猪圆环病毒2型云南株分离鉴定及ORF2序列分析

猪圆环病毒2型云南株分离鉴定及ORF2序列分析 猪圆环病毒2型云南株分离鉴定及ORF2序 列分析 中国畜牧兽医2010年第37卷第5期生物技术?103? 猪圆环病毒2型云南株分离鉴定及ORF2序列分析 李鹏,冯章.,汤会琼,李文贵.,柴俊,李作生.,张以芳 (1.吉林大学畜牧兽医学院,长春130062;2.云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201; 3.军事医学科学院军事兽医研究所,长春130062;4.云南省蒙自县文澜镇畜牧站,蒙自661lOO) 摘要:本研究根据GenBank中已经发的猪圆环病毒2型基因序列,设计了2对PCV2特异性引物,从疑似断奶仔猪多 系统衰竭综合征(postweaningrnultisystemicwastingsyndrome,PMWS)感染病例中检测出3株云南省PCV2流行株,通过ve— ro细胞分离病毒,并用透射电子显微镜观察到了约17nlTl的病毒样粒子的存在.经同源性比较分析,3个分离株之间核苷酸 同源性为99.5,99.8,与甘肃省PCV2分离株核苷酸同源性最低(90.7),浙江省分离株核苷酸同源性最高(99.7), 与南美洲分离株核苷酸同源性最低(92.0%),瑞典分离株核苷酸同源性最高(99.4),这可能与云南省猪种引进有关. 关键词:猪圆环病毒2型;分离鉴定;序列分析 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1671-7236(2010)05—0103—05 猪圆环病毒(porcineeircovirus,PCV)是迄今 发现的一种最小的,无囊膜的2O面体的动物病毒 (Tischer等,1982),含有一条单链,环状DNA,病毒 粒子直径平均为17nm(Fenaux等,2000;Meehan 等,1997).根据PCV的致病性,抗原性,将PCV分 为PCV1和PCV2两个血清型(Meehan等,1997; Hesse等,2008;Olvera等,2007),PCV1最初从污 染的PK15细胞上获得,无致病性(Tischer等, 1982,1986;Allan等,1995,2000).PCV2是引起断 奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisys— temicwastingsyndrome,PMWS)的主要病原,而且 还与育肥猪的猪皮炎和肾病综合征(porcinederma— titisandnephropathysyndrome,PDNS)(Allan等, 2000),怀孕母猪的繁殖障碍(Opriessnig等,2006), 新生仔猪的先天性震颤(congenitaltremors,CT) (Choi等,2002),猪呼吸道疾病综合症(porcinere— spiratorydiseasecomplex,PRDC)(Choi等,2001), 增生性和坏死性肺炎(proliferativeandnecrotizing pneumonia,PNP)的发生密切相关,范围涉及流产, 不孕,"非典型"猪繁殖与呼吸综合征(porcinere— spiratoryandreproductivesyndrome,PRRS)等 (Grau—Roma等,2007).世界许多国家相继报道了 郎洪武等(2000) 各自地区PMWS的发生和流行, 收稿日期:2010一O1—12 作者简介:李鹏(1976一),男,河南人,博士生,研究方向:分子细 菌学. 通信作者:张以芳,男,教授.E—mail:zyfkm@yahoo.corla.cn 基金项目:云南省高端科技人才引培工程(2009CI125)项目资 助. 采集了国内7省(市)22个猪群的559份血清,用 ELISA方法检测总阳性率为42.9,通过血清学调 查和PCR检测等方法证实了中国猪群中存在 PCV2病毒.猪圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科, 圆环病毒属(Allan等,1999;Mankertz等,2004), PCV2全基因组为1768bp或1767bp(Gilpin等, 2003).序列分析显示,病毒通过滚环复制机制进行 病毒DNA的复制,PCV2有3个主要的开放阅读框 (ORF),ORF1编码与病毒复制相关的复制酶蛋白 (Rep和Rep')(Mankertz等,1998);ORF2编码病 毒的结构蛋白(Cap),与病毒的免疫有关(Gillespie 等,2008);ORF3编码的蛋白质是病毒复制中非必 需PCV2蛋白(Liu等,2006).0RF2有702个碱 基,编码234个氨基酸,分子质量大约是30ku,所编 码的蛋白质是PCV2囊膜的主要结构成分(Man- kertz等,2004). 为了探讨PCV2基因结构与功能的关系,本研 究对PCV2的云南株进行分离鉴定,并通过电镜观 测病毒粒子的形态,对其ORF2进行PCR扩增,测 序,建立进化树并与中国其他地区及世界其他国 家PCV2ORF2序列进行比较分析,明确云南省 PCV2流行毒株的进化地位及其流行变化规律,为 制定行之有效的防制措施提供了基础数据,为进 一 步的基因表达,诊断以及PCV2的基因改造奠定 了基础. 1材料与方法 1.1待检样品采自云南省楚雄,南华,蒙自,江 川,弥勒,陆良,大姚等地县7个猪场具有断奶仔猪 多系统衰竭综合征(PWMS)的临床症状和病理变 ? 104?生物技术中国畜牧兽医2010年第37卷第5期 化的淋巴结,肺脏,脾脏,小肠等组织,放置于一80 ?冰柜中保存. 1.2主要试剂和酶rTaqDNA聚合酶,购自大连 宝生物公司l小量病毒/液体样品DNA快速抽提试 剂盒,上海华舜生物工程有限公司,DMEM培养基 (Hyclone公司产品),新生牛血清(浙江杭州四季青 生物工程公司),PK一15细胞,云南农业大学微生物 实验室保存.根据GenBank已发表的PCV2 (IAF2897)核酸全序列和PCVl(U49186)核酸全序 列,设计PCV2型特异性检测引物,扩增片段长度为 473bp:上游PWl:5一TGACCTGTCTACTGCT— GTGA一3,下游PW2:5CCGTGGATAGTTCTG— TAGCA一3;ORF2全基因扩增引物,上游PW3:5一 ATGACGTATCCAAGGAGGCGTT一3,下游PW4: 5『_TTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCT一3,扩增片 段长度为702bp,以上引物由大连宝生物公司 合成. 1.3PCV2PCR检测取可疑病例的淋巴结,肺 脏,脾脏,小肠等组织5,1Og,加PBS液2mL碾 磨,反复冻融3次,按照病毒DNA提取试剂盒提取 病毒DNA,,80?保存.PCR反应条件:94.C预 变性2min,94?变性30s,58.C退火30S,72?延 伸45S,30个循环;72.C延伸5min. 1.4病料中PCV2病毒分离方法一:称取5,10 g淋巴结,脾脏,小肠等组织,按1:2加入PBS研磨 组织.反复冻融3次,3000r/min离心20min,取 上清,过滤除菌(0.22/,m).待PK一15细胞长至 80%时,弃去营养液,取上清3mL接种,放入5 CO,37?培养箱作用1h.弃去接毒液,加入 DMEM营养液继续培养.6h后,弃去营养液,加 入适量D一氨基葡萄糖(以能完全覆盖细胞单层为 准),于37.C作用30min.弃去氨基葡萄糖,用 Hank'S液洗涤细胞2次,加入DMEM营养液继续 培养至细胞长成单层,收获病毒液.方法二:不用 【)_氨基葡萄糖处理,直接盲传5,6代收获病毒液. 1.5PCV2ORF2全序列扩增将收获的细胞病 毒液反复冻融3次,取约1mL移人1.5mL离心管 中,3000r/min离心20min,取上清,用病毒DNA 提取试剂盒提取病毒DNA,PCR扩增其OF2基 因.PCR反应条件:94?预变性2min;94?变性 30S,58?退火30S,72?延伸1min,30个循环;72 .C延伸5min,PCR产物纯化后送宝生物测序. 1.6病毒液的纯化及电镜观察取PCV2病毒液 约1OmL,放人透析袋中,在外面洒上一层 PEG20000,放人4.C冰箱约2h.取浓缩后的病毒 液,12000r/min离心10min,取上清;将病毒液滴 在蜡盘上,把铜网放在上面,吸附2min;然后用滤 纸尽量吸干铜网,放在事先滴好的2.5PTA(磷 钨酸)液上,染色2min;用滤纸吸干,放人烤箱烤 干,约30min,用日立H一600A型透射电镜观察其 形态. 2结果 2.1病料中PCV2特异性目的片段PCR扩增用 引物PW1,PW2对疑似病例肺脏,淋巴结,小肠,脾 脏等组织进行扩增,经琼脂糖凝胶电泳后观察到1 条约为473bp的电泳条带,与预期的片段大小一致 (图1). bp 2000 1000 750 500 250 100 图1病料中PCV2PCR扩增结果 注:M,DL2000Marker;1,阳性病料扩增结果;2,阴性对照. 2.2PCV2ORF2PCR扩增结果用引物PW3, Pw4,以细胞接毒扩增出预期片段702bp长度一致 的ORF2(图2),分离到的3株PCV2命名为楚雄株 (CX一060423),玉溪株(YX一06O921),蒙自株(ML_ O61118). M12345 图2PCV2ORF2PCR扩增结果 注:M,DL2000Marker;1,楚雄株(cX一060423)2,玉溪株<YX一 060921);3,4,蒙自株(ML-061118);5,阴性对照. 2.3病毒的电镜观察纯化的病毒液经电镜观察 可见直径约为17nm的病毒粒子,结果与先前的报 道相符(图3). 0OO000 咖m?蛐 中国畜牧兽医2010年第37卷第5期生物技术?105? 图3PCV2云南分离株的电镜观察结果(50000×) 注:左,未用I)I氨基葡萄糖处理,盲传6代;右,用I)I氨基葡萄 糖处理结果. 2.4云南分离株与国内外PCV2ORF2序列同源 性比较运用DNAStar对云南分离株ORF2序列 和GenBank中发布的12个国内和18个国外分离 株的PCV2ORF2序列进行比较分析,结果显示,云 南分离株之间的核苷酸同源性为99.5%,99.8, 氨基酸同源性为99.1,100;与浙江省分离株 同源性最高,核苷酸同源性为99.7,氨基酸同源 性为97.3,与甘肃省分离株同源性最低,核苷酸 同源性为9O.7,氨基酸同源性为88.4;同时与瑞 典分离株同源性最高,核苷酸同源性为99.4,氨 基酸同源性为97.3%;与南美洲分离株同源性最 低,核苷酸同源性为92.0%,氨基酸同源性为 89.8%. 2.5遗传及进化树分析根据GenBank中发布的 3o株PCV2和6株PCV1ORF2基因序列绘出系统 进化树(图4),PCV1的6株病毒单独处于进化树的 一 个分支,其它30株PCV2构成另一个分支.中国 分离株之间关系比较复杂,在PCV2的各个分支中 都有较分散的分布,本研究中分离到的楚雄毒株 (CX一060423)与一株郑州毒株(EF064149)同源性最 近,单独构成一个小的分支;玉溪毒株(YX一 060921),蒙自毒株(ML一061118)和一株上海毒株 (EF197987),一株浙江毒株(DQ231519),一株江苏 毒株(EF56o608),同源性较近,构成一个分支.分 离到的云南省3株PCV2毒株又与一株瑞典毒株 (EF184227),一株河北毒株(DQ910866),一株巴西 毒株(DQ856580)构成了一个大的分支.从进化树 中可以看出中国一株郑州毒株(EFo64150),一株甘 肃毒株(EF067853)和一株巴西毒株(DQ856569), 一 株瑞典毒株(EF184220)亲缘关系较近,组成一个 独立的分支. 20151050 Nuc1eotideSubstituti0ns(×100) 图4南分离株PCV2ORF2基因序列进化树 2.6云南分离株核苷酸和氨基酸序列变异研究 对云南分离株和GenBank数据库中的3O株国内外 PCV2毒株比较发现,在ORF2上第97,178,184— 186,197,231,247,255,264—267,271-275,281—283, 363,366,417,540,549,576—577,588,639nt等多处 基因发生改变,从而导致ORF2上氨基酸存在着11 个高变区(第30,57—63,72—80,86—91,121,131,151, 190—191,206,210,231残基),同时发现PCV2衣壳 蛋白的N末端十分保守且富含碱性氮基酸(精氨酸 和赖氨酸),在推导氨基酸的第143—145aa处潜在一 个糖基化位点(也叫天冬酞胺信号子NXS或NXT, X代表任意氨基酸).云南毒株和国内其他地区分 离毒株在主要的抗原表位高度保守,但第72—80, 121,131和206氨基酸残基与欧洲,南美洲,美国, 加拿大,泰国和一株中国郑州PCV2毒株相比,分别 有MRFKLDDFV变为MRFNINDFL,T变为S,P 变为T,K变为I. 3讨论 PMWS是近年来新发现的,呈世界性流行分布 的猪病,大量证据表明,PCV2是引起该病的直接原 因(Tischer等,1982).鉴于病毒粒子很小(只有17 ? 106?生物技术中国畜牧兽医2010年第37卷第5期 rim),在细胞培养过程中不产生细胞病变(Tischer 等,1987),所以常规的病毒分离鉴定比较困难.本 研究通过用PK15细胞成功分离到3株云南株 PCV2并在电镜下观察到病毒粒子,PCV2在PK一15 细胞上能够获得最佳的病毒增殖,用D一氨基葡萄糖 作用30mi'n和未用氨基葡萄糖的细胞培养物盲 传3,5代同样可以达到增殖的效果. 通过对PCV2云南分离株与国内外分离株 ORF2序列比对,PCV2云南分离株0RF2基因序 列与世界各国不同地方PCV2分离株基因组的同源 性高达90.7,99.7.系统进化树分析表明,中 国分离株之间关系比较复杂,在PCV2的各个分支 中都有较分散的分布,同时中国很多分离株与美洲, 欧洲各国的亲缘关系都很接近.这些数据表明尽管 各PCV2分离株基因组之间总体上比较保守,但随 地理分布不同还是存在一定程度的变异,这可能与 中国各省市的猪种引进有关. 在基因组的负链上第1034一l735nt片段是 0RF2,它由702个核苷酸组成,推导氨基酸数目为 233aa,编码主要结构蛋白,直接影响到病毒的抗原 性(Pan等,2OO8),与PCV1相比多处基因位点发生 因为PCV1感染不发病,在PCV2核苷酸序列 改变, 中所改变的基因位点可能是其毒力增强的原因.对 不同地域的PCV2分离株的ORF2核苷酸与氨基酸 序列进行比较发现,云南PCV2分离株ORF2上多 处碱基不同,从而导致ORF2上存在着11个高变 区,第3O,57—63,72—8O,86—91,121,131,151,190— 191,206,210,231残基,但哪些氨基酸位点的差异 可以作为分型的标志尚不清楚,其中3个突变区域 (第72—80,121和131残基)与2个主要免疫反应区 域(第65—87残基和第113-147残基)相关(Dupont 等,2008),在免疫压力下,这些免疫决定区域可能是 参与PCV2变异株出现的潜在区域. 参考文献 1AllanGM,EllisJA.Porcinecircoviruses:areview.JVetDiagn Invest,2000,12:3,14. 2 3 4 AllanGM,McNeillyE,KennedyS.PCV-2一associatedPDNSin NorthernIrelandin1990.1VetRec,2000,146:7?,7l2. 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IsolationandIdentification,SquencingandAnalyzingofORF2Genesof PorcineCircovirusType2fromYunnanProvince LIPeng,FENGShu—zhang.,TANGHui—qiong,LIWen—gui,CAIJun LIZuo—sheng.ZHANGYi—fang. (1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changehun130062,China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnologyYunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China; 3.InstituteofVeterinaryScience,theAcademyofMilitaryMedicalSciences,Changchun130062,China; 4.LivestockStationofWenlaiTown,MengziCounty,YunnanProvince,Mengzi661100,China) Abstract:Accordingtothecompletegenomesequencesofporcinecircovirustype2(PCV2)publishedinGenBank,two pairsofprimersweredesigned.TheORF2genomesofthreePCV2isolateswereamplifiedfromthesamplesthatweresimilar tothosepigswithPMWS,andapproximately17nmindiameterunderelectronmicroscopy.Theresultsofhomologyshowed thatnucleotidehomologybetweenthethreePCV2isolateswas99.5一 99.8,andwerecloselyrelatedtotheZhejiangisolate andtheGansuisolate,sharing99.7and90.7,anddisplayed92.0and99.4nucleotidehomologywiththeSwedeniso— lateandtheSouthAmericaisolate,respectively. Keywords:porcinecircovirustype2;isolationandidentification;sequenceanalysis 细胞死亡相关IFN刺激基因的表达因猪瘟病毒毒力强弱而有很大的不同 PatriciaRenson等着邱文英摘译胡小华校 摘要:猪瘟发病的严重程度取决于猪瘟病毒(CSFV)毒 株的毒力强弱.CSFV感染后最早检测到的是淋巴细胞数 目的减少.一些CSFV毒株可以导致淋巴细胞减少症,其严 重程度根据毒株的毒力不同而有所差别.这种淋巴细胞的 耗竭是由于非感染的旁细胞凋亡所引起的.本试验分别用 CSFV强毒株和中等毒力毒株进行感染,于感染前和感染后 3d收集外周血单核细胞,并进行微阵列比较分析,以分析这 些细胞中与毒株毒力相关的转录调节.结果显示,毒株之间 的主要不同在于宿主反应的动力学:对于强毒株细胞的反应 是强烈且迅速的,对于中等毒力毒株则是渐进且迟发的.尽 管两种毒株都对细胞死亡/凋亡相关的IFN刺激基因进行 强烈地正调节,但两者的调节有明显不同,表现在两种不同 毒力毒株介导的淋巴减少症的启动及程度不同.另外,死亡 受体凋亡途径(TRAIDR4,FASL-FAS和TNFafTNFR1) 也会受到不同的调节.研究结果显示,CSFV毒株可能增强 a—IFN反应,导致淋巴细胞的旁杀作用及淋巴细胞减少症, 其严重程度可能是由宿主细胞对IFN产物及下游效应器调 节失控所造成的. 关键词:猪瘟病毒;毒力;旁细胞凋亡;I型干扰素;微 阵列 (原载:VetRes,2010,41(1):7)