免疫荧光

靓靓的免疫荧光，照亮你的Paper！小伙伴们，有没有一个时刻，静静的看着人家paper里的免疫荧光图片，感觉好高大上啊，好想拥有这个技术，然后也能在科研道路上来一道zhuangbility。看看小弟我的实力发挥，当然我今天来不仅仅是炫的，还带着秘籍来的哦！小弟我是做心肌相关的，上面的细胞也是心肌细胞，一般为了更好的观察每个心肌细胞，需要低密度将心肌细胞培养在四孔板M4中（孔的大小和24孔板一样），每孔75000个细胞，俺的细胞不增殖，所以你增殖的细胞咋么铺，跟着感觉来吧。另需配置免疫荧光专用的封闭液BS(Blockingsolution)，配好后放冰上凉着：封闭液组分 Horseserum 0.6ml 2% Triton-100 30ul 0.1% BSA 0.6g 2% TotalVolume V=30ml(inPBS)固定细胞：细胞处理后，弃去培养基，用冷的PBS洗2次，使用4%的多聚甲醛(PFA)室温孵育30min，或者使用-20℃的冷冻甲醇（提前一天冻起来，不然你会发现做完后细胞都没了）孵育5min，摇床轻摇以固定细胞，然后用PBS洗2次。透化（染胞内蛋白）及封闭：Triton-100的作用是轻微破损细胞膜，使用500ulBS/孔室温封闭1h，摇床轻微振荡。(1)孵育一抗：α-actinin（图里面的红色）和目的蛋白（绿滴）一抗按1:1000稀释到BS中，每孔250ul，室温孵育2h，摇床轻微振荡。之后弃去一抗，用BS洗2次，每次10min。孵育二抗：从这一步开始，之后的所有步骤均需避光操作，咋避光？不知道各位大神实验室有没有那种古老的铝制饭盒，板子就放那个里面就行。荧光二抗(Anti-rabbit/mouse)以1:1000稀释于BS中，EP管用锡箔纸包上以避光。每孔加250ul，摇床轻摇孵育1h。之后弃去二抗，用BS洗3次，每次5min。核染：Hoeschst33342以1:200稀释于BS中，每孔加250ul，摇床轻摇孵育30min。之后弃去Hoeschst稀释液，PBS洗3次。封片：为防止荧光猝灭，在每孔中滴加一滴放荧光猝灭剂，有钱的买进口的，中产的买国产的，没钱的就及时拍照就行了（是不是没钱的就不用做了？表打我…），并用盖玻片封片。M4置于铝盒中，避光保存于4℃，24h后使用倒置荧光显微镜观察。跟着这个做，保准做的出来的，最关键的问就是抗体，不用我多说了吧！反正我用的一抗是CST的，二抗是life的（如果有广告嫌疑，就删了吧）。干货看着爽不爽，6不6，赞不赞！好啦，喜欢的老铁双击点赞评论666走一波啦！