[试题]阿胶黄精丸黄精丸补血活性组分对环磷酰胺所致贫小鼠骨髓造血微环境的影响

[试题]阿胶黄精丸黄精丸补血活性组分对环磷酰胺所致贫小鼠骨髓造血微环境的影响 阿胶黄精丸黄精丸补血活性组分对环磷酰胺所致贫小鼠骨髓造血微环境的影响 摘要:目的研究阿胶黄精丸活性组分A、B对环磷酰胺所致贫血小鼠骨髓造血微环境的保护作用。方法细胞计数法检测小鼠单核细胞数，集落形成检测小鼠骨髓中造血干,祖细胞相对数量，流式细胞仪测定小鼠骨髓细胞CD 含量和细胞周期分布，切片观察小鼠骨髓组织形态。结果阿胶黄精丸活性组分能够明显的增加环磷酰胺所致贫血小鼠骨髓单核细胞数、增加骨髓细胞中CFU—GM、BFU—E，CFU—E和CD 含量，增加骨髓细胞中s期细胞比率。结论阿胶黄精丸活性组分能够有效地保护骨髓造血微环境，减轻环磷酰胺对骨髓组织的损伤，保护造血组织。 关键词:阿胶黄精丸活性组分; 环磷酰胺; 骨髓微环境; 保护作用 阿胶黄精丸其补血活性已经得到大量的临床和药理学确认 。但目前对于究竟何种物质在阿胶黄精丸中起到了补血作用仍所知甚少，虽有学者提出了氨基酸假说、微量元素假说、聚负离子基学说，但都缺乏具体的试验验证。对于阿胶黄精丸的补血机理研究大多停留在药效学上，未能深入 一J。机体的正常造血依赖造血细胞和支持造血细胞生长发育的骨髓微环境的相互作用。骨髓微环境主要包括基质细胞、细胞外基质和各种造血因子，三者共同组成一个高度复杂而 有效的调节网络，造血干,祖细胞(HSPC)在此增殖、分化、成熟、进入血窦，并最终进人血液循环。骨髓基质细胞是造血微环境中最为重要的组成部分，它起源于胚胎发育的间充质，通过与造血细胞直接接触起到支持和营养造血细胞的作用。研究发现，造血细胞的生长有赖于由多种基质细胞组成的粘附层，如果缺乏骨髓基质细胞，则HSPC在体外不能持续生长，即使加入外源性生长因子仍然无效，这充分说明骨髓微环境结构和功能的完整性对于造血细胞的自我更新及快速增殖至关重要。 有研究模拟人胃肠道消化过程，对阿胶黄精丸进行酶解，对酶解后的阿胶黄精丸按分子量大小进行了分离，获得了小分子活性补血组分A和B_6 J。本实验研究阿胶黄精丸活性成分对5一氟尿嘧啶所致贫血小鼠骨髓微环境的影响，以探讨阿胶黄精丸的可能补血机理，为阿胶黄精丸的二次开发提供理论依据。 1 材料与仪器 1(1 动物ICR小鼠60只[合格证号:SCXK(沪)2003—0003]， 5,6周龄，雌性，中国科学院动物中心提供。 1(2 药物与试剂东阿阿胶黄精丸(山东东阿阿胶黄精丸集团提供，国药准字Z37021368)。胃蛋白酶、胰蛋白酶购自Sigma公司。大鼠抗小鼠CD 单克隆抗体购自基因公司。小鼠GM—CSF、EPO购自美国Bionewtrans Pharmaciutical Biotechnology公司。IMDM、小牛血清购自Gibco公司，环磷酰胺为上海第九制药厂产品。 1(3 仪器超滤装置，配备有截留分子量为5 000 Da，8 000 Da10 000 Da，30 000 Da的Pellicon XL系列聚碳酸脂膜(LabscaleTFF，Milipore，USA)，荧光酶标仪(Millipore，Bedford，MA，USA)，流式细胞仪(美国BD公司)，氨基酸分析仪(Hitachi，L一8800，Japan)。 2 方法 2(1 药物制备125 g东阿阿胶黄精丸，进行体外人工消化 。第1阶 段:盐酸缓冲液，pH:1(2，胃蛋白酶按重量比加入(1:250)，消化时间2 h，搅拌转速120 r,min，降解温度37'12。第2阶段:2moL,L碳酸氢胺中和盐酸，调pH至6(8，胰蛋白酶按重量比加入(1:250)，维持上述条件，继续降解2 h后，升温80?灭酶活、冷却。取消化液进行3 000 r,min离心30 min，去掉上清悬浮物后小心取上清，用膜分子量为5 000 Da、8 000 Da的超滤装置在操作压力为4(0 bar的条件下分别进行超滤12 h，获得分子量为小于5 000 Da的组分A和分子量为5 000,8 000 Da的组分B，凝胶柱脱盐后进行真空干燥，并测定了氨基酸组成。 2(2 动物造模及试验72只小鼠分成6组，正常组(Nor— ma1)、模型组(Contro1)、A组分低剂量组(AL)、A组分高剂 量组(AL)、B组分低剂量组(BL)、B组分高剂量组(BH)，除正常组外，其余小鼠一次性腹腔注射环磷酰胺250 mg,kg。正常组和模型组每天用0(2 ml生理盐水灌胃，AL组、AH组分别进行1 g,kg和2 g,kg体质量的剂量进行灌喂给药。BL组、BH组为0(8 g,kg和1(6 g,kg体质量剂量，每天上午8点进行灌喂，造模后第2天开始给药，连续8 d。 2(3 小鼠骨髓细胞(BMC)悬液制备小鼠经颈椎脱臼处死，取 股骨，用剪刀剪开股骨两头，露出骨髓腔，然后用消毒过的注射器、4号针头，吸取2 ml培养液，反复冲洗骨髓腔收集骨髓细胞全部置离心管内，反复吹打使细胞完全分散，然后离心10 min(1 000 r,min)，去上清，再加入适量培养液充分}昆匀，制成悬液、计数，台盼蓝鉴定细胞活性在95, 以上。 2(4 培养体系制备 2(4(1 红系造血祖细胞培养体系建立骨髓细胞培养于甲基纤维素中，培养体系含细胞2×10 ,ml，小牛血清30, 二巯基乙醇10,m0I,L，红细胞生成素(EPO)浓度在培养CFU—E时为0(2U,ml、培养BFU—E时为l U,ml，甲基纤维素(4 000 CPS)最终浓度为0(9, ，RPMI一1640加至培养体系为lml;然后取上述培养体系加样于96孔培养板上，每孔0(2 ml，共5个孔，于饱和湿度下37?培养，CFU—E第3天观察、BFU —E第7天观察。 2(4(2 粒单系祖细胞(CFU—GM)培养细胞密度2×10 ,ml，小牛血清30, ，二巯基乙醇10,mol,L，GM—CSF 50 rig,ml，RP?MI一1640加至培养体系为1 ml;然后取上述培养体系加样于96孔培养板上，每孔0(2 ml，共5个孔，于饱和湿度下37,培养7 d后观察。 2(5 骨髓细胞CD 抗原检测剔除小鼠股骨肌肉和结缔组织， 剪开股骨两端，用6号针头以PBS缓冲溶液冲出骨髓细胞于事先加入枸橼酸钠的试管内，再用4号针头过滤，充分混匀，于每管加入2ml溶血剂以破坏红细胞，2 500 r,min离心8 rain，吸弃上清，然后加入10 l FITC标记的大鼠抗小鼠CD 抗体，对照管加入10 l相应对照抗体，4?避光反应30 min，加入2ml红细胞裂解液，作用4 min，用PBS缓冲液洗细胞3次，加入终浓度为3~l,ml的PI染液，用流式细胞仪检测，上机前以荧光微球调整仪器的变异系数(CV)并稳定在2, 以内，每份样品上机后收集110 个细胞，测定结果以单参数组方图显示，并用相关软件计算。 2(6 骨髓切片制备 实验第8天处死小鼠，分离股骨，加入 10, 中性甲醛溶液固定24 h，脱钙处理，30, ，50, ，70, ，95, 和纯乙醇各0(5 h梯度脱水，透明，石蜡包埋切片，苏木精一伊红(Heidenhain—eosin，H—E)染色，在 400倍显微镜下进行骨髓组织形态观察。 2(7 统计学检测数据用 ?s示，多组数据比较采用ANOVA 单因素方差分析。 讨论