金银花叶中木犀草素的分离与鉴定.doc

金银花叶中木犀草素的分离与鉴定.doc 金银花叶中木犀草素的分离与鉴定 【摘要】 目的建立一种可以从金银花叶中分离出木犀草素的方法。方法采用超声提取，石油醚回流脱色、大孔树脂柱和聚酰胺柱分离相结合的方法，通过薄层色谱、紫外光谱、红外光谱、高效液相色谱进行鉴定，最终得到木犀草素产品。结果此产品纯度最高可达81.6%，得率为28.9 μg?g-1。结论建立了从金银花叶中分离木犀草素的新工艺。 【关键词】 金银花叶; 木犀草素; 分离 ; 鉴定 金银花是名贵中药材，含有多种有效成分，木犀草素作为一种黄酮单体，具有抗炎、抗菌、抗癌、抑酶、抗氧化、利胆利尿等多种作用，金银花叶作为金银花的一种副产物，产量较大，而且常常被浪费掉，研究明，金银花叶中木犀草素的含量平均是花中的2.8倍[1，2]，但目前对于金银花叶中木犀草素的研究仅限于含量测定，对于木犀草素产品的分离、纯化还未见报道。本文采用超声提取，石油醚回流脱色、大孔树脂柱和聚酰胺柱分离相结合的方法从金银花叶中分离出了黄酮单体木犀草素，并结合聚酰胺薄层色谱、红外光谱、紫外光谱、高效液相色谱等方法对分离后得到的木犀草素产品进行定性鉴定和定量分析，其纯度最高可达81.6%，得率为28.9 μg?g-1。 1 仪器与材料 紫外-可见分光光度计UV-2450 (日本岛津公司);电子分析天平;旋转蒸发器RE-52AA(上海亚荣生化仪器厂); Agilent 1100型高效液相色谱仪，红外光谱仪FTIR-8400S(日本岛津公司)，紫外灯。聚酰胺粉(80-100目)，木犀草素标准品(购于北京丰斯特公司)，工业酒精，其它试剂均为分析纯。 2 方法 2.1 木犀草素含量测定精密吸取0.100 mg/ml木犀草素对照品溶液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 ml于10 ml容量瓶中，用流动相(甲醇:0.02%磷酸 = 50 : 50)定容至刻度，选择色谱柱为ZORBAXSB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent公司);以甲醇:0.02%磷酸 = 50?50为流动相;在波长350 nm，柱温 30?;流速为1.0 ml/min的条件下进样20.0 μl。记录峰面积，得直线回归方程为Y=33 578.22C -11.807(Y代表峰面积，C代表木犀草素浓度mg/ml)，R2=0.999 7;木犀草素在0.02,0.1 mg/ml范围内呈良好的线性关系。 2.2 上柱样品的制备用20倍量的50% 乙醇超声浸提黄酮后，将提取液浓缩，然后按照质量比(金银花叶和聚酰胺粉的质量)为15?1的比例混入聚酰胺(80,100目)粉，使其保持松散，不结块，将此固体粉末取出，放在索氏提取器中用石油醚回流脱色10次后， 取出此固体粉末，挥干石油醚，即得黄酮粗品拌料，然后经过物料比(黄酮粗品拌料与大孔树脂质量比)为1?6，柱径与柱长比为1?6的HPD100型大孔树脂柱进一步分离富集，先用2倍柱体积的蒸馏水洗掉蛋白和糖类等大分子杂质，再用70%的乙醇以最大流速洗脱，收集2,8倍柱体积的洗脱液，浓缩后得到样品。 2.3 聚酰胺柱的装填把一定量的聚酰胺用水浸泡24 h，湿法装柱，然后用甲醇以3 BV/h的流速洗涤聚酰胺，至流出液澄清为至，再用蒸馏水洗至无甲醇。 2.4 木犀草素产品的分离纯化样品上柱后开始洗脱，先用水洗去糖、蛋白分子及其它水溶性杂质，然后采用30%，50%，70%的醇溶液梯度洗脱，采用30%和50%的醇梯度洗脱时，柱中开始有淡粉色和黄色色带出现，随着洗脱的进行，淡粉色色带变得模糊，黄色色带开始缓慢下移。当两个色带拉开一段距离后，改用70%的醇洗脱，黄色色带下移的速度加快，收集此色带从开始到流完的洗脱液，每50 ml一接，记为1,9瓶。 以醋酸乙酯?乙酸?水=1?1?1为聚酰胺薄层色谱展开剂，对1,9瓶的洗脱液初步检验，发现薄层板上呈现单点，而且此点的Rf值和木犀草素标准点的Rf值相同。然后每3瓶一合并，蒸干即可得到3个不同纯度的木犀草素产品，记为1号，2号，3号。用甲醇对1号，2号，3号进行重结晶，得到木犀草素产品1，2，3。 3 结果 对1号、2号、3号木犀草素产品进行定性鉴定和定量分析。 3.1 定性分析 3.1.1 颜色反应 分别取3个等级的少量产品溶解在甲醇中，得到的溶液滴于滤纸上，在紫外灯下呈现深紫色，用氨水熏后，在紫外灯下观察，呈现黄色，这和木犀草素标准品的斑点显色一致。 3.1.2 高效液相色谱法的鉴定 把上述得到的木犀草素产品用“2.1”项的流动相溶解，定容至25 ml容量瓶中，对此溶液在“2.1”项条件下进行高效液相色谱分析(以产品2为例进行说明)，发现: ?整个过程中，产品色谱图呈现单峰，而且此峰的保留时间和木犀草素标准品的保留时间一致，均为Rt=13.1min 。?改变流动相，产品色谱峰的保留时间提早或者推后，并没有发生拆分;?改变检测波长为255，267，350 nm，产品色谱峰没有被拆分; ?加入标准品木犀草素于产品溶液中，产品中加标前后的色谱图如图1,2，结果发现，产品加标后的色谱峰保留时间不变(和标准品的一致)，只是峰增强了。图1 产品色谱图图2 产品加标后色谱图由以上色谱峰可见，此类产品中木犀草素的纯度较高。3.1.3 紫外图谱法采用标准品木犀草素(结构如图3)和样品对照的方法进行紫外图谱[3]鉴定。使用 的移动剂为无水醋酸钠和无水粉状硼酸(均为AR级)，在醋酸钠存在下，硼酸能和黄酮体母核上所有邻位二羟基螯合，生成络合物，使得紫外光谱发生红移。在醋酸钠/硼酸存在下，B环有邻位二羟基的黄酮及黄酮醇的带?向长波移动12,30毫微米。移动剂的使用程序如下。?将产品的甲醇溶液在190,550mn 波长范围内进行紫外扫描，得到其吸收光谱图。测完之后，再进行移动剂光谱的测定。?将粉末状NaOAc直接加入到吸收池内新换的产品的甲醇溶液中，直到池底出现2 mm厚的NaOAc沉淀为止，摇匀测定液，测定。?测定完NaOAc图谱后，直接往吸收池中加入H3BO3(加入量大约为NaOAc的一半)，混合均匀后测定NaOAc/ H3BO3图谱。结果如图4,7所示:图3 木犀草素结构图图4 产品加入移动剂前后的UV图谱由图4所示，产品甲醇溶液的紫外图谱中带I的λmax=346 nm，带II的λmax=256 nm，具有黄酮结构的两个特征谱带，加入醋酸钠后，产品的紫外光谱带II红移了18 nm，说明此化合物含有游离的7羟基，在醋酸钠/硼酸存在下，产品的紫外光谱带I红移了20 nm，据此说明此化合物B环有邻位二羟基，即3’,4’-二羟基存在，而且从图5，6，7也发现，它和标准品的色谱峰重合的相对较好，是纯度较高的木犀草素产品。图5 标品和产品的UV图谱图6 标品和产品中加入醋酸钠后的UV图谱 3.1.4 红外图谱法分别取产品2和标准品的固体粉末0.5,2 mg，在玛瑙研钵中研细，再加入100,200 mg磨细干燥的KBr粉末，混合均匀后，加入压膜内，在压力机中边抽气边加压，制成一定直径及厚度的透明片，然后将此薄片放入仪器光束中测定，得到的谱图如图8所示。图7 标品和产品中加入醋酸钠和硼酸后的UV图谱图8 样品的IR图谱 通过比较标品和产品的IR图谱发现，它们吻合的较好，其中在3 380，3 294 cm-1为羟基吸收峰，1671 cm-1为羰基吸收峰，1 613，1 554，1 521 cm-1为苯环碳骨架吸收峰。 3.2 定量分析运用高效液相色谱法对3个产品1号，2号，3号进行定量分析。分别称取一定量的3种产品，用“2.1”中的流动相(甲醇:0.02%磷酸 = 50 : 50)溶解定容后，在“2.1”色谱条件下测其峰面积，对照测定木犀草素标准曲线，按照外标法测定其中木犀草素的量，然后分别计算产品中木犀草素纯度和产品得率，公式如式?和?所示。结果见表1。产品中木犀草素纯度(%)=产品的质量产品中木犀草素质量×100% 式 ?产品得率=产品质量金银花针的质量 式 ?表1 聚酰胺柱分离后的产品 4 讨论 本实验采用聚酰胺柱[4，5]进一步分离，聚酰胺分子中含有极性酰胺基团和非极性的脂肪键。作为一个相对弱极性的化合物，当 移动相为强极性的溶剂(如水等)时，聚酰胺作为非极性固定相，其层析行为类似反相分配层析，极性较大的吸附物易被洗脱。随着洗脱剂极性降低，极性较小的化合物相继被洗脱下来。所以，利用聚酰胺作为层析柱填料，可使一定极性范围的某类物质得以分离精制。 采用聚酰胺柱进行分离，尝试采用70%的乙醇等度洗脱，发现柱中没有出现明显的色带，收集洗脱液，用聚酰胺薄层跟踪分析，发现薄层板上呈自上而下的一系列点，无木犀草素的单点出现。洗脱剂选择不合适，洗脱能力可能过强，把木犀草素和其它物质一起冲下来， 没有达到分离的目的。接着使用洗脱能力稍微弱一些的50%的乙醇作为洗脱剂等度洗脱，洗脱时间加长，但是仍然不能把木犀草素和其它杂质分离开来，由上可见，在聚酰胺柱上采用等度洗脱不适用。 【