TCGA 5’ 3’CTTAGG 5’ Acy I: 5’GPuCGPyC 3’ 3’CPyGCPuG 5’ 解： Alu I：（1/4）4 = 1/256 EcoR I：（1/4）6 = 1/4096 Acy I：（1/4）4（1/2）2 = 1/1024 例题5-20：为了绘制长为3.0kb BamHⅠ限制性片段的限制性图谱，分别用EcoRⅠ、Hpa Ⅱ、EcoRⅠ+Hpa Ⅱ消化这一片段的三个样品。然后通过凝胶电泳分离DNA片段、溴化乙锭染色后观察DNA带型（图5-1）。请根据这些结果，绘制一个限制性图谱，要标明EcoRⅠ和Hpa Ⅱ、识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离（kb）。 解： 图5-1是BamH I片段的限制性图谱。倒装法绘图是同样有效的，制作这种图谱的一种方法如下：画一条适当长度的线段表示3.0kb的BamH I片段。由于Hpa Ⅱ只切割一次，Hpa Ⅱ的位点可以明确地定位，从片段的任一端起1.6kb处标出其位置。EcoR I切割片段两次，如果你从片段的任一端起1.7kb处确定EcoR I位点的位置，你会发现它与Hpa Ⅱ的距离同那些用双酶消化所得到片段的大小不相符，因此1.7kb的片段必定位于中间，两个EcoR I位点必定离两端各为0.4和0.9kb。 例题5-21： PCR的基本原理是什么？PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息？ 解： （1）DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。 （2）至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。 例题5-22：在DNA分离过程中， 酚通常与氯仿联合使用，即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次，为什么？ 解： 原因是酚和水有一定程度的互溶，所以单独使用酚抽提DNA，最终不能除去酚，残留的酚会使起切割和连接作用的限制性内切核酶和连接酶变性。氯仿也是蛋白质性剂，它不与水互溶，但是能够同苯酚互溶，这样，酚和氯仿联合使用，就可以带走残留的酚。 例题5-23：什么是同裂酶？为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高？ 解： 同裂酶是一类识别序列不完全相同，但是产生的黏性末端至少有四个碱基相同的限制性内切核酸酶。用这些限制性内切核酸酶处理载体和外源DNA得到的末端可以通过黏性末端连接法连接。 同裂酶产生的黏性末端虽然可以像完全亲和的黏性末端那样进行连接，但是它与完全亲和的黏性末端连接不同的是，连接后的产物往往失去原有的限制性内切核酸酶的切点，但是能够被另外一种同裂酶识别。这样用同裂酶进行体外重组时，在限制性内切核酸酶切割反应之后不必将原有的内切酶失活，就可直接进行重组连接。由于连接体系中有原有的限制性内切核酸酶的存在，载体自连不会发生，从而保证了载体同外源DNA的连接。所以在这种连接反应中不必用碱性磷酸酶进行载体的脱磷反应而得到最高的连接效率。 反应中通常要涉及三种不同的限制性内切核酸酶，其中两种是识别六碱基的酶，另一种是识别四碱基的酶。 例题5-24：说明Sanger DNA测序法的原理。 解：Sanger DNA测序法是建立在两个基本原理之上：(1) 核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由5’端向3’端聚合(DNA聚合酶参与了细菌修复DNA合成过程)；(2)—个延伸的引物必须能提供游离的3’羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3’羟基末端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用4种双脱氧核苷酸终止反应，则会获得4组长度不同的DNA片段。通过比较所有DNA片段的长度可以得知核苷酸的序列。 例题5-25：某学生在用EcoR I切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因? 解：盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。 例题5-26：用Klenow酶填补的办法可使5’黏性末端转变成平末端。这种方法常使DNA上的某些限制酶的识别位点消失。请问，对于下列限制酶，用这种方法处理会不会使它们的识别序列都消失?BamH I(G十GATCC)；TaqI(T十CGA)，BssHⅡ(G十CGCGC)。 解：BssHⅡ不会。 例题5-27：采用什么措施保证DNA化学合成的定向性和专一性? 解：(1)将不必进行反应的基团保护起来，这样可保证定向。 (2)每一循环之后，清除多余的单核苷酸，并将未反应的固着核苷酸链封闭起来，保证下一个反应的专一性。 例题5-28：说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 解：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则，即属名十种名+株名的各一个首字母，再加上序号。 基本原则： 3—4个字母组成，方式是：属名+种名+株名+序号； 首字母： 取属名的第一个字母，且斜体大写； 第二字母： 取种名的第一个字母，斜体小写； 第三字母： (1)取种名的第二个字母，斜体小写； (2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。 第四字母： 若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定，但用正体。 顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、等，用正体。 例题5-29： Northern印迹与Southern印迹有什么不同？ 解： Northern印迹的原理同Southern印迹相比有两点不同：(1)转移的对象不同，Southern印迹是将限制性内切核酸酶酶切、电泳后的DNA转移到固相支持物上。Northern印迹是将RNA变性及电泳分离后，转移到固相支持物上的过程。(2)虽然RNA电泳前不需像DNA那样进行酶切，但也需要变性。不过变性方法是不同的，它不能用碱变性，因为碱变性会导致RNA的降解。 例题5-30： 说明Southern杂交的原理和方法。 解： 1975年Southern建立起来的一种杂交方法，属固相—液相杂交。该法的主要特点是利用毛细管现象将DNA转移到固体支持物上，称为Southern转移或Southern印迹(Southern blotting)。它首先用合适的限制性内切核酸酶将DNA切割，进行电泳分离后，利用干燥的吸水纸产生毛细管作用，使液体经过凝胶，从而使DNA片段由液流携带从凝胶转移并结合在固体支持物表面。 五、单元自测题 (一) 名词解释 1．核酸， 2．核酸一级结构，3．DNA二级结构，4．碱基互补规律，5．稀有碱基、稀有核苷酸，6．环化核苷酸，7．多磷酸核苷酸，8．增色效应，9．减色效应，10．发卡结构 11．分子杂交，12．Tm值，13. 回文序列，14. 同裂酶，15. 限制性物理图谱 （二）填空题 1．核酸可分为　　　和　　　两大类，其中　　　主要存在于　　　中，而　　　主要存在于　　　。 2．核酸完全水解生成的产物有　　　、　　　和　　　， 其中糖基有　　　 ，碱基有　　　和　　　两大类。 3．生物体内的嘌呤碱主要有二种，　　　　　　和　　　，嘧啶碱主要有　　　、 　　　和　　　，某些RNA分子中还含有微量的其它碱基，称为　　　。 4．DNA和RNA分子在物质组成上有所不同，主要表现在　　　　　和　　　的不同，DNA分子中存在的是　　　和　　　，RNA分子中存在的是　　　和　　　。 5．RNA的基本组成单位是　　　、　　　、　　　、　　　，DNA的基本组成单位是　　　、　　　、　　　、　　　，它们通过　　　键相互连接形成多核苷酸链。 6．DNA的二级结构是　　　结构，其中碱基组成的共同特点是(若按摩尔数计算)　　　、　　　、　　　。 7．测知某一DNA样品中，A＝0.53mol，C＝0.25mol、那么T＝　　　mol，G＝　　　mol。 8．嘌呤环上的第　　　位氮原子与戊糖的第　　　位碳原子相连形成　　　键，通过这种键相连而成的化合物叫　　　。 9．嘧啶环上的第　　　位氮原子与戊糖的第　　　位碳原子相连形成　　　键，通过这种键相连而成的化合物叫 。 10. 有两个主要的环核苷酸是　　　、　　　，它们的主要生理功用是　　　。 11．写出下列核苷酸符号的中文名称：ATP　　　、dCDP　　　。 12. DNA的Tm值的大小与其分子中所含的　　　的种类、数量及比例有关，也与分子的　　　、有关。若含的A—T配对较多其值则　　　、含的G—C配对较多其值则　　　，分子越长其Tm值也越　　　。 13．组成核酸的元素有　　　、　　　、　　　、　　　 、　　　等，其中　　　的含量比较稳定，约占核酸总量的　　　，可通过测定　　　的含量来计算样品中核酸的含量。 14．DNA双螺旋结构的维系力主要有　　　和　　　。 15. DNA分子中G，C含量高分子较稳定，同时比重也较　　　、解链温度也　　　。 16．RNA主要有三类，既　　　、　　　和　　　、它们的生物功能分别是　　 　、 　　 　和　 　　。 17．RNA的二级结构大多数是以单股　　　的形式存在，但也可局部盘曲形成　　　结构，典型的tRNA二级结构是　　　型结构。 18．在生物细胞中主要有三种RNA，其中含量最多的是　　　、种类最多的是　　　、含有稀有碱基最多的是　　　。 19. tRNA三叶草型结构中，氨基酸臂的功能是　　　，反密码环的功能是　　　。 20. tRNA氨基酸臂3’末端中最后三个碱基是　　　，反密码环中有三个相连的单核苷酸组成　　　。 21. 成熟的mRNA在5’末端加上了　　　构成帽的结构，在3’末端加上了　　　形成尾巴。 22．Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20～40KDa，通常由 亚基所组成。它们的作用底物为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA杂合双链。这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有 专一性，也具有 专一性，一般在识别序列内切割。切割的方式有 ，产生 或 的DNA片段。作用时需要 作辅助因子，但不需要 和 。 23. 完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：(1) (2) 。 24．SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用： (1) ； (2) ； (3) ； (4) 。 25．酚是蛋白变性剂，用酚抽提细胞DNA时，具有两方面的作用：(1) ; (2) 。 26．用酚—氯仿抽提DNA时，通常要在氯仿或酚—氯仿中加少许异戊醇。这是因为异戊醇 。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 27．同其他水解蛋白酶相比，蛋白水解酶K具有两个显著的优点：(1) ;(2) 。 28．在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是 。 29．用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加入单价的阳离子，如NaCl和NaAc，其目的是 。 30．浓缩DNA的方法有：(1) ;(2) ;(3) ; (4) 。 31. 通常可在三种温度下保存DNA：4～5℃、-20℃、-70℃，其中以 最好。 32．在用SDS分离DNA时，要注意SDS的浓度，0.1％和1％的SDS的作用效果是不同的，前者 ，后者 。 33．在DNA分离过程中造成DNA分子断裂的因素很多，主要有(1) ；(2) ；(3) 。 34．在分离DNA时，常用 法、 法、 法及 法等方法去除蛋白质。 35．在DNA保存液中，常加一滴氯仿，主要是起 作用。 36．在简并引物的设计中，常常要用到dI(次黄嘌呤)，原因是 。 37．在分离DNA时，要戴手套操作，原因是 。 38．简并引物PCR主要是根据蛋白质的氨基酸序列设计 引物来合成相应的基因。 39．SSC是由NaCI和柠檬酸钠组成的试剂，其中NaCl的作用是使 ，而柠檬酸钠的作用是 。 40．在重蒸酚中加入0．1％的8—羟基喹啉及少量β—巯基乙醇，不仅可以防止酚的氧化，还可以 的活性及 作用。 （三）选择题 1．在核酸中一般不含有的元素是： A 碳 B 氢 C 氧 D 硫 2．腺嘌呤(A)与鸟嘌呤(G)在结构上的差别是： A A的C6上有羟基，G的C6上有氨基 B A的C6上有氨基，G的C2上有氨基 C A的C6上有甲基，G的C6上有羰基 D A的C6上有氨基，G的C2上有羰基 3．胸腺嘧啶(T)与尿密啶(U)在结构上的差别是： A T的C2上有氨基，U的C2上有氧 B T的C5上有甲基，U的C5上无甲基 C T的C4上有氧，U的C4上有氧 D T的C2上有氧，U的C2上有氧 4．通常即不见于DNA又不见于RNA的碱基是： A 腺嘌呤 B 黄嘌呤 C 鸟嘌呤 D 胸腺嘧啶 5．下列哪种碱基只存在于mRNA而不存在于DNA中? A 腺嘌呤　　 B 尿嘧啶 C 鸟嘌呤 D 胞嘧啶 6．DNA与RNA完全水解后，其产物的特点是： A 戊糖不同、碱基部分不同 B 戊糖不同、碱基完全相同 C 戊糖相同、碱基完全相同 D 戊糖相同、碱基部分不同 7．在核酸分子中核苷酸之间的连接方式是： A 3′，3′，-磷酸二酯键 B 糖苷键 C 3′,5′-磷酸二酯键 D 肽键 8．核酸的紫外吸收是由哪一结构所产生的? A 嘌呤和嘧啶之间的氢键 B 碱基和戊糖之间的糖苷键 C 戊糖和磷酸之间的酯键 D 嘌呤和嘧啶环上的共轭双键 9．含有稀有碱基比例较多的核酸是： A mRNA B DNA C tRNA D rRNA 10．核酸分子中储存、传递遗传信息的关键部分是： A 核苷 B 戊糖 C 磷酸 D 碱基序列 11．假尿苷的糖苷键是： A C—C B C—N C N—N D C—H 12. 在核苷酸分子中戊糖(R)、碱基(N)和磷酸(P)的连接关系是： A N—R—P B N—P—R C P—N—R D R—N—P 13．DNA的二级结构是指： A α—螺旋 B β—片层 C β—转角 D 双螺旋结构 14．下列关于核苷酸生理功能的叙述，错误的是： A 作为生物界最主要的直接供能物质 B 作为辅酶的组成成分 C 作为质膜的基本结构成分 D 作为生理调节物质 15．ATP的生理功能不包括： A 为生物反应供能 B 合成RNA C 贮存化学能 D 合成DNA 16．关于DNA双螺旋结构学说的叙述，哪一项是错误的? A 由两条反向平行的DNA链组成 B 碱基具有严格的配对关系 C 戊糖和磷酸组成的骨架在外侧 D 生物细胞中所有DNA--级结构都是右手螺旋 17．下列哪种核酸的二级结构具有“三叶草”型? A mRNA B 质粒DNA C tRNA D 线粒体DNA 18． 下列复合物中除哪个外，均是核酸与蛋白质组成的复合物 A 核糖体 B 病毒 C 端粒酶 D 核酶(ribozyme) 19．真核细胞染色质的基本结构单位是： A 组蛋白 B 核心颗粒 C 核小体 D 超螺旋管 20．不参与核小体核心颗粒的蛋白质是： A H1 B H2A C H2B D H3 21．核酸的一级结构实质上就是： A 多核苷酸链中的碱基排列顺序 B 多核苷酸链中的碱基配对关系 C 多核苷酸链中的碱基比例关系 D 多核苷酸链的盘绕、折叠方式 22．DNA变性是指： A 多核苷酸链解聚 B DNA分子由超螺旋变为双螺旋 C 分子中磷酸二酯键断裂 D 碱基间氢键断裂 23. 双链DNA热变性后 A 黏度下降 B 沉降系数下降 C 浮力密度下降 D 紫外吸收下降 24. DNA Tm值较高是由于下列哪组核苷酸含量较高所致? A G+A B C+G C A+T D C+T 25. 核酸变性后可发生下列哪种变化? A 减色效应 B 增色效应 C 紫外吸收能力丧失 D 溶液粘度增加 26．在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最好? A 反应时间 B 酶量 C 反应体积 D 酶反应的温度 27．对DNA片段作物理图谱分析，需要用 A 核酸外切酶 B 限制性内切酶 C DNA连接酶 D DNA聚合酶I 28．从细胞或组织中分离DNA时，常用蔗糖溶液，目的是： A 抑制核酸酶的活性 B 保护DNA，防止断裂 C 加速蛋白质变性 D 有利于细胞破碎 29．关于cDNA的最正确的说法是： A 同mRNA互补的单链DNA B 同mRNA互补的双链DNA C 以mRNA为模板合成的双链DNA D 以上都正确 30． RNA经NaOH水解，其产物是 A 5'-核苷酸 B 2'-核苷酸 C 3'-核苷酸 D 2'-核苷酸和3'-核苷酸的混合物 31．用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为： A 染色体DNA断成了碎片 B 染色体DNA分子量大，而不能释放 C 染色体变性后来不及复性 D 染色体未同蛋白质分开而沉淀 32．Clark做了一个有趣的实验，发现Taq DNA聚合酶可以不需要模板，在双链DNA的末端加一个碱基，主要是加 A dGTP B dATP C dCTP D dTTP 33．在简并引物的3′端尽量使用具有简并密码的氨基酸，这是因为 A Taq酶具有一定的不精确性 B 便于排除错误碱基的掺人 C 易于退火 D 易于重组连接 34．Southern印迹的DNA探针杂交。 A 只与完全相同的片段 B 可与任何含有相同序列的DNA片段 C 可与任何含有互补序列的DNA片段 D 可与用某些限制性内切核酸酶切成的DNA片段 35．下列哪一个不是Southern印迹法的步骤? A 用限制酶消化DNA B DNA与载体的连接 C 用凝胶电泳分离DNA片段 D DNA片段转移至硝酸纤维素膜上 (四)是非题 1. 核苷中碱基和戊糖的连接一般为C-C糖苷键。 2．在DNA变性过程中总是G-C对丰富区先熔解分开。 3．RNA的局部螺旋区中，两条链之间的方向也是反向平行的。 4．不同来源DNA单链，在一定条件下能进行分子杂交是由于它们有共同的碱基组成。 5．核酸变性时紫外吸收值明显增加。 6．Tm值高的DNA，(A+T)百分含量也高。 7．用二苯胺法测定DNA，必须用同源的DNA作为标准样。 8．双链DNA中，嘌呤碱基含量总是等于嘧啶碱基含量。 9．真核细胞中DNA只存在于细胞核中。 10．在体内存在的DNA都是以Watson—Crick提出的双螺旋结构形式存在的。 11．在一个生物个体不同组织中的DNA，其碱基组成不同。 12．原核细胞DNA是环状的，真核细胞中的DNA全是线状的。 13．某物质的水解产物对260nm的紫外光有强吸收，地衣酚及二苯胺试验阴性，可以断定此物质为非核酸物质。 14．真核mRNA分子5'末端有一个PolyA结构。 15．DNA分子中含有大量的稀有碱基。 16．tRNA分子中含有较多的稀有碱基。 17．mRNA是人体细胞RNA中含量最高的一种，因为它与遗传有关。 18．DNA只存在于细胞(真核与原核)中，病毒体内无DNA。 19．线粒体中也存在一定量的DNA。 20．自然界中只存在右旋的DNA双螺旋。 21．碱基配对发生在嘧啶碱与嘌呤碱之间。 22．DNA双螺旋结构中，由氢键连接的碱基对形成一种近似平面的结构。 23．DNA双螺旋的两条链方向一定是相反的。 24．RNA的分子组成中，通常A不等于U，G不等于C。 25．tRNA二级结构中，所有核苷酸只形成三个环、氨基酸臂、附加环和配对的碱基。 26．DNA—蛋白质在低盐溶液中溶解度较小，而RNA—蛋白质在低盐溶液中溶解度大。所以可利用此差别来分离这两种核蛋白。 27．在酸性条件下，DNA分子上的嘌呤碱基不稳定，易被水解下来。 28． 核酸的紫外吸收与溶液的pH值无关。 29． 生物体内存在的游离核苷酸多为5'-核苷酸。 30． Z型DNA与B型DNA可以相互转变。 31．mRNA是细胞内种类最多、含量最丰富的RNA。 32. 在所有病毒中，迄今为止还没有发现既含有RNA又含有DNA的病毒。 33．基因表达的最终产物都是蛋白质。 34. 两个核酸样品A和B，如果A的OD260/OD280大于B的OD260/OD280，那么A的纯度大于B的纯度。 35. 限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它是通过对外源DNA的修饰和对自身DNA的限制实现的。 36．能够产生防御病毒侵染的限制性内切核酸酶的细菌，其本身的基因组中没有被该核酸酶识别的序列。 37．限制性图谱与限制性片段长度多态性(RFLP)图谱的最显著的区别在于前者是一个物理图谱而后者是一个连锁图。 38．迄今所发现的限制性内切核酸酶既能作用于双链DNA，又能作用于单链DNA。 39. 甘油会使许多限制内切核酸的特异性发生改变，是导致一些酶的星活性的主要原因之一，防止的办法是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在5%以下。 40. 同一内切核酸酶切割靶DNA，得到的片段端都是相同的。 41. 所谓引物就是同DNA互补的一小段RNA分子。 42．如果PCR的每一次循环都把上一次循环中合成的DNA加了一倍，那么，10个循环就扩增了1000倍，20个循环就扩增了100万倍，30个循环就扩增了10亿倍。 43．最有效的制备纯RNA的方法是让其在细胞中超表达，然后提纯。 44．大量制备已被克隆基因编码蛋白产物的常用方法是体外转录和翻译。 45．简并引物是根据已知DNA序列设计的引物群。 46．在DNA贮存液中加一滴三氯甲烷，可防止真菌的污染。 47．密码的偏爱性是指不同种属的生物对简并密码具有不同的使用频率。 48．酚法和碱法分离质粒DNA都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度要高。 49．在Northern杂交中，为了防止RNA形成部分环状发夹结构影响迁移率，所以要用变性缓冲液进行电泳。 50．Northern印迹和Southern印迹的基本原理是—样的，都是用于检测结构基因的表达。 （五）问答题 1. (1)T7噬菌体DNA，其双螺旋链的相对分子质量为2.5×107。计算DNA链的长度(设核苷酸对的平均相对分子质量为650)。 (2)相对分子质量为130×106的病毒DNA分子，每微米的质量是多少? (3)编码88个核苷酸的tRNA的基因有多长? (4)编码细胞色素C(104个氨基酸)的基因有多长?(不考虑起始和终止序列) (5)编码相对分子质量为9.6万的蛋白质的mRNA，相对分子质量为多少?(设每个氨基酸的平均相对分子质量为120) (6)λ噬菌体DNA长17μm，一突变体DNA长15μm，问该突变体缺失了多少碱基对? 2. 对一双链DNA而言，若一条链中(A+G)/(T+C)=0.7，则：(1)互补链中(A+G)/(T+C)=?(2)在整个DNA分子中(A+G)/(T+C)=?(3)若一条链中(A+T)=(G十C)=0.7，则互补链中(A+T)/(G+C)=?(4)在整个DNA分子中(A+T)/(G+C)=? 3. 试述下列因素如何影响DNA的复性过程。 (1)阳离子的存在，(2)低于Tm的温度， (3)高浓度的DNA链。 4. 如何让一个超螺旋的环状病毒DNA分子采取其松弛态? 线形双链DNA能否形成超螺旋? 5．用稀酸或高盐溶液处理染色质，可以使组蛋白与DNA解离，请解释。 6. 在酶切反应缓冲液中加入BSA的目的是什么?机理是什么? 7. 有些噬菌体和质粒常常编码一些抗限制性酶的蛋白以中和宿主的限制系统。你认为噬菌体和质粒还有哪些可能的方式避免宿主的限制作用? 8. 下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列： GAATCG， AAATIT， GATATC， ACCCCA ? 为什么? 9. 当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?为什么? 10. 什么是限制性内切核酸酶的星号活性?受哪些因素影响? 11. 用于克隆的DNA在质量上有什么要求? 12. 为什么从细胞中分离DNA时往往会断裂? 13. 为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离? 14. 为什么氧化变色的酚不能直接用于DNA的分离?应如何处置? 15. 在DNA分离过程中，酚通常与氯仿联合使用，即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次，为什么? 16. 何谓简并引物(degenerate Primer)? 17. 双脱氧法(dideoxynucleotide method)测序的基本原理是什么? 18. 限制性内切核酸酶有哪些特点? 19. 一个线形的DNA分子分别被两种限制性内切酶或同时被两种内切酶消化，消化的结果是： 限制性内切酶 片段大小（Kb） BamHⅠ 8.0, 7.5, 4.5, 2.9 Bgl Ⅱ 13, 6, 3.9 BamH I/Bgl Ⅱ 7.5, 6, 3.5, 2.9, 2, 1 根据以上结果，画出该DNA的物理图谱。 20. 什么是Western印迹？它与Southern 印迹有什么不同？ 21. 简并引物设计的一般原则是什么？ 22. 大肠杆菌在其细胞内产生核酸(DNA)限制性内切酶的意义是什么?它本身的核酸限制性内切酶对其细胞内的DNA是否作用? 23．用lmol/L的KOH溶液水解核酸，两类核酸(DNA及RNA)的水解产物是否相同? 24．分离DNA时，为什么要在缓冲液中加入一定浓度的EDTA和蔗糖? 25．PCR的基本原理是什么?用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息? 六、参考答案 （一）名词解释 1．由单核苷酸通过磷酸二酯键相连而组成的高分子化合物，称为核酸。它可以分为DNA和RNA两类。 2．核苷酸残基在核酸分子中的排列顺序就称为核酸的一级结构。 3．两条DNA单链通过碱基互补配对的原则，所形成的双螺旋。 4. 在形成双螺旋结构的过程中,由于各种碱基的大小与结构的不同，使得碱基之间的互补配对只能在G…C(或C…G)和A…T(或T…A)之间进行，这种碱基配对的规律就称为碱基配对规律(互补规律)。 5．核酸分子中除了常见的五种碱基外，还可能含有其它微量的碱基，这些碱基称为稀有碱基。由稀有碱基形成的核苷酸以及碱基与戊糖之间以非正常N—C糖苷键所形成的核苷酸都称为稀有核苷酸。 6．单核苷酸分子中的磷酸基分别与戊糖的3'-OH及5'-OH形成酯键，这种磷酸内酯的结构称为环化核苷酸或环核苷酸。 7．5'-核苷酸的磷酸基进一步磷酸化成二磷酸核苷、三磷酸核苷或更多的磷酸核苷，它们都被称为多磷酸核苷酸。 8．当核酸分子加热变性时，其在260nm处的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。 9．当加热变性了的核酸分子，在退火的条件下发生复性时，其在260nm处的紫外吸收会减少的现象称为减色效应。 10．单链RNA分子也会在分子内部形成部分双螺旋的结构，由于这种部分双螺旋的结构有些象发卡，所以把这种部分双螺旋的结构称为发卡结构。 11．当两条不同来源的DNA(或RNA)链或DNA链与RNA链之间存在互补顺序时，在一定条件下可以发生互补配对形成双螺旋分子，这种分子称为杂交分子。形成杂交分子的过程称为分子杂交。 12．当核酸分子加热变性时，其在260nm处的紫外吸收会急剧增加，当紫外吸收变化达到最大变化的半数值时，所对应的温度称为熔解温度、变性温度或用Tm值表示。 13.回文序列(palindromic sequence)是一段自我互补的序列，即同其互补链一样的序列 (两者的阅读方向都是从5′→3′)。根据回文序列的结构可分为：完全的回文序列、不完全的回文序列和间断的回文序列。完全的回文序列(GAATTC)，通常是限制性内切核酸酶的识别序列，不完全的回文序列(如TACCTCGGCGTGATA)，常是其他蛋白质的结合位点(如阻遏蛋白)，在基因表达调控中有重要作用。间断的回文序列(如GGTTXXXAACC，有一段是颠倒的重复)，它可使单链的核苷酸有可能在tRNA中见到的一样，形成发夹环的结构，间断的回文序列又称反向重复序列。 14．不同来源的限制性内切核酸酶具有相同的识别序列，产生完全相同的黏性末端，将这些酶称为同裂酶(isoschizomer)。 15.限制性物理图谱即限制性内切核酸酶作图(restrictionmapping)。简单地说就是DNA分子中限制性内切核酸酶切割位点的定位，即DNA分子中各种不同限制性内切核酸酶的酶切位点的线性排列图。即标明限制酶在DNA分子上的限制性位点的数目、限制性片段大小及其线性排列的顺序。 （二）填空题 l. RNA DNA RNA 胞液 DNA 细胞核 2. 磷酸 戊糖 碱基 β-D-核糖 β-D-2-脱氧核糖 嘌呤 嘧啶 3. A G C U T 稀有碱基 4．戊糖 嘧啶β-D-2-脱氧核糖 T β—D-核糖 U 5. AMP GMP CMP UMP dAMP dGMP dCMPdTMP 3′，5′—磷酸二酯 6；双螺旋 A＝T G＝C A+G＝C+T 7．0.53 0.25 8．9 1 1，9—糖苷键 嘌呤核苷 9．1 1 1，1—糖苷键 嘧啶核苷 10．CAMP cGMP 作为激素的第二信使 11，三磷酸腺苷 脱氧二磷酸胞苷 12．碱基 长度 低 高 高 13．C H 0 N P 磷 9％～10％ 磷 14．氢键 碱基平面间疏水堆积力(范德华力) 15．大 高 16．mRNA tRNA rRNA 合成蛋白质的模板 运输氨基酸的工具 与蛋白质结合成核糖体是合成蛋白质的场所 17.多核苷酸链 双螺旋 三叶草 18.rRNA mRNA tRNA 19．结合氨基酸 辨认密码子 20．CCA 反密码子 21．7—甲基鸟苷酸 多聚腺苷酸 22．2～4个相同的；切割位点；识别位点的；平切和交错切；平 黏性末端；Mg2+；ATP SAM 23. (1)能够在中间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对； (2)两条互补链的5′→3′的序列组成相同，即将一条链旋转180o，则两条链重叠 24．(1)溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂； (2)溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来； (3)对RNase、DNase有一定的抑制作用； (4)SDS能够与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质变性沉淀 25．(1)使蛋白质变性； (2)使核小体和核糖体解聚，提高DNA的得率 26．可以降低表面张力，从而减少气泡产生 27．(1)水解能力很强，作用范围广；(2)在SDS和EDTA中仍保持高活性，可以同SDS 和EDTA同时使用 28．螯合Mg2+离子，抑制核酸酶的活性 29．中和DNA分子的负电荷，增加DNA分子间的凝聚力 30．(1)包埋吸水法；(2)蒸发； (3)膜过滤法；(4)有机溶剂抽提法 31．-70℃ 32．只将RNA分离出来；可将DNA与RNA一起分离出来 33．(1)核酸酶降解；(2)化学降解；(3)物理剪切 34．酸变性；碱变性；热变性； 酶水解 35．抑制真菌污染的 36．dI可以同任何碱基相匹配 37．手上常有核酸酶 38. 一组混合 39．DNA溶解；作为螯合剂，抑制核酸酶的活性 40．抑制RNase； 金属离子的螯合 （三）选择题 1. D 2. B 3. B 4.B 5.B 6. A 7. C 8. D 9. C 10.D 11.A 12.A　　13.D 14.C 15.D 16.D 17.C 18．D 19.C 20.A 21.A 22.D 23.A 24.B 25. B 26. B 27．B 28．B 29．C 30．D 31．C 32. B 33．A 34．C 35. B （四）是非题 1．错 2．错 3．对 4．错 5．对 6. 错 7．错 8．对 9．错 10．错 11．错 12．错 13．对 14．对 15．错 16．对 17．错 18．错 19. 对 20．错 21．对 22．对 23．对 24．对 25．错 26．对 27．对 28． 错 29．对 30．对 31．错 32．对 33．错 34．错 35．错 36. 错 37. 对 38. 错 39.对 40. 错 41．错 42．对 43．错 44. 错 45．错 46．对 47．对 48．对 49．对 50．错 （五）问答题 1. (1) (2.5×107/650)×0.34=1.3×104nm=13μm (2)650/0.34=1.9×103/nm=1.9×106/μm (3)88×0.34nm=30nm=0.03μm (4)104×3×0.34=106nm≈0.11μm (5)(96000/120)×3×320=76800 (6)(17—15)X103/0.34=5.88×103bp 2．(1)设DNA的两条链分别为α和β，那么Aα=Tβ，Tα=Aβ， Gα=Cβ，Cα=Gβ， 因为，(Aα+Gα)/(Tα+Cα)=(Tβ+Cβ)/(Aβ+Gβ)=0.7 所以，互补链中(Aβ+Gβ)/(Tβ+Cβ)=I/0.7=1.43 (2)在整个分子中 因为，A=T，G=C， 所以，A+G=T+C，(A+G)/(T+C)=1 (3)假设同1，则 Aα+Tα=Tβ+Aβ,Gα十Cα=Cβ+Gβ， 所以 (Aα+Tα)/(Gα+Cα)=(Aβ+Tβ)/(GβCβ)=0.7 (4)(Aα+Tα+Aβ+Tβ)/(Gα+Cα+Gβ+Cβ)=2(Aα+Tα)/2(Gα+Cα)=0.7 3. (1)阳离子可以中和DNA中带负电荷的磷酸基团，减弱DNA链间的静电作用，促进两条互补的多核苷酸链的相互靠近，从而促进DNA的复性。 (2)温度升高可使DNA变性，因此温度降低到熔点以下可以促进DNA的复性。 (3)DNA链的浓度增加可以加快互补链随机碰撞的速度，从而促进DNA的复性。 4. 核酸内切酶作用于超螺旋的环状病毒DNA分子，在其中的一条链上产生“缺刻”(nick)，释放张力，则超螺旋转变为松弛态。线形DNA分子只有当两端都被固定时，才能产生超螺旋。 5. 组蛋白与DNA之间的结合依靠的是组蛋白带正电的碱性基团与DNA带负电荷的磷酸基团之间的静电引力，如果用稀酸处理复合物，则磷酸基团质子化而失去所带的负电荷，复合物解离。如果用高盐溶液处理复合物，则阳离子与磷酸基团结合而取代了组蛋白，导致组蛋白与DNA解离。 6. 目的是保护酶活性，机理是通过提高溶液中蛋白质的浓度，防止酶失活。 7. 某些噬菌体的基因组中有修饰的碱基，因此对限制性内切核酸酶具有免疫作用。另一种避免限制酶切割的途径是抑制SAMase的活性，该酶制造S—腺苷甲硫氨酸，某些限制酶作用时需要S—腺苷甲硫氨酸。然而，噬菌体在发育过程中不能同某些单碳的供体反应。 8. GATATC；AAATTT，因为它们是回文序列。 9. 注意星号活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星号活性。或使用通用缓冲液。 10. Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星号活性。概括起来，诱发星号活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5％，v／v)；(2)限制性内切核酸酶用量过高（100U/μg DNA）；(3)低离子强度(<25：mmol／L)；(4)高pH(8.0以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，CO2+，Zn2+等)。 11. (1)首先是稳定性：保持DNA的高分子量和原有的构型。 (2)低蛋白质含量。 (3)DNA样品中应不含RNA (4)不含可透析的小分子 12. (1)细胞内存在很高的核酸酶活性,DNA裸露后，很容易遭到核酸酶的降解； (2)在分离DNA的过程中，要用到一些酸碱等化学试剂，也会使DNA断裂； (3)在DNA的分离过程中要经过多次离心、吸取、转移等，产生的机械张力剪切会使DNA断裂。 13. 由于苯酚呈酸性，并且常常会氧化产生自由基，直接用于DNA的分离，会使DNA遭到破坏，所以，用前需要重蒸除去氧化物，然后用Tris-HCl饱和酚，并调整pH到中性。用缓冲液饱和酚还有第二个作用，就是防止酚吸收更多的DNA溶液，降低DNA的损失率。 14. 因为苯酚与空气接触氧化成粉红色的醌。苯酚氧化生成的醌能够形成游离的自由基，这种自由基能够引起磷酸二酯键的断裂，造成DNA降解。氧化的苯酚须经高温重蒸以除去氧化物，并且在重蒸后的酚中添加抗氧化剂，β—巯基乙醇和8—羟基喹啉，浓度只需0．1％。重蒸酚能够用锡箔纸包起来避光保存在低温下。 15. 原因是酚和水有一定程度的互溶，所以单独使用酚抽提DNA，最终不能除去酚，残留的酚会使起切割和连接作用的限制性内切核酸酶和连接酶变性。氯仿也是蛋白变性剂，它不与水互溶，但是能够同苯酚互溶，这样，酚和氯仿联合使用，就可以带走残留的酚。 16. 所谓简并引物是指根据肽链的氨基酸序列(或部分序列)，并充分考虑密码子的简并性而设计的、用于PCR扩增的混合引物群体，这种混合引物之间具有不同的碱基组成，但碱基的数量是相同的。由于充分考虑了密码的简并性，在这种混合引物中必定有一种引物是可以和该基因的DNA序列精确互补。 17. 双脱氧的核苷酸是人造的分子，这种分子糖环的2’和3’碳上都没有了羟基基团，而在天然分子中糖环的3’碳上有一个羟基。在DNA复制中，新掺人的碱基按配对原则是天然三磷酸核苷酸，用它的5'-P同生长链的前一个核苷酸的3’羟基连接。但是，若进入的核苷酸是双脱氧的，则由于3’没有羟基而影响下一个磷酸二酯键的形成，使DNA的复制终止。 18. 限制性内切核酸酶分为三类，重组DNA技术的限制性内切核酸酶为Ⅱ类。其特点为：①识别DNA位点的核苷酸序列呈二元旋转对称即回文结构(palindrome)。②一些酶切割后产生粘性末端(sticky end ), 另一些酶切割后产生平端或钝性末端(blunt end)。③不同的限制性内切核酸酶识别DNA中的核苷酸长短不一，为4、6或8个。 19. 在双酶切时，有三个片段(7.5，2.9和6Kb)没有被切成更小的片段，这说明它们内部没有其他酶的切点(如7.5Kb BamH I片段内无Bgl Ⅱ切点)。用Bgl Ⅱ消化产生3个片段说明整个DNA分子上具有2个Bgl Ⅱ切点，同样可以推断DNA上还有3个BamH I切点。13和3.9Kb Bgl Ⅱ酶切片段在双酶切后消失了，这说明这两个片段内部具有BamH I切点。而2.9Kb与lKb之和为3.9Kb，这提示3.9Kb的Bgl Ⅱ酶切片段内有一个BamH I切点。2Kb，7.5Kb与3.5Kb之和为13Kb则说明13Kb的Bgl Ⅱ酶切片段内含有2个BamH I切点。此外，3.5Kb与lKb之和为4.5Kb则说明4.5Kb的BamH Ⅰ酶切片段内含有一个Bgl Ⅱ切点。综合以上结果，原来的线形DNA的物理图谱为： 20. Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。 21. (1)选择保守区设计简并引物； (2)选择简并性低的氨基酸密码区设计引物； (3)注意密码的偏爱性； (4)使用尽可能短的引物，以降低简并性，最短可用15～20个碱基。 (5)由于TaqDNA聚合酶在PCR扩增时容易掺人错误碱基，所以设计的引物，其3'端尽量使用具有简并密码的氨基酸。 22. 大肠杆菌产生核酸限制性内切酶是为了水解破坏外源的DNA，而大肠杆菌本身的DNA已经被甲基化修饰，所以不被其本身的核酸限制性内切酶所水解。 23. 不同。RNA可以被水解成单核苷酸，而DNA分子中的的脱氧核糖2'碳原子上没有羟基，所以DNA不被碱水解。 24. (1)EDTA是螯合剂，可同Mg2+离子螯合，使核酸酶失去了作用的辅助因子，而被抑制活性； (2)蔗糖增加缓冲液的黏度，保护DNA不易断裂。 25. (1)DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。 (2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。 � EMBED Photoshop.Image.6 \s ��� PAGE 27 _1104775211.unknown