玉米花粉导入外源DNA研究

玉米花粉导入外源DNA研究 玉米花粉导入外源DNA研究 第6期总第192期 2010年6月 农业科技与装备 AgriculturalScience&TechnologyandEquipment NO.6TOtalNO.192 Jun.2010 玉米花粉导入外源DNA研究 白鹏,郑晶,徐娥 李岩, (丹东农业科学院,辽宁丹东118109) 摘要:为探讨花粉管导人外源DNA方法在玉米育种中的应用效果,以早D502玉米自交系,78599玉米白交系及大豆(丹304)为 DNA供体,分别采用柱头涂抹法,开苞导人法,花粉粒浸泡法进行转化,比较3种方法导入后的结实率及变异率.结果表明:开苞 导入法结实率最高,其变异率仅为1.4%;花粉粒浸泡法的结实率和变异率均最低;柱头涂抹法结实率较低,但变异率较高.2007年 和2009年的导人结果显示,将花粉管导人外源NDA技术作为常规育种辅助手段是完全可行的,对促进植物基因与常规育种 的有机结合具有现实意义. 关键词:玉米;花粉管导人;试验;DNA;柱头涂抹法 中图分类号:Q944.43文献标识码:A文章编号:1674—1161(2010)06—0006—03 花粉管导入法直接导入外源DNA是植物分子育 种的一种新方法.该技术是通过花粉管将外源DNA 直接导人胚囊,在受精时实现外源DNA插人整合的 一 种简便实用的基因导入方法.它既不同于载体转化 的基因工程技术,也不同于通过有性杂交实现植物间 基因交流的传统育种方式.迄今为止,除玉米外,该技 术在油菜,大豆,小麦,棉花,高粱等多种作物上都已 成功应用[1].由于该技术操作方法及所需设备比较简 单,且不受受体植物种类的限制,不需要经过组织培 养再生植株环节,所以得到越来越多育种工作者的青 睐.尤其在基层研究单位显得更为实用. 1供体选择 丹598是目前国内应用最广泛的自交系之一,但 随着玉米育种向优质,早熟,耐密方向的转变.因其生 育期偏长且品质一般,应用范围正在逐渐缩小.因此 选择具有早熟,耐密,抗丝黑穗病等优良性状的D502 玉米自交系,抗叶斑病的78599玉米自交系以及远缘 作物大豆(丹304)作为DNA供体对其进行改良,以 期改变其成熟期,抗病性及品质等性状. 2DNA提取 采用常规植物DNA提取方法提取供体作物的总 导人较小片段DNA的转化几率 DNA.从理论上分析, 可能会更大些,而导人后会产生变异,既可能是捅人 了完整的功能基因并表达,也可能插入的片段破坏了 原有的功能基因或者激活了原有的沉默基因.一般情 况下,一个完整的功能基因长度在2kb左右,由于作 物的核DNA链相当庞大,因此,采用超声波对其进行 破碎,使大部分片段的长度在3kb左右,这样既可获 得大量的小片段.又能保证基因的相对完整性.便于 收稿日期:2010—02—26 作者简介:李岩(1967一),男,副研究员,从事农作物转基 因,脱病毒等方面的研究. 提高转化频率. 3DNA导入 采用不同的导入方法进行转化,比较其导人后的 结实率及变异率. 3.1柱头涂抹法 在花期,按常规授粉方法将雌穗和雄穗套袋,待 花丝长5,10CIT/时,剪去距穗轴顶部2C1TI以上的苞 叶和花丝,将DNA溶液涂抹在切口处,然后自花授 粉.在授粉后22,26h,再剪去1cm花丝,并重新涂 抹DNA溶液,增加DNA转化的机会. 3.2开苞导入法 自交授粉约24h后,剪断穗轴顶端花丝,沿穗轴 将苞叶平均切成3份,剥开苞叶,去净花丝,用软毛笔 将外源DNA均匀涂抹在穗轴上,然后再把苞叶复原 并包好穗轴,外面用橡皮筋捆住.最后加套纸袋避免 水分蒸发和害虫叮咬 3.3花粉粒浸泡法 浸入DNA溶液 雌穗吐丝后将雄穗套袋取粉. 2,3min后,用软毛笔将花粉悬浮液均匀涂到花丝 上,通过花粉管将浸入的DNA带人胚囊. 4导入结果 4.1导入方法比较 2006年,提取78599玉米自交系的总DNA.分别 采用柱头涂抹法,开苞导人方法和花粉粒浸泡法对丹 598进行导入.2007年通过植株性状调查统计其变异 率,比较不同导人方法的变异频率.结果见表1. 从表1可看出:开苞导入法结实率最高.而其变 异率仅为1.4%,与安颖蔚等描述的17.98%的变异率 差距较大,这可能与导人时机的选择以及其他因素 有关,相关技术还有待于进一步深入研究;花粉粒浸 泡法结实率和变异率均为最低;柱头涂抹法虽然结实 率较低,但变异率相对较高. 因种子数量不多,田间选择工作量相对较小,所 2010年第6期李岩等:玉米花粉导.,x-M-~NDA研究7 以在以后的导人研究中更多采用的是柱头涂抹法. 从D.代的田问性状上看,变异主要表现在:叶鞘 及幼叶出现紫色;花药及花丝亦有紫色变异;株型,粒 型,穗轴的颜色以及抗病性较对照都有显着变化.D 代田间性状分离较为明显,选择株型紧凑,品质较好, 抗病性强,生育期较短的个体自交.D代植株已趋于 整齐,D代即可稳定. 4.22007年导入结果 采用柱头涂抹法.用D502,78599玉米自交系及 用大豆(丹304)的总DNA对丹598进行导人.共收 获种子519粒.2007年进行单粒播种,根据植株的农 艺性状统计其变异率,共筛选到l8个变异株,总变异 种的特征,植株较高.果穗较大:2株只表现出果穗性 状上的变异:穗行整齐,半硬粒型,米质较丹598有明 显改善,其中1株为导人大豆DNA产生的红轴变异, 通过连续光谱近红外分析仪对其成分进行分析其蛋 白含量比对照提高1.8% 经过连续2a田间筛选及海南加代.到2009年. D代材料已经稳定,大部分D代也已趋于整齐, 致,部分变异性状见表3. 从表3可以看出,经过改良和筛选,选育的新品 系在品质上有了显着改善,部分生育期有所缩短.配 合力测定工作正在进行中.此外,也获得了抗病性强 且株型更加紧凑的株系,但由于其生育期较长,因此 率为3.46%,详见表2.其中,16个变异株表现出杂交在D代被淘汰. 表22007年导入结实率及变异率 Table2Theseed-settingrate&mutationrateaftertransferringin2007 表3部分丹598导入后代农艺性状调查结果. Table3FindingsofagronomictraitsaftertransferringinsomefollowinggenerationsofDan-5 98 通过对导人大豆DNA后代的蛋白含量进行跟踪 检测发现,到D代仅有半数左右的后代蛋白含量仍 保持在较高的水平,其余则与对照持平,这说明导入 的片段在转化后有丢失现象,D代以后蛋白含量基 本保持稳定. 4.32009年导入结果 应用大连理工大学提供的耐盐抗旱基因——碱 蓬甜菜碱醛脱氢酶基因S1BADH和胆碱单加氧酶基 因S1CMO(均为不含载体骨架序列和抗性基因,来源 于植物的绿色基因线性片段)对丹598,C8605—2,铁 9206等骨干自交系进行基因转化,结果见表4. 由表4可见:共转化8O株,其中59株结实;收获 代种子1229粒.平均结实15.3粒/株.统计结果 显示,基因溶液的浓度对结实率(平均每株结实粒数) 有显着影响,低浓度条件下结实率较高,这可能是由 于基因溶液的渗透压对花粉的萌发产生影响所致.其 转化频率有待翌年进行田间抗性观察和分子检测. 5结论与讨论 外源DNA直接导入技术是以DNA片段杂交假 说为理论基础,直接将带有目的性状的供体遗传物 质(总DNA)或目的基因导人受体植株.创造变异材 料,进而选育新品种或新品系的一项新兴的转化技 术.研究结果表明,该技术与传统的基因枪及农杆菌 等转化技术相比具有如下优点:1)该方法不需要克 8农业科技与装备2010年6月 隆目的性状基因,所需设备简单,操作简便,避免了组 织培养等操作程序,特别是避免了植物再生的困难, 便于常规育种工作者掌握,易于技术推广.2)不受受 体植物种类限制.单,双子叶植物均可,应用前景广 阔.3)育种周期短,只需2a时间(3,4代)即可选育 出稳定的自交系.4)应用植物总DNA进行转化,无 任何标记基因.因此转化后代对环境无潜在危害,可 安全大田释放.同时,它也克服了远缘杂交不亲合的 难题,可极大拓宽种质资源的利用范围,改善目前育 种遗传基础日益狭窄的现状.5)导人整合的总DNA 片段是随机的,因此可创造大量预期不到的变异,为 育种提供新材料. 由于导人的DNA片段没有筛选标记基因,因此 为筛选和检测工作带来一定的困难.为了验证DNA 片段杂交假说,周光宇等(1979,1980)对高粱稻进行 了酯酶同工酶分析及基因组分子杂交,结果都说明了 高粱的部分DNA确实存在于已稳定的高粱稻中:翁 坚(1984),谢道昕(1991),曾君祉(1993),倪万潮 (1998)等通过对采用花粉管通道方法导人目的基因 受体进行分子杂交验证,均证明目的基因已整合到受 体植物基因组中;雷勃钧等(1994)通过对转化后代, 受体,供体进行RAPD分析,也证明外源总DNA片断 可以通过花粉管通道导入受体,引起基因组变异. 自1983年周光宇等人首次报道了棉花通过花粉 管通道导人外源DNA获得成功以来,很多科技工作 者在花粉管导人技术研究方面都获得了成功,其中在 玉米花粉管导人研究上也有很多成功的报道:祁永红 等利用花粉管通道转化技术成功地将大豆DNA导入 玉米自交系,获得高蛋白变异自交系_4;2005年,王罡 等将Bt基因通过花粉管通道法导人玉米自交系:丁 群星等(1993),王国英等(1996)采用子房注射法成功 地获得了转Bt基因的玉米植株. 南此可见,花粉管导入外源DNA技术作为常规 育种的辅助手段是完全可行的,对促进植物基因工程 与常规育种的有机结合具有现实意义.随着该项转化 技术不断普及和完善,以及分子标记等配套检测技术 的建立,花粉管导人技术有可能成为21世纪基因转 化的主导技术 参考文献 [1]朱生伟.外源DNA直接导入受体植物的研究进展[J].植物学通报,2010(1):1l_l6. [2]安颖蔚.利用外源DNA导人玉米自交系创造变异的研究[J].安徽农业科 学,2007(3):667—668. [3]周光字.远缘杂交的分子基础——DNA片段杂交假设的一个论证[J].遗 传,1979,6(4):405,413 [4]祁永红.大豆DNA直接导入玉米自交系研究[J].玉米科学,2000,8(1):34—36. TheMethodofTransferringForeignDNAbyMaizePollen throut~hPollenTube LIYan,BAIPeng,ZHENGJing,XUE (DandongAcademyofAgriculturalSciences,DandongLiaoning118109,China) Abstract:ThroughthetechnologyoftransferringforeignDNAbymaizepollenthroughpollentube,thetotalDNAfragmentsortarget genesfromdonorcrops(corn,soybeans)weretransferredintomaizeinbredline-Dan598,tocreateanearlymature,highdiseaseresis- tanceandhighqualitymutationmaterialsforthebreedingofsupermaizevariability. Keywords:maize;pollentubetransfer;experiment;DNA;chapitersmearmethod (上接第5页) OntheClimateAdaptabilityandHigh-yieldCultivationTechniquesofLily inWanzaiCounty YANGQiulian.XUJinhua (ZhangshuMeteorologicalBureau,YichunJiangxi330800,China) Abstract:TheanalysisofclimateadaptabilityoflilyinWanzaiCountyismadeinthisarticle.Consequently,theauthorputsforward measurestoproducehighqualityandhighyieldlily,includingselectingappropriateplantationplotandhighqualityvarieties,sowingat righttime,improvingmicroclimateofthefield,preventingandcontrollingdiseases,harvestingontherightoccasion,andcultivating finebreed. Keywords:lily;climate;cultivationtechnique;WanzaiCounty