益智仁盐炙前后指纹图谱对比研究-临床医学论文

益智仁盐炙前后指纹图谱对比研究-临床医学 作者:李文兵，胡昌江，李兴华，黄勤挽，谢锋，谢秀琼 【摘要】 目的建立益智仁盐炙前后高效液相色谱(HPLC)指纹 图谱，探讨盐炙对益智仁内在成分的影响。方法对益智仁生品、盐炙 品饮片进行HPLC/UV指纹图谱分析，色谱柱采用DiamonsilC18 (250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈和水梯度洗脱，波长为260nm， 柱温:35?，流速:1.0ml/min。结果益智仁盐炙后有两个新的色谱峰 出现,7个特征峰相对含量发生变化。结论益智仁通过盐炙后化学成分 既有量的变化，也有质的变化。 【关键词】益智仁 盐炙 高效液相色谱法 指纹图谱 Abstract: ObjectiveToestablishHPLCfingerprintsofFructusAlpiniaeOxyphyllaebetweentherawandthesaltprocessing,andtoinvestigatetheimpactontheinternalcomponentsofFructusAlpiniaeOxyphyllaeaftersaltprocessing.MethodsAnalyzetheHPLC/UVfingerprintsofFructusAlpiniaeOxyphyllaebetweentherawandthesaltprocessedonthechromatographiccolumnofDiamonsilC18(250mm×4.6mm，5μ m)elutedbyacetonitrileandhydraulicgradient.Thedetectionwavelengthwas260nm,thecolumntemperaturewas35?,andtheflowratewas1.0ml/min.Res ultsTwonewchromatographicpeaksexistedandthecontentsofsevencharacteristicpeakschangedaftersaltprocessingofFructusAlpiniaeOxyphyllae.ConclusionThechangeofchemicalcompositioninFructusAlpiniaeOxyphyllae'sbet weentherawandthesaltprocessingcanbefoundnotonlyinquantitybutalsoinqu ality. Keywords:FructusAlpiniaoxyphyllae;Saltprocessed;HPLC;Fingerprints 益智仁为姜科植物益智AlpiniaoxyphyllaMiq.的干燥成熟果实，本草文献始见于唐?陈藏器《本草拾遗》。生品辛温而燥，主要归脾经，以温脾止泻、收摄涎唾力胜;盐炙后可缓和辛燥之性，以温肾固精缩尿为主，如《修事指南》指出:“益智仁盐炒，止小便频数”。益智仁经盐炙后药性和功效均发生了改变，揭示盐炙后其内在成分有可能发生了改变。本实验采用梯度洗脱法建立益智仁高效液相色谱(HPLC)指纹图谱分析方法，以圆柚酮作为参照物，对益智仁生、炙品进行对比研究，为深入阐明益智仁盐炙前后药性和功效的改变提供一定的依据。 1器材 VarianProStar高效液相色谱仪(含ProStar210二元泵，ProStar325紫外/可见光检测器，Prostar500柱温箱，Workstation6.3色谱工作站);BP211D电子天平(感量0.01mg，德国Sartorius公司);SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。 圆柚酮对照品由美国Sigma公司提供(批号:10112423，纯度>98%)，乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)，水(重蒸水)，为色谱流动相;甲醇为分析纯。益智仁药材产地为海南琼中，经本校生药教研室卢先明教授鉴定确认为姜科植物益智AlpiniaoxyphyllaMiq.的干燥成熟果实, 盐炙益智仁按筛选出的最佳工艺条件制得,1,。 2方法与结果 2.1参照溶液的制备精密称取圆柚酮对照品适量，用甲醇稀释制成每毫升含圆柚酮0.02mg对照品溶液。 2.2供试品溶液的制备取生、盐益智仁粉末(过40目筛)约1g，精密称定,加甲醇20ml索氏提取2h，提取液转移置25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 2.3益智仁HPLC指纹图谱的建立 2.3.1色谱条件及系统适用性试验色谱柱:DiamonsilC18(250mm×4.6mm，5μm);流动相:A:水，B:乙腈，流动相比例见表1;检测波长:260nm;记录时间:85min;柱温:35?;流速:1.0ml/min。表1流动相比例(略) 2.3.2样品测定取供试品溶液各20μl注入液相色谱仪,按“2.3.1”项下色谱条件测定,记录色谱图。在供试品色谱中,以圆柚酮色谱峰的保留时间和色谱峰面积为1,计算各指纹峰的相对保留时间和相对共有峰面积值。 2.4方法学考察 2.4.1仪器精密度实验取生益智仁粉末，精密称定,按“2.2”项下制备供试液，连续进样6次，考察仪器的精密度。结果表明,各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化,RSD分别为0.08%,0.99%和0.36%,1.43%，表明仪器精密度良好。 2.4.2稳定性实验取生益智仁粉末，精密称定,按“2.2”项下制备供试液，分别在0，2，4，8，12和24h进样，记录色谱图。结果表明,各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化,RSD分别为0.10%,1.02%和0.24%,1.25%，表明样品24h内稳定性良好。 2.4.3重复性实验取生益智仁粉末5份，精密称定,按“2.2”项下制备供试液，记录指纹图谱。结果表明,各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化,RSD分别为0.06%,1.23%和1.02%,1.54%，表明重复性良好。 2.5生益智仁指纹图谱共有模式的建立取10批生益智仁粉末，按“2.2”项下方法制成供试品溶液,分别取20μl进样,记录指纹图谱,其相似度分别为0.975，0.968，1，0.984，0.990，0.979，0.981，0.982，0.990，0.978。生品共有模式见图1。 2.6盐炙益智仁指纹图谱共有模式的建立取10批盐炙益智仁粉末，按“2.2”项下方法制成供试品溶液,分别取20μl进样,记录指纹图谱,其相似度分别为0.980，0.971，1，0.991，0.989，0.968，0.965，0.979，0.982，0.984，盐炙品共有模式见图2。 2.7益智仁盐炙前后指纹图谱比较分别取益智仁生、炙品，按“2.2”项下方法制成供试品溶液,分别取20μl进样,记录指纹图谱(图3),其中13号峰为益智仁主要指标成分圆柚酮,将其定为内参比峰,计算各色谱峰与内参比峰的保留时间及峰面积比值,得各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积值。见表1。表1益智仁(生、炙品)指纹图谱相对保留时间和相对峰面积(略) 3讨论 3.1检测波长的选择实验考察了220，235，254，260，275nm5个波长，综合考虑已知益智仁中有效成分圆柚酮和其他成分的吸收,表明以260nm处检测的图谱信息量最多,峰形较好,溶剂干扰少,基线平稳。 3.2流动相的选择分别对甲醇-水和乙腈-水系统进行5%,100%范围的梯度洗脱比较,结果表明,在乙腈-水在表1流动相条件下所得色谱峰分离度、峰形较好。 3.3参照物的选择圆柚酮(Nootkatone)又称诺卡酮，属于雅槛蓝(eremophilane)系的双环倍半萜酮，在抗实验性胃溃疡、抑制脂多糖活化巨噬细胞中NO的产生和抑制由抗原引发的RBL-2H3细胞的脱落等方面具有显著的活性，为益智药材的有效成分之一,2,。我们前期工作表明圆柚酮为盐炙益智仁缩尿有效部位(石油醚部)的主要成分之一，且盐炙前后圆柚酮含量无明显变化，故本实验选用圆柚酮作为参照物。 益智仁经盐炙后HPLC指纹图谱上出现了2个新色谱峰(2，4号峰)，与圆柚酮(13号峰)相比有7个峰相对含量发生了变化，而盐炙后这些成分质与量的变化与缩尿作用有无相关，有待进一步研究。 【参考文献】 ,1,李兴迎，胡昌江，林辉，等.中药益智仁盐炙工艺的正交实验法研究,J,.时珍国医国药,2008,19(7):1574. ,2,MorikawaT，MatsudaH，ToguchidaI， etal.AbsolutestereostructuresofthreenewsesquiterpenesfromthefruitofAlpiniaoxyphyllawithinhibitoryeffectsonnitricoxideproductionanddegranulationinRBL-2H3cells,J,.JNatProd，2002，65(10):1468.