2006 负载hTERT复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

2006 负载hTERT复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定 本文由lingcong_008贡献 pdf文档可能在WAP端浏览体验不佳。建议您优先选择TXT，或下载源文件到本机查看。 第四军医大学学报 # $%&’() *+, *-. /0+1) ( 2334;( 6) )((8: 9 :%&’0;,< =>>&< -.&< ?0 25 7 9 "! 研究原著? 文章编号: !"""#$%&" $""’) ( "!#""()#"* 负载 !"#$" 复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定 陈+ 陵， 向国春， 李向红， 蔡永国， 李晶晶， 房殿春， 罗元辉， 李志宏， 杨仕 明 ( 第三军医大学西南医院全军消化中心， 重庆 *"""), ) !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! %&’(&)* &+, -,*+.-/-’&.-0+ 0/ 1*23-’&4 .-0+4,*/-’-*+. 1*’056-+&+. &,*+07-189 *:21*99-0+ 7*’.01 0/ !"#$" !"#$ %&’(，)*+$, ,-./!0-’，%* )&1’(/".’(，!+* 2.’(/,-.， %* 3&’/3&’，4+$, 5&1’/!0-’，%67 2-1’/"-&，%* 80&/".’(， 2+$, 90&/:&’( >?@ A35BC;47B/5B4730 D/7B/C， E;FB6G/5B H;5I4B30，.64CJ K404B3C9 K/J4<30 L74M/C54B9，D6;78N478 *"""),，D6473 【 ;69.1&’.】;<=:.; <;75BCF?@A:.6/ 6.1R. 8/7/ G35 <0;7/J 3B B6/ J;G75BC/32 ;O DKS IC;2;B/C ;O B6/ 3J/7;M4C30 56FBB0/ I03524J ITD)!( 47 5/75/ J4C/DR <;#32I04O4<3B4;7$#ABC"A:@OB/C IFC4O4<3B4;7 37J <;7<47BC3B4;7，B6/ B4B/C ;O @J# 6.1R. C/3<6/J ( W !" !$ IOF X ?- S4CF5 I3CB4<0/5 <;F0J P/ O;F7J 47 H1U $&) DR 双引 物鉴定 @J#6.1R. 可扩增出 @J 及 6.1R. 特 异片段， 而对照则不能扩出 6.1R. 片段- 结 论:成功构建了 负载 6.1R. 基因的复制缺陷型腺病毒【 关键词】人端粒酶逆转录酶; 腺 病毒表达载体 【 中图号】Z%(’; Z%()+ + + 【 文献标识码】@ IJ 引言 人端 粒 酶 逆 转 录 酶 6F237 B/0;2/C35/ C/M/C5/ ( BC375，>03524J >FC4O4<3B4;7 U4B( >C;2/83 公司) ; TA?$""" TY@ K3C]/C( 北 京 鼎 国 试 剂 公 司) 质 粒 ; TY@ 小量快速抽提 ]4B( ^2/83 公司) 脂质体 T^.# ; @>( R;<6/ 公司) ;高糖 TK1K( A4P<; 公司) ;胎牛 血清 H9D0;7/ 公司) ( ;酵母提取物及胰蛋白胨 上海 ( 生物工程公司) ;低溶点琼脂糖 西班牙进口分装) ( ; 氨苄青霉素 华北制药厂) 6.1R. 的 >DR 引物 ( (!** PI) >!: DAA@@A@A.A.D.AA@AD@@ )_， 为 (_ >$:(_ AA@.A@@ADAA@A.D.AA@ )_， 病 毒 1$P 区 引 物 腺 (,’" PI ) >):(_ .DA„„D.D@AD@AD.A..A )_， 为 "! 第四军医大学学报 # $%&’() *+, *-. /0+1) ( 2334;( 6) )((8: 9 :%&’0;,< =>>&< -.&< ?0 25 7 9 !": #$%&’%’(&&%’%&&&(%(’(( )$， 均由上海生物 工程公司合成并纯化， 纯度达 **+ #, + &-.!"#/ 空病 毒: 克隆有 !.半乳糖苷酶 !.012) ( 基因 !"#/， 由西南 医院心内科唐兵博士惠赠+ !+ "# 方法 3+ 4+ 35 负载 6’78’ 的复制缺陷型腺病毒的包装5 脂质体介导 9:%)3#.6’78’ 和 9;<(2=>"73， )%?@ 参 照 :A’&! 使用说明书的方法转染 <7B4*) 细胞 3C D 34 - 可出现空斑， 仔细挑取 # 个空斑， 用少量无菌 !;E 溶 液 悬 浮 后， 别 装 管 冻 存 于 F GCH + 将 分 <7B4*) 细胞传入 I 孔板， 细胞 GC, 融合时用于扩增 病毒; 将挑取的空斑溶液反复冻融 ) 次， 低速离心， 取 上清感染 <7B 4*) 细胞; C+ # JK 上清液 L C+ # JK 按 :M7M 培 养 液 加 入 I 孔 板 中 的 <7B 4*) 细 胞 中， )GH 培养 3 6， 其间每 3# JNO 摇动培养板 3 次， 6 后 3 再加入 4 JK 培养液， 继续培养， 同时设立阴性转染对 照; 培养 ) D # - 后， 用空斑上清液转染的 <7B4*) 细 胞出现细胞病变效应 PQR=91R6NP @SS@PR，%!7) ( ，而阴 性对照组细胞无 %!7; 收集出现 %!7 的 <7B4*) 细 胞， 于无菌 7! 管中以 3#CC $ 室温下离心 # JNO， 上清 冻存于 F GCH ， 用于再感染 <7B 4*) 细胞， 细胞沉淀 用适量无菌 !;E 液吹散后冻存于 F GCH + 3+ 4+ 45 &-.6’78’ 的大量扩增、 纯化及滴度测定5 <7B 4*) 细胞传代于 4#C JK 培养瓶中， 细胞 TC, 融 合时， 加病毒上清 # JK 培养 3 6， 其间每 3C D 3# JNO 摇动培养瓶 3 次， 使其均匀感染， 6 后补加新鲜培养 3 液 3C JK， 继续培养 ) D # -， 当细胞出现完全 %!7 时， 收集病变细胞， 连同培养液一起移入无菌离心管， 室 温下以 3#CC $ 离心 # JNO， GCH 分别保存上清及细 F 胞， 分别用于再感染和收集高滴度病毒+ 重复多次即 可获得内含大量病毒的 <7B 4*) 细胞+ 将收集的病 破碎细胞， 释放病毒， 室 变 <7B 4*) 细胞冻融 ) 次， 温下 4#CC $ 离心 # JNO， 去除细胞碎片+ 病毒上清液 用 C+ 44 #J 滤膜过滤除菌， 然后将除菌后的病毒上 清叠加于无菌梯度氯化铯 %U%2) ( 溶液上层 (C+ # JK， 比重 3+ # V0 W K; C JK， )# V0 W K; C JK， 4# V0 W )+ 3+ )+ 3+ K) 3CH ， ， 3#C CCC $ 离心 3 6 后在 3+ 4# V0 W K 和 3+ )# V0 W K %U%2 溶液间可见灰白色病毒带， 将病毒带吸出 并与 比 重 为 3+ )# V0 W K 的 %U%2 溶 液 混 和， "H ， 以 3#C CCC $ 离心 3T 6， 留取病毒液， 避光透析 "H (3C JJ=2 W K ’?NU.%2 9< G+ #; JJ=2 W K M0%24 ; 3 3CC JK W K 甘油)4" 6， 收集病毒液于无菌离心管中， 取少许检 测病毒滴度， 余置 F GCH 冻存备用+ 4" 孔培养板每孔 接入 3 X 3C <7B 4*) 细胞， 培养 4" 6， 取病毒转染液 C+ 4 JK 加 !;E 至总量 4 JK， 混匀后作 3C X 倍比稀释 # 至第 I 管， 每个稀释度设 ) 孔， 加入不同稀释度病毒 液 C+ 4 JK， 培养 3 6， 其 间每 3C D 3# JNO 摇动 3 次培 养板， 6 后补加培养液 3+ # JK， 3 继续培养 )I D "T 6， 观察细胞病变情况+ 取近 3CC, 出现 %!7 的稀释度， (3C # 细胞 X 稀释 按下列公式计算病毒滴度:OSY W K Z 度 X 3C 个病毒 W 细胞)[ C+ 4 JK 设定公式中每个细 ( 胞感染 3C 个病毒， D "T 6 内导致细胞完全病变) )I + 3+ 4+ )5 &-.6’78’ 的鉴定5 用冻存的腺病毒载体感 染 GC, D TC, 融合的 <7B 4*) 细胞， )GH 培养 4 D ) -， 观察 <7B 4*) 有无 %!7 出现+ 用 !;E 作空白对 照+ 用冻存的腺病毒载体感染 <7B 4*) 细胞， )GH 培 <7B 4*) 细胞出现 %!7+ 将 <7B 4*) 细 养 4 D ) - 后， 胞收获， 制作电镜标本， 透射电镜下观测细胞内有无 病毒样颗粒形成+ 用 !;E 作空白对照+ 取纯化的病 沸水煮 3C JNO， 之后直接取 # 毒 4CC #K 于 7! 管内， #K 用于 !%8 的 :\&

模板

个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载

+ 采用插入的 6’78’ 基因 特有引物 !3 !4 和腺病毒载体特有引物 !) !"， 进行 双引物 !%8 鉴定+ 使用 !%8 M1UR@? 进行 !%8 扩增， 模板 :\& 加入量为 # #K， 上下游引物各加 3 #K， 反 应体系为 4C #K+ 分别扩增腺病毒及端粒酶基因+ 反 应条件为 *"H ) JNO， *"H 3 JNO， #)H 3 JNO， ITH 3 JNO， 个循环， "C ITH 延伸 G JNO， 保存+ 电泳后同 "H 时出现腺病毒基因和端粒酶基因的特异性扩增条带 作为阳性判断标准+ 用 &-.!"#/ 作对照+ "# 结果 含病毒的细胞冻融液离心去细胞碎片并经梯度 %U%2 低温超速离心纯化后， 得到病毒液 # JK+ 采用 倍比稀释法测定了 &-.6’78’ 的滴度， 经计算所得病 毒滴度为 # X 3C 34 9SY W K+ 用 &-.6’78’ 感染 <7B 4*) 细胞， )GH 培养 4 D ) - 后， 发现 <7B 4*) 细胞圆缩、 脱落， 出现 %!7+ 表明包装成的腺病毒载体感染能力 强， 可以在 <7B 4*) 细胞中 73 基因产物的反式作用 下大量增生， 并阻断宿主细胞 :\& 和蛋白质生成， 最 终导致细胞营养耗竭而死亡 图 3&) 而用 !;E 作对 ( + 照 的 <7B 4*) 细 胞 则 生 长 良 好 图 3; ) 用 &-. ( + 6’78’ 感染 <7B 4*) 细胞出现 %!7 后有大量病毒颗 粒形成 图 4&) ( ，大小约 G# D T# OJ+ 细胞肿胀， 透明 度增加， 核膜不连续+ 这表明细胞内的病毒复制对细 胞造成损伤+ 未感染腺病毒的 <7B 4*) 细胞 图 4;) ( 则发现有病毒样颗粒形成， 核膜完整连续， 胞质内细 胞器清晰可见+ 分别对 &-.!"#/ 和 &-.6’78’ 用两对 引物进行 !%8 扩增， 结果 &-.!"#/ 只出现 TIC ]9 的 &- 特异条带 图 )) ( ，而 &-.6’78’ 则可扩增出 TIC ]9 和 3"" ]9 两条带+ 这表明包装的腺病毒载体内携 第四军医大学学报 " #$%&’( )*+ ),- ./*0) ( 1223;( 5) (’’7: 8 9$%&/:+; <==%; ,-%; >/ 14 6 8 !! 带 !"#$" 基因% *:789:;9( <=(.222 ) ;.:&’(!"#> &’ ?9@7;9 ) 0: ( ; &’(!"#> !"#$" ( ?9@7;9) 6: ; &’(!"#$" &’ ?9@7;9) A: ( ; &’(!"#$" !"#$" ?9@7;9) ( % 图 0+ 重组腺病毒载体双引物 3B$ 鉴定 !" 讨论 现已发现约 /2C 人类恶性肿瘤细胞内表达端粒 酶% 而正常人体， 除造血干细胞、 生殖细胞等分裂旺 盛的细胞表达端粒酶， 其余多为阴性， 这使得端粒酶 ,6, ,A, 有可能成为广谱抗肿瘤治疗靶点 % 杨仕明等 发 &:&’(!"#$" 感染;):正常细胞% 现在胃癌、 肠癌及肝癌中端粒酶的 0 个亚单位中 "3* 及 !"$ 在癌细胞内高表达， 在癌旁正常组织内也有 或多或少的表达; !"#$" 则仅在癌细胞内高表达， 在 癌旁正常组织内极少表达， !"#$" 的表达水平与 且 肿瘤的恶性程度成正相关% 转染 !"#$" D0 24 6 8 8<37 A5383>329 ?90/ <7 >022 >?28?50 43/029 3; C?467 T50698 435AC3= , # %&&-，( )*=%&) %’%! , %’!-# () : :0709<9 $, I022 F32 J<;0 E><， ,+,U0578 VF， E， @< 1<0? L1， 62# L990994078 3; 6 >34T<70/， 08 6/073= M<5?9=40/<680/ 37>32N8<> 67/ <44?7398<4?26835N 8?435 8C056AN $, , # I67>05 B09， %&&’，( )&) -!-! , -!’%# (’ : ,P,W? X，Y<6 H，I652907 E，08 62# L/073M<5?9=40/<680/ 85679:070=07= :<70050/ /07/5<8<> >022 M6>><70 3; >67>05 $ , I?55 O070 1C05， , # %&&’， %) %!+ , %-+# ’ ( : 编辑" 潘伯荣 ,!,陈" 陵， 杨仕明， 蔡永国， 人端粒酶催化亚单位基因正反义 等# 腺病毒载体的构建及鉴定 $, 第四 军医 大学 学 报，%&&’， , # %( ()*) )+!% , )+!-# : ,-,./0 1# 10234050 67/ 8023405690 69 865:089 ;35 678<=>67>05 /5?:9 $, , # @88<37 ;56:4078 <7 :6985<> >67>05 67/ <89 A50462<:= 7678 209<379 $, $ O698530780532 K0A6832， , # %&&)， ( P) P+( , PP%# )( : ,(,O?/Q379937 1，R<226/907 B，B3773M=$09907 J，08 62# .443586262 T?A6<70 <7 C?4679:.7;2?07>0 3; M32?40 67/ T65<><8N 3; 932?8<379 $, L709= , # 8C09<323:N， )***， )%(& , )%((# *): ,!,R626770 $R，V35C3707 LF，$3\026 BF，08 62# E020>834A65<937 3; CNA05T65<> T?A6<70 - 4: R059?9 ( 4: ;35 3?8A68<078 \700 658C539>3AN $, L7098C L762:，%&&)， )!++ , # *!: , )!+*# ,-,E83>\9 OF，K622f358C E]，G0467/3 B，08 62# F<7<4?4 23>62 6762= :09<> /390 3; <78568C0>62 T?A6<70 <7 26T35 67/ 8C0 0;;0>8 3; <7= 8568C0>62 ;07867N2 $, L7098C09<323:N， , # %&&)， ’*! , ’*P# *-: 编辑" 何扬举 哌卡因 ! 4: 和芬太尼 %& !: 混合液 % 4J 配制:+# ’ : a J 丁 ( 哌卡因 % 4J 加芬太尼 &#) 4:， * : a J @6I2 稀释到 )& 4J， 用 抽出 % 4J 注入) 然后向上置入硬膜外导管 - >4， ， 改手术体 位# 术中根据血压和失血进行输晶体或胶体液和输血# 患者 有痛感时静注芬太尼 %’ [ ’& !: 或硬膜外追加 %& : a J 利多卡 因 % [ - 4J# 监测

记录

混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载

感觉阻滞和运动阻滞 采用 U5346:0 等 ( 级评估法 & b 无运动阻滞; b 不能抬大腿; b 不 能弯曲膝部; ) % ! b 不能移动腿和踝部) 手术结束保留硬膜外导管利于术后 # 镇痛# 所得数据均用 ! " # 表示， $ 检验， c &#&’ 认为有统 用 % 计学意义# 结果显示: 感觉平面出现 (-!# ) d %)# !) 9，最高平 收稿日期: %&&’=&)=)!; 接受日期: " %&&’=&!=%作者简介: 陆惠元# 副主任医师# 102: &’!%) ( -*()+P( 本TXT由“文库宝”下载: