【word】 安氏隐孢子虫囊壁蛋白编码基因的克隆及原核表达

【word】 安氏隐孢子虫囊壁蛋白编码基因的克隆及原核达 安氏隐孢子虫囊壁蛋白编码基因的克隆及 原核表达 第32卷第11期 2010年11月 中国预防兽医 ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine Vo1.32.NO.11 NOV.20lO doi:10.3969~.issn.1008—0589.2010.10.18 安氏隐孢子虫囊壁蛋白编码基因的克隆及原核表达 郑君,李建华,张西臣,宫鹏涛,李明英,刘颖丽 (吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春130062) 摘要:为克隆和原核表达安氏隐孢子虫囊壁蛋白(cowP)的部分编码基因(AB),本研究根据COWP基因序 列设计引物,RT—PCR扩增目的基因AB,从而构建重组原核表达质粒pET—AB将重组质粒转化大肠杆菌BL21, IPTG诱导表达,经SDS—PAGE以及westernblot鉴定,回收并纯化重组蛋白,免疫BALB/c小鼠,检测细胞免疫 和体液免疫水平.SDS—PAGE和westernblot分析显示,重组蛋白约为16ku,可以被HRP标记的抗组氨酸抗体和 安氏隐孢子虫免疫的小鼠血清识别.经重组蛋白免疫的BALB/c小 鼠抗体水平以及CD4和CD8的值均差异显着 (p<0.05),表明获得的重组蛋白具有一定的免疫原性. 关键词:安氏隐孢子虫;囊壁蛋白;克隆;免疫原性 中图分类号:$852.7文献标识码:A文章编 号:1008—0589(2010)11-0901—03 Cloningandprokaryoticexpressionofthetruncateoocystwall proteinofCryptosporidiumandersoni ZHENGJun,LIJian—hua,ZHANGXi—chen,GONGPeng—tao,LIMing —ying,LIUYing—li (CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun130062,China) Abstract:ThepartialcodingsequenceofCryptosporidiumandersonioocystwallprotein(cowp)genewasamplifiedby RT—PCR,clonedintopET28avector,andtransformedintoE.coliBL21DE3.ProteinexpressionwasinducedwithIPTGand identifiedbySDS—PAGEandwesternblot.TherecombinantproteinwaspurifiedandusedtoimmunizetheBALB/cmice.The immuneresponsesweredetectedbyELISAandflowcytometry.Theresultsshowedthatthelevelofspecificantibodiesagainst COWPinimmunizedBALB/cmiceweresignificantlyhigherthanthatbeforeimmunization(p<0.05).TheCD4andCD8values werealsosignificantlyincreased(p<0.05).Thesedataindicatedthattherec ombinantCOWPproteinpossesseds~ong immunogenicityandcouldbeusedasapotentialantigenforimmunodiagnosi sofcryptosporidiosis. Keywords:Cryptospotidiumandersoni;oocystwallprotein;clone;immuno genicity 隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是一种由隐孢子虫 感染而引起的以腹泻为主要临床症状的原虫病,可 寄生于哺乳类,爬行类等多种动物和人,引起严重 腹泻,脱水和厌食等症状….安氏隐孢子虫(Cryp. tosopridiumandersoni)主要感染断奶犊牛,育成牛和 成年牛_2l.目前,对安氏隐孢子虫囊壁蛋白的研究 C0rrespondingauthor 主要集中在虫体的诊断上l3l,本研究以安氏隐孢子 虫长春株囊壁蛋白部分编码基因为对象,构建了重 组原核表达载体pET28a—AB,并通过大肠杆菌进行 表达,从而鉴定目的基因的免疫原性和免疫反应 性,为安氏隐孢子虫的防治提供实验依据. 收稿日期:2010-03—29 基金项目:国家科技支撑农业领域课题(2【)07BAD4OB05) 作者简介:郑君(1981-),男,吉林长春人,博士研究生,主要从事预防兽医学研究 通信作者:E—mail:xczhang@jlu.edu.cn 902中国预防兽医2010年 1材料和 1.1虫株与实验动物安氏隐孢子虫卵囊为吉林某 奶牛场粪样中分离纯化,用2.5%重铬酸钾溶液4? 保存.10只雌性BALB/c小鼠,6周龄,8周龄,体 质量20g左右,实验小鼠均在清洁级动物房饲养. 1.2菌株,质粒和化学试剂pMD18-T载体和工 具酶购白TaKaRa公司;pET一28a由本实验室保 存.E.coliTop10与E.coliBL21(DE3)均购自天根 生物公司;抗His标签单克隆抗体,HRP标记羊抗 小鼠IgG二抗均购自天根生物公司;层析柱材料 Ni>-NTA购自Novagen公司. 1.3目的基因AB重组表达载体的构建根据Gen— Bank中登录的安氏隐孢子虫囊壁蛋白(cowp)基因的 核苷酸序列(AB089289),设计特异性引物:上游引 物:5’.CGCGGATCCTTTACATTTTCAGGGAAGC一3’ f含BamHI酶切位点);下游引物:5’-CCGGAATTC CCTTGCAGTGTAAAATTTG.3’(含EcoRI酶切位 点).RT.PCR扩增目的基因(AB),回收RT—PCR扩 增产物,经TA克隆及鉴定,构建重组质粒pET—AB, 双酶切鉴定并测序. 1.4重组质粒pET—AB在大肠埃希菌BL21(DE3) 中的表达及纯化参照文献[4]的方法,诱导重组 菌,分别表达lh,2h,4h和6h,SDS.PAGE检 测表达产物,收集菌体,通过Ni亲和层析柱纯化 目的蛋白,以抗His抗体(1:4ooo)和安氏隐孢子虫 免疫小鼠血清(1:250)分别作为一抗,westernblot分 析纯化的重组蛋白. 1.5COWP的免疫原性检测采用腹腔注射的免 疫方法,分别免疫6只雌性BALB/c小鼠,免疫剂 量为1o0只,共免疫3次,每次间隔2周,同 时设立PBS对照组.免疫后l周取脾脏,检测细胞 免疫水平.ELISA方法检测小鼠血清中抗体水平, 具体方法参照文献【4]. 2结果与讨论 2.1COWP编码基因的克隆及重组质粒pET—AB 的构建RT—PCR扩增目的片段,产物经琼脂糖凝 胶电泳检测,大小约为404bp,与预期结果一致(图 11.目的基凶经TA克隆后构建重组原核表达质粒 pET.AB.经EcoRI与BamHI双酶切鉴定,经琼 脂糖凝胶电泳显示:目的片段约400bp.目的片 段经测序后与GenBank中核酸序列进行比对,同源 性为100%. 2.2重组质粒的诱导表达含重组质粒pET.AB和 空质粒pET28a的大肠埃希菌BL21DE3经IPTG诱 导表达,诱导后lh,2h,4h和6h的细菌裂解液 进行SDS.PAGE电泳,在约l6ku位置可见明显的蛋 白条带,而空质粒对照菌无此条带出现(图2). 2000bp 1000bp ;88 250bp 100bp M1:DNAMarker2000;M2:ABgene 图1AB基因PCR扩增电泳图 Fig.1AmplificationofABgenebyPCR 94.0ku 66.2ku 45.0ku 33.0ku 26.0ku 20.0ku M:蛋白Marker;1,4:BL2l/pET28a-AB分别诱导6h,4h, 2h,1h;5:BL21/pET28a诱导后3h;6:BL21/pET28a未诱导 M:PrestainedproteinstandardMarker; 1—4:InducedBL2l/pET—ABat6h,4h,2hand1hrespectively; 5:InducedBL21/pET28a;6:Non—inducedBL21/pET28a 图2IPTG诱导后重组蛋白表达的SDS.PAGE分析 Fig.2SDS—PAGEanalysisofr~ombinantproteinexpressionafter inductionby1.0mmol/LIPTG 2.3目的蛋白纯化重组菌经IPTG诱导表达的重 组蛋白以包涵体形式存在,通过纯化,复性后,经 westernblot检测,抗His抗体,安氏隐孢子虫免疫 小鼠的多抗血清均可识别该重组蛋白(图3),而含 空载体的重组菌对照组则未见特异性条带,表明目 的蛋白具有反应原性. 2.4免疫原性检测以2g重组蛋白包被,免疫 鼠血清工作浓度为1:100,HRP标记羊抗鼠IgG工 作浓度为1:l000,反应结束后测定0D铴值. 第11期郑君,等.安氏隐孢子虫囊壁蛋白编码基因的克隆及原核表达903 BALB/c小鼠免疫前与免疫后血清中特异性抗体水 平分别为0.213?0.02l和0.548?0.027,结果证明 免疫前后抗体差异显着(p<0.05).T细胞检验结果显 示BALB/c小鼠免疫后CD4和CD8的值均显着高 于对照组(p<0.05). M124 l17ku 85ku 49ku 34ku 25ku l9ku M:蛋白预染Marker:l:抗His.GHRP抗体反应呈阳性; 2:BL2I/pET28一a空载体对照组; 3:抗隐孢子虫小鼠血清反应呈阳性; 4:BL21/pET28一a空载体对照组 M:PrestainedproteinstandardMarker;l:Positivereactionwith anti.HisGHRPantibodies;2:ControlgroupofBL21/pET28-a 3:Positivereactionwithserumfrommouseinfectedwith Cryptosporidiumandersoni;4:ControlgroupofBL21/pET28一a 图3纯化的重组蛋白westernblot分析 Fig.3Westernblotanalysisoftherecombinantprotein 安氏隐孢子虫囊壁蛋白的合成是虫体生活史中 必须经历的阶段【5].因此,对囊壁蛋白的研究有助 于隐孢子虫的防治研究.本研究构建了重组质粒 pET-AB并转化到E.coilBL21中,通过诱导表达, 纯化及小鼠免疫试验,证明重组安氏隐孢子虫囊壁 蛋白具有一定的免疫反应性和免疫原性,为隐孢子 虫的防治提供理论基础. 参考文献 [2] [3】 [4] [5] FayerR.Cryptosporidium:awater—bornezoonoticparasite[J]. VetParasitol,2004,126:37—56. PaulS,ChandraD,TewariAK,eta1.PrevalenceofCryp— tosporiditunandersoni:Amolecularepidemiologicalsurveya— mongcattleinIndia[J].VetParasitol,2009,161:31—35. 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