大蓟总黄酮对荷瘤小鼠白细胞介素1和白细胞介素2的影响【精品分享】

大蓟总黄酮对荷瘤小鼠白细胞介素1和白细胞介素2的影响【精品分享】 大蓟总黄酮对荷瘤小鼠白细胞介素 1和白细胞 介素 2的影响 作者,刘素君周泽斌,胡霞,张杰 【摘要】 目的在分子水平上探讨大蓟总黄酮的抗肿瘤机制,主要研究大 蓟总黄酮对荷瘤小鼠白介素1 (IL 1)和白介素2 (TL 2)的影响。方法 通过RT-PCR方法半定量检测肿瘤小鼠细胞产生IL 1 mRNA和IL 2 mRNA的量 来研究大蓟总黄酮能否促进肿瘤小鼠细胞产生IL lmR\A和1L. 2 miWA。结 果大蓟总黄酮能够极为显著地提高肿瘤小鼠细胞产生IL 1和II. 2的转录水 平,P<0.01)。结论大蓟总黄酮能明显地促进肿瘤小鼠丨丨,1和IL 2 ml八八 的达。 【关键词】大蓟总黄酮白细胞介素1白细胞介素2 Abstract:Objectiveln order to further exploit the anti-tumor mechanism of total flavones in Cirsium japonicum DC at molecular level, the effects of the total flavones on the interleukin 1 (1丨> 1) and interleukin 2 (IL 2) in the tumor-bearing mice were studied. MethodsThe TL ImRNA and TL-2mRNA detected in the spleen cells and abdominal cells of the tumor-bearing mice by highly sensitive RT-PCR technology. ResultsThe total flavones in Cirsium japonicum DC could enhance the expression of IL 1 and IL 2 mRNA (P<0.01) .ConclusionThis study suggested that the total flavones in Ci rsjum japonicum DC can enhance the expression of II, 1 and IL 2 mRNA. Key words:The total flavones in Cirsium japonicum DC, IL 1, IL 2 大蓟为菊科管状花亚科菜蓟族蓟属植物Cirsium jiaponicum DC.的干燥地 上部分或根[1],我国各地均产。大蓟性凉,味甘、苦,归心、肝经,功效为 凉血止血、祛淤止痛。大蓟的主耍成分为黄酮类化合物,文献报道其多聚乙炔 具有抗肿瘤作用[2]。其总黄酮在体内有抗肿瘤作用并能提高肿瘤小鼠的免疫 功能[3]。 细胞因子是具有免疫调节作用的一类重要蛋白质物质。许多中药可以通过 激活单核巨噬细胞系统,诱生多种细胞因子(如促进干扰素生成,促进白细胞 介素生成,诱生肿瘤坏死因子等)来增强动物免疫功能。白细胞介素(IL)能活化 B细胞、巨噬细胞、NK细胞,近年来研究发现许多中药都有促进细胞因子产生的 作用。例如枸杞子能促进老年小鼠产生IL-2;中华猕猴桃提取物能使小鼠脾细 胞培养上清液中IL-2活性明显升高,黄芪多糖能使大黄脾虚模型小鼠低下的 IL-2活性升高,而对正常小鼠无影响,青蒿素抑制IL-2的产生,银耳多糖高 浓度时则降低小鼠脾细胞培养液中的IL-2的活性[4]。一般来说,细胞中某 种mRNA的数量是其编码基因活性的直接反映。所以某种mRNA的定量是随着在 不同的时空状态下编码基因表达活性的变化而有所不同。RT PCR具有很高的 敏感性[5, 6],可以用来分析不同的组织、或相同组织不同发育阶段中mRNA 表达状况的相关性。 1器材与方法 1.1供试动物 ,雌雄各半,由四川中药研究所提供 昆明种标准小鼠,体重,21?2) g BalB/C纯种小鼠,体重,20?2) g,雌雄各半,由成都中医药大学动物中心提 供C57BL/6J纯种小鼠,体重,20?2) g,雌雄各半,由成都中医药大学动物中 心提供。 1.2大蓟总黄酮的制备 将大蓟70%乙醇提取物与硅藻土拌样挥干后,装入玻璃管柱中,用石油醚流 洗,去除其中的叶绿素和极性较小的成分,流洗结束后倒出硅藻土化合物,挥干 溶剂重新装入玻璃管柱,正丁醇流洗提取,用1%三氯化铝乙醇溶液与黄酮类化 合物在滤纸上显色后,在紫外灯下观察有无黄绿色荧光的方法检测监控,提取 至流洗液无黄酮反应时结束,将正丁醇提取液浓缩后挥干溶剂,用少量95%的 乙醇溶解后上聚酰胺树脂柱,依次用水和95%的乙醇洗脱,收集95%的乙醇洗脱 液,洗脱至检测无黄酮反应时结束,浓缩95%的乙醇洗脱液,自然干燥,挥干 溶剂后得到的成分即为总黄酮成分。紫外分光光度测定其总黄酮含量为98.52%。 1.3试剂mil 1640 (GIBCO公司,,胎牛血清,HyClone公司,,小牛血清,HyClone公 司,,Heper’s (HyClone 公司,,台船?蓝,MTT,LPS,SDS, ConA,琼脂糖均 为Sigma公司,KPM1 1640培养液,谷氨酰胺,青霉素,庆大霉素,Tris Base, a甲基甘露糖苷，a mm)。 1.4仪器 酶标仪,Bio-Rad, Model 3550),离心机,北京医用离心机厂, l>l)Z5 2),倒置显微镜(Nikon DHAPHOT h'x 35DX) , 二氧化碳细胞培养箱 (BNA 311,ESPEC),电子恒温水浴锅,l)K 98 1),微量高速离心机 (Jouan),三恒电泳仪,ECP3000,北京市六一仪器厂,。 2方法 2.1造模方法昆明种小鼠,40只,体重18?22g,雌雄各半,随机分为空 白组、模型组、大蓟黄酮+模型组。空白组和模型组用生理盐水0.2 ml/10 g 体重灌胃,大蓟总黄酮+模型组用大蓟总黄酮0.2 ml/10 g体重灌胃,剂量为 50 mg/kg, 1次/d,连续10 d。第8天模型组和大蓟黄酮+模型组腹腔注射环 憐酰胺 55 mg/kg, 0. 1 ml/10 g,连续 3 d。 2. 2大蓟黄酮对小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的影响 2.2.1 IL 1样品的制备供试小鼠以颈椎脱臼法处死,75%乙醇浸泡5 min, >用预冷的I) Hank s液5 ml注射入小鼠腹腔,轻揉数10次,充分洗出腹腔细 胞,2 000 r/min离心10 min,用RPMI-1640培养液洗涤两次,用含5%小牛血 清的丨?1>\11 1640调细胞数至2X 106/ml加入24孔细胞培养板中贴壁2 h。弃 上清液,洗涤细胞,去除非粘附性细胞。加入10 M g/ml的LPS和含10%小牛 血清的RPMI-1640培养液,在37?C, 5%C02潮湿大气中温育48h;收集上清液, -20?C保存,即为IL 1待测样品,收集细胞,提取RNA。 2.2.2 TI- 1样品的检测以C57BL/6J纯种小鼠胸腺细胞作为检测IL 1 的靶细胞。。供试小鼠以颈椎脱曰法处死,无菌取胸腺,用灭菌玻璃注射器芯 挤压过200目钢丝网,2 000 r/min离心10 min,洗涤两次,台朌蓝染色,计 活细胞数,用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调至IX 106/ml,将细胞悬液 加入96孔细胞培养板,每孔100m 1 (IX 105个细胞)o用RPMI-1640培养液 以1/4, 1/8,1/32比例稀释IL-1待测样品,每孔加50m 1稀释液,每个稀释 度设3个复孔。每孔加入亚剂量有丝分裂原ConA至终浓度为2 g/ml。每孔总 M容量为200 |J 1。在37?C,5%C02潮湿大气中培养48 h。用MTT比色法测定结 果。 2.3大蓟总黄酮对小鼠脾淋巴细胞产生1L 2的影响 2.3.1 IL 2样品的制备供试小鼠以颈椎脱臼法处死,75%乙醇浸泡5 min, 无菌取脾,用RPMT 1610培养液洗涤,在200目钢丝网上剪碎,用灭菌玻璃注 射芯轻磨、过滤,分别制成脾细胞悬液,,).《3%Trhs NII4CI破坏红细胞,冰浴 静置10 min, 2 000 r/min离心10 min,用RPMI-1640培养液洗涤细胞两次, 经台朌蓝染色测定细胞活率大于95%。再以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液 制成IX 107/ml脾淋巴细胞悬液,加Con A5 |J g/ml,培养于24孔细胞培养板, 在5%C02潮湿大气中37?C温育24 h;离心收集上清液,-2(TC保存,即为 TL 2待测样品。收集细胞,提取RNA。 2.3.2 1L 2检测细胞的制备BalB/C小鼠以颈椎脱臼法处死,75%乙醇浸 泡5min,无菌取脾,用RPMI-1640培养液洗涤,在200目钢丝网上剪碎,用 灭菌玻璃注射芯轻磨、过滤,制成脾细胞悬液,0. 83%Tris-NH4Cl破坏红细胞, 冰浴静置10 min, 2 000 r/min离心10 min,用RPMI-1640培养液洗涤细胞两 次,经台朌蓝染色测定细胞活率大丁• 95%。再以含10%胎牛血清的RPMI-1640培 养液制成5X 106/ml脾淋巴细胞悬液,加ConA 2. 5 M g/ml,置25 ml的细胞 培养瓶中温育96 h。细胞用10 mg/ml a_甲基甘露糖苗(a-mm)的Hank’s液洗 两次,含10%胎牛血清的RPMT IM0培养液洗1次,调节细胞浓度为 IX 106/ml,作为测定IL 2的反应靶细胞。 2.3.3 IL 2样品的检测取-20?C保存的各组IL-2上清液,均作1/4,1/8, 和1/32稀释,分别用ConA活化的小鼠脾淋巴细胞测定其IL 2水平。即在96 孔细胞培养板中,每孔加反应细胞0.1 ml (IX 105个,和等量稀释后的TL 2 上清液,每样均设3个复孔。每孔加100 mg/ml的a甲基甘露糖苷,a-mm) 20 |J lo在37?C, 5%C02潮湿大气中温育48h。用MTT比色法测定结果。 2.4 MTT法测定细胞数丁•细胞培养结束前5 h每孔弃去培养上清100 M 1, 加入浓度为5 mg/ml的MTT 10 |J 1 (用生理盐水配制,过滤除菌,。培养结束 后,每孔加10%SDS (用0.01 M的HC1配置，100 |J 1,振荡混匀,37?C下4 h, 用酶标仪在570 nm处读取0D值。 2. 5 RNA提取按试剂盒说明进行操作。 2. 6引物从NCBI获得相关产物的mRNA序列,使用Primer Primier5 软件设计引物。 IL 1:为 IL-la 链序列。上游,5’ TCG TGG AAT GTG GAT GGT 3’,退火 温度 53.81,。下游,3’ CM AGA ACA AAG TCG GGT 5’,退火温度 50.9?C。产 物长度:420 bp。 II- 2,上游,5’ TGG GAA CGA TTA GTG AGG 3’,退火温度 50. 6?C。卜•游: 3’ AAA GGG CTC TGA CAA CAC 5’,退火温度 51.2?C。产物长度:454 bp。 内标引物 P aclin,上游,5’ GTA AAG ACC TCT ATG CCA ACA 3’,退火 温度 52. 3?C。下游,3’ CAC CAA TGT CCT TCA GGG AG 5’,退火温度 53.2 ?C。 产物长度:624 bp。 0. 7 RT-PCR按试剂盒说明操作。 2.8 统计方法实验所得数据用?s表示,各组数据间的差异用t检验判 断其统计学意义。 3结果 3.1大蓟总黄酮对小鼠腹腔巨噬细胞产生IL_1的影响结果见表1。从表 1中可以看出,剂量为100 mg/ml的大蓟总黄酮与模型组相比其腹腔巨噬细胞 产生1L 1的能力差异极显著。表1大蓟总黄酮对肿瘤小鼠腹腔巨噬细胞产 生TL I的影响,略, 3.2大蓟总黄酮对肿瘤小鼠脾淋巴细胞产生1L 2的影响 结果见表2。从表2中可以看出,空白组和模型组小鼠灌胃大蓟黄酮药液 后,脾淋巴细胞产生1L 2的能力有较大的提高。100 mg/ml实验组与模型组 相比差异极显著。表2大蓟黄酮对肿瘤小鼠脾淋巴细胞产生IL 2的影响 (略, 3.3 RNA提取结果分析 RNA提取结果见图1,从图1可以看到,总RNA在电泳条件下看不见有基因 组DNA和蛋白质的污染,23S核糖体RNA与18S核糖体RNA的带型比较清晰, 无拖尾现象,两条带的亮度比基本上呈现2 : 1的关系,由此说明此RNA完整性 比较。 3.4 对IL 1和1L 2基因表达的RT PCR分析 通过目标基因扩增条带亮度与内标基因P act in扩增条带亮度的比值可 以了解目标基因表达情况,比值越大则目标基因表达量相对越大,因此通过对 该比值的分析可以判断大蓟总黄酮是否可提高小鼠细胞IL 1和IL 2基因表 达水平。细胞TI, 1和TL 2基因表达情况见图2,从图2 (A,B)中可以看出, 基因扩增产物大小约为 P act in基因扩增产物大小约为650 bp左右,IL-1 400 bp左右,1L基因扩增产物大小约为450 bp左右,均与引物设计时预期 产物大小近似。1L 1和1L 2基因扩增条带光密度与(3-actin基因扩增条带 亮度通过syngene软件分析。结果见表3。从表3可以_出,土s检验,IL 1 和TL 2基因与空白组比较差异显著,表明大蓟总黄酮对肿瘤小鼠细胞IL 1 和TL 2基因表达水平有显著提高。表3目标基因扩增条带与p acLin基 因扩增条带亮度比值,略, 4讨论 IL-1是由多种细胞产生、有多方面生物学功能的高活性细胞因子,是一种 对机体免疫功能有影响的细胞因子。IL一2是15-17. 2 kDa的糖蛋白,主要由T 细胞,CD4+和CD8+)和大颗粒淋巴细胞,LGL),包括NK细胞和LAK细胞产生 的,在抗肿瘤方面有着重要的作用。 本研究结果证明大蓟总黄酮能够促进肿瘤小鼠细胞中IL-1,IL-2基因的转 录作用。这一结果与我们先前得到的大蓟总黄酮能够促进小鼠细胞分泌IL-1和 IL-2的结果是一致的。 分别提取给药组和空白组小鼠的总RNA,通过RT-PCR方法半定量检测大蓟 总黄酮对IL-1 mRNA和IL-2 mRNA生成的影响。研究发现,总RNA在电泳条件 下看不见有基因组DNA和蛋白质的污染,23S核糖体RNA与18S核糖体RNA的 带型比较清晰,无拖尾现象,两条带的亮度比基本上呈现2: 1的关系,表明此 RNA完整性比较好。通过目标基因扩增条带亮度与内标基因(3 -actin扩增条带 亮度的比值可以了解目标基因表达情况,比值越大则目标基因表达量相对越大, 因此,通过对该比值的分析可以判断大蓟总黄酮可提高小鼠细胞IL-1和IL-2 基因表达水平。P-actin基因扩增产物大小约为650 bp左右,IL-1基因扩增 产物大小约为400 bp左右,IL-2基因扩增产物大小约为450 bp左右,均与引 物设计时预期产物大小近似。以上研究可以确定大蓟总黄酮能够极为显著地促 进肿瘤小鼠细胞产生IL-1 mRNA和IL-2mRNA。 【参考文献】 [1]国家药典委员会,中国药典,I部[S].北京,化学工业出版社, 1995. [2] Takaishi, Y. T. Okuyama, A. Masuda, K. Nakano, K. Murakami and T. Tomimatsu, Acetylenes from Cirsium japonicum. Phytochemistry, 1990, 29, 3849. [3] Sujun Liu, Xun Luo, Daxu Li, et al , Tumor inhibition and improved immunity in mice treated with flavone from Cirsium japonicum DC [J] . International Immunopharmaco1ogy, 2006, 6, 1387. [4] 潘菊芬.甘草黄芩免疫学调节作用的体外试验[J].天津医药,1991, 19, 468. [5] K ruseN, PetteM, Toyka K et al. Quantification of cytokine mRNA expression by RT-PCR in samples of previously frozen blood [J] . Jimmunol Methods, 1997, 210(2):1952203. [6] Housseau F, Lindsey KR, Oberholtzer SD et al. Quantitative real-time RT-PCR as a method for monitoing T lymphocytere activity to full length tyrosinase protein in vaccinated melanoma patients [J] . JlmmunolMethods, 2002, 266(122), 872103.