乳尿素氮测定的研究进展

乳尿素氮测定的研究进展 140《乳业科学与技术》2009年第3期(总第136期) 乳尿素氮测定的研究进展 翟少伟 (集美大学厦门市饲料检测与安全检测重点实验室,福建厦门361021) 摘要:综述了国内外测定乳尿素氮浓度的情况,了国内外测定乳尿素氮的优缺 点以及乳成分和乳 样保存条件对乳尿素氮浓度测定的影响. 关键词:乳尿素氮;乳成分;保存条件 中图分类号:TS252.1文献标识码:A文章编号:1671—5187(2009)03一O140_04 AdvanceinMeasurementofMilkUreaNitrogenConcentration ZhaiShaowei (XiamenKeyLaboratoryofFeedQualityTestingandSafetyEvaluation,JimeiUniversity, XiamenofFujian361021,P.R.China) Abstract:Themeasurementprogressofmilkureanitrogenconcentrationwasreviewed,andt headvan— tageanddisadvantageofthosemethodstodeterminemilkureanitrogenconcentrationwasev aluated. Theeffectofmilkcompositionandconditiontopreservemilksamplesonmilkureanitrogenm easure.— mentwerealsodiscussed. Keywords:milkureanitrogen;milkcomposition;preservedcondition 牛乳中所含氮的95%为真蛋白质,其余5%是 非蛋白含氮化合物,尿素是非蛋白氮的主要来源_ll. 而测定乳中尿素氮(Milkureanitrogen,MUN)浓度 可以用来评价日粮的营养状况,估测氮排泄量,作 为提高奶牛繁殖性能的指标,还可以加快奶牛育 种进展[21.准确测定MUN浓度是其发挥作用的前 提.但目前国际上尚无统一测定MUN的标准方 法,在不同国家,多种方法都在使用.根据测定原 理的不同,MUN的测定方法可以分为两类:一是 光谱法,即用红外光照射时,尿素在某一区域出 现官能团的特征吸收峰,测定仪器主要是红外分 析仪,常见的有Foss4000和Foss6000;二是化学 法,主要包括酶法和一般化学比色法,酶法的原 理是脲酶处理奶样后产生氨,通过测定来自尿素 的氨来计算MUN值,常用的仪器有CL一10, Skalar和Bentley.CL一10测定氨释放后pH值的 变化,而Skalar和Bentley用改进的波氏比色测 收稿日期:2008—06—15; 作者简介:翟少伟,男,博士.副教授,主要从事动物营养与饲料科 学研究; 基金项目:集美大学优秀青年骨干教师基金资助(2008C002o 定脲酶水解尿素产生的氨B4],一般化学法是通过 测定尿素和其他化学物质反应生成有色物质,一 定范围内色泽深浅与尿素浓度呈正比,通过比色 法测定,测定仪器多为可见光分光光度计或生化 仪『2J. 本文就国内外MUN浓度的测定方法以及影 响测定的因素做一综述,为测定MUN浓度标准 方法的建立以及促进其在奶牛生产中的应用提 供参考. 1国内外对乳尿素氮的测定 1.1国外的测定 [4q:L较了常见的五种仪器(CL一10, Peterson等 Skalar,Bentley,Foss4000和Foss6000),测定MUN 的回收率以及不同实验室使用相同仪器的测定 结果,发现,Bentley,Skalar和Foss6000的回收率 比较高,三者之间没有显着差异(P>0.05).但 Foss6000的回收率差异较大.CL一10法的回收率 显着低于上面三种方法(P<O.05),显着高于 Foss4000法(P<0.05).Foss4000的回收率都显着 低于其它方法(0.05).可见不同的仪器和方法 . ,, ,一一 ,, 翟少伟:乳尿素氮测定的研究进展141 间也有一定的差异.此外,CL—l0和Bentley的变 异较小,但Bentley总回收率显着高于CL一10法 (P<O.05).仅有两个实验室用Skalar法,无法对该 法进行重复性和准确率方面的评价.Foss6000的 回收率数值高,但两个实验室的差异极显着(P< 0.001).说明这种方法的重复性差.用Foss4000的 三个实验室的回收率最低,并且实验室间的差异 显着(0.01).可见,测定MUN值与实验室的不 同也密切相关.Kohn等f3]也有类似的报道,他们还 发现测定l0个奶牛场的样品时,Foss4000测定 MUN的变异59.5%来自农场,33.8%的变异来自 实验室,农场×实验室互作对MUN的影响显着且 在上述五种方法中影响程度最大.而其他四种仪 器测定结果表明超过98%的变异来自农场,说明 能准确地检测出奶样MUN差异.而农场X实验室 互作在cl一10和Foss6000中也显着存在,这些互 作说明使用上述仪器的不同实验室对某些样品 测定结果的差异.但未使用Foss4000的实验室都 可以检测出奶样问的差异,暗示了校正不同实验 室和不同仪器的方法有待于改进,以提高不同实 验室测定结果的一致性. Broderick[51采用红外法,化学法和酶法等三种 方法测定MUN浓度,发现红外法和化学法的结 果差异显着,红外法和酶法测定的结果相关性很 低(R=O.2),而化学法和酶法测定结果的相关性 较高(R=0.72),说明红外法(Foss4000)不适用于 MUN的检测. 以上研究表明,Foss4000测定MUN的结果 较差,而Arunvipas等[61在PEMQL实验室进行的 研究表明,Foss4000的准确性和重复性比CL一10 法好.他们认为两种方法测定结果在统计学上有 一 定的差异,但是绝对差异较小不会影响应用, 红外法和酶法都具有很高的精确性和准确性;其 他的实验室未必能得到类似的结论.这可能和这 个实验室有着自己特殊的校正奶样用来同时校 正两种方法的标准曲线有关. 关于其他测定方法间的比较,Rodriguez等[7] 还报道,Azoteststrips法与二乙酰一肟法的相关 性较差(R:0.21). 除了上述的测定方法外,Jenkins等[s1还报道 了一种新的方法,该方法可I三l在挤奶时测定 MUN.主要是测定尿素在酸性作用下,酶水解后 产生CO的压力来估测尿素的浓度,这个方法的 线性范围为0,30mg/dL. 测定方法的差异可能使试验结果出现相反 的结论.Wilson等l9I发现,用红外法测定的MUN 浓度不受日粮蛋白质溶解性的影响(P>0.05),而 用酶法测定的MUN和PUN值受日粮蛋白质溶解 性的影响显着(P<0.05).虽然红外法能测定MUN 值,但是没有酶法那样灵敏地检测出处理间的差 异.红外法测定的MUN值为19.19—19.60mg/dL, 而PUN值为l6.23,l7.37mg/dL,MUN值明显高 于PUN.一般情况下,MUN值约为PUN值的83% , 98%,MUN值不会等于甚至超过PUN值,这样 的测定结果明显与常理相悖. 可见,国外使用的测定方法中,虽然多用红 外法测定,但不倾向于使用红外法,尤其是 Foss4000型红外分析仪.酶法中不同的测定仪器 存在一定的差异,使用相同仪器的不同实验室测 定结果也有一定的差异,这表明了建立一个标准 方法和操作过程标准化的必要性. 1.2国内的测定 我国测定牛奶中尿素含量的主要目的是检查 牛奶中是否掺假(添加了外源的尿素或含氮物质). 新鲜原乳的尿素氮含量较低,掺假后会大幅度上 升.美国奶牛MUN的推荐值为1O,16mg/dU?,我 国奶牛的氮摄入量一般低于NRC(2001年)的推 荐值lllJ,其MUN值必然低于上述范围. 肖志芳等【2]用酶联电极法测定了牛奶中的尿 素含量,其原理是尿素在脲酶作用下水解为碳酸 铵,加入适量NaOH后转变为氨,氨气敏电极对氨 产生响应,且其电极电位值与氨浓度的对数值在 一 定范围内呈线性关系.测定的3个乳样尿素浓 度分别为15.2mg/dL,28.9mg/dL和24.3mg/dL, 也未发现与二乙酰一肟法测定结果有显着差异. 他们在测定过程中直接测定乳样,未对样品进行 任何处理. 王武生争百过酶解纳氏试剂法进行测定,但 需要从青豆粉中提取脲酶,乳样经NaWO4沉淀后 测定,测出的牛奶鲜样中尿素浓度为58.1mL. 其原理是尿素在脲酶作用下水解为碳酸铵,碳酸 铵在碱性环境下与纳氏试剂作用显黄色至棕黄 色,其色度与碳酸铵含量呈正比.王守兰和张艳 (1999年)也用脲酶纳氏试剂法测定了牛奶尿素 含量,测定的结果为l3.4,30.2mg/dL. 龚仁敏等?采用的是酶解一水杨酸光度法,需 要从刀豆中提取脲酶.测定乳样尿素浓度为 22.8-28-3mg/dL.其原理是尿素在脲酶作用下水 6期) 142《乳业科学与技术》2009年第3期(总第13解为氨,氨在碱性条件下由亚硝基铁氰化钠催 化,与次氯酸盐和水杨酸作用,生成绿色化合物, 可进行比色测定.该比色液为真溶液,溶液的颜 色稳定,再现性好.碳酸铵在碱性环境下与纳氏 试剂作用显黄色至棕黄色,其色度与碳酸铵含量 呈正比. 纳氏试剂中含有汞,对环境的污染较大,酶 解一水杨酸法使用氰化物,酶联电极法使用的仪 器和试剂较为复杂,而且需要在每次测定样品前 做出标准曲线,并且这些测定方法的时间也较 长,尤其是酶法操作步骤繁琐,不利于快速分析. 二乙酰一肟法是人类医学中测定(Bloodurea nitrogen,BUN)的常用方法,该方法最大的特点是 测定的准确度和精确度较高,所用试剂比较常 见,可用可见光分光光度计或生化分析仪测定, 该方法应用较为广泛.人医中测定BUN主要是用 来粗略估计肾脏的功能是否异常,即肾小球的过 滤功能,肾功能衰弱,肾炎,.肾盂肾炎可使BUN浓 度大幅度的增加.用不同的测定方法测定有不同 的正常范围,如:尿素酶靛酚法中男性BUN的浓 7.85mmol/L,女性为2.787.32 度范围为2.89, mmol/L;尿酶一纳氏试剂显色法为3.21,6.07 mmol/L;二乙酰一肟法为1.785,6.783mmol/L.不 同的实验室或者医院化验室有自己习惯使用的 方法和正常范围.陈社安等【认为,在众多的尿素 氮生化试剂盒中,要经测试后,再选择适合本室条 件的试剂,才能保证测定结果的准确性.同一血样 在不同测定室的结果会出现一定程度的差异,但 实际上只要肾功能受到了影响,BUN会远远超出 了正常范围值,这样的变化即使不同方法或实验 室的结果有差异,也能检测出其超过了正常范 围.BUN只是作为疾病诊断的一个参考指标,而 不是唯一指标,甚至允许较大误差的存在.但对 于MUN来说,其数值的高低很大程度在于奶牛 的蛋白质摄人数量和质量,生产中的蛋白质过 量摄入或能氮平衡较差不会使奶牛出现病理变 化,也不会使MUN值急剧上升或者成倍增加, 但MUN浓度会产生一定程度的变化,这样的变 化幅度远小于不同实验室或仪器测定人BUN的 差异. 可见,在人医中测定BUN的要求低于奶牛营 养中测定MUN的要求,用于测定人类BUN的方法 以及操作的规程是否可以用来测定MUN有待验 证,毕竟血液和牛奶的成分存在着较大的差异. 2奶样预处理对乳尿素氮测定的影响 目前对乳样测定MUN的前处理步骤和内容 也未有统一规定,例如,是用全乳测定,还是用脱 脂或者脱脂脱蛋白样品测定,以及样品中是否可 以添加防腐剂等.准确测定MUN除要考虑测定 方法外,还要注意乳样的前处理和保存因素可能 对测定结果的影响. 2.1乳成分 在高产牛群中,乳脂率与MUN呈正相关【t61, 高含量的乳脂可导致MUN测定误差增加.Pe— terson等的研究表明,乳成分对大多数仪器测定 MUN没有影响,乳脂含量仅对使用Foss6000的实 验室有显着影响,使用该仪器的回收率显着降低. Kohn等喂道,与CL-IO法相比,Bentley法的MUN 测定值随乳蛋白水平升高而增加,而乳脂含量的升 高使测定结果偏低.Oher和Sjaunja[目(研究发现,脱 脂乳样MUN值的变异为?o.10mmol/L,显着低于 全乳样的变异(?o.16mmol/L)(P<0.05o脱脂乳样 的MUN值为6.21?0.46mmol/L,高于全乳样 (5.82~0.38mmol/L),但差异不显着.他们用脲酶/ 谷氨酸脱氢酶的方法在340nm波长下,通过检 测NADH浓度的降低速度来测定MUN(速率 法),发现乳样不需前处理即可用于测定.Jenkins 等的压力感受器法中,?L,q~xCN定结果没有影 响,而乳蛋白或者乳糖则有一定的影响. Faust和Kilmer?红外法测定MUN时发现, 体细胞数过高会影响MUN的测定结果,而其他 的乳成分影响不大. 2.2乳样保存条件 Oher和Sjaunja1发现,奶样添加0.02%的 Bronopol或者冷冻一周后(解冻)MUN值无显着 变化(P>0.05).添加防腐剂的乳样于冰箱冷藏 14d后,MUN值显着上升(P<0.001).Carlsson和 Bergstrum[?7】用酶法测定MUN的研究显示,使用防 腐剂(溴硝丙二醇)以及冷冻对MUN的测定结果 没有影响.Miettinen和Juvonenp~]报道,4cc下或者 添加叠氮钠的奶样保存一周后MUN值维持不 变,而未加防腐剂的奶样在室温下其值逐渐降 低,两天后降低了50%.Haagt]发现,室温下保存 奶样8d后,MUN值降低58%.Godden等[221用红 外法和酶法测定MUN的研究表明,添加防腐剂 Bronopol不会影响MUN的测定.添加防腐剂的奶 样室温下放置4d或冷冻未对MUN测定结果也 无显着影响. 翟少伟:乳尿素氮测定的研究进展143 可见,无论使用哪种测定方法,防腐剂的添 加均未对测定结果产生显着影响,这可能是测定 MUN的波长与防腐剂的波长差异较大,未被其干 扰所致.我国测定DHI的奶样中,经常使用重铬 酸钾作为防腐剂,添加到牛奶中后,牛奶由白色 变为黄色,这种防腐剂是否对测定结果产生影响 还鲜见报道. 3小结 一 种MUN的测定方法若要被人们接受,除 了要有较高的准确性和精确性外,该方法还要使 用价格相对较低的仪器和试剂,简便的测定程 序,使测定人员易于掌握. 红外法测定MUN操作简单,也可以测定乳 成分,但使用的仪器价格昂贵,该方法的准确性 和精确性有待于进一步研究;酶法测定的结果一 般可靠性好,但是分析步骤较为繁琐,分析成本 相对较高;酶法和化学法都可以用常见的可见光 分光光度计测定,也可以用生化分析仪来测定. 考虑到我国的具体情况,用可见光分光光度计测 定MUN可能是比较现实的方法.因此,应该对化 学法测定MUN进行较为系统的研究,尽可能考 虑实际生产中影响测定结果的众多因素,建立一 套标准的操作规程. 参考文献 (1】杨凤主编.动物营养学(第二版)【M】.北京:中国农业出版社, 2006. [2]杭楠.两种测定乳尿素氮浓度方法的比较[D].厦门:集美大 学,2008. 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