鲤鱼不同组织过氧化物酶的活性测定

鲤鱼不同组织过氧化物酶的活性测定 摘要:本文应用愈创木酚为底物～利用分光光度法测定反应液的吸光度～以吸光度的变化速率来 表征过氧化物酶的活力。通过试验得到鲤鱼肾脏、心脏、肌肉三种不同组织过氧化物酶酶活性分别 为312.6、287.1、158.1 u/g～并对鲤鱼不同组织过氧化物酶的活性进行了比较与分析。 关键词:过氧化物酶,愈创木酚,酶活力,分光光度法 Determining Peroxidase Activity Of Different Tissues From Cyprinus Carpio Abstract : It was using guaiacol as substrate and enzyme activity was showed by the OD value variety in the reaction liquid , and the catalytic activity peroxidase was measured by spectrophotometer . And bye the way comparisoning and analysising peroxidase activity of different tissues from cyprinus carpio. In addition, the relevant data of Peroxidase ( POD ) activity is that: the kidney is 10.42 U/g.min, the cardiac muscle is 9.57 U/g.min, and the flesh is 3.43 U/g.min. The end ,repetition test is carried out to confirm the accuracy and precision of the method . Key words : peroxidase ; aniline ; enzyme activity;spectrophotometer 过氧化物酶(peroxidase，POD，EC 1.11.1.7)是一种生物氧化中的末端氧化酶 [1]，能够分解生物体内某些代谢产物需氧脱氢后产生的，对机体有害物质。它广泛的存 在于生物各个组织器官，在肝脏和血液中含量较高，具有一定的解毒功能。 POD作为细胞内重要的组成成分，具有许多非常重要的生理功能。由于其成分和结 构的复杂性，同功酶的多样性，以及多基因编码特点，造成对其功能的认识尚不全面。 POD在食品、医药、环保和化工等行业中已得到广泛应用。POD独特的温度稳定性 和优良的反应性使其成为同类酶中极其重要的一种:环保部门应用POD处理工业废水; 将POD应用到医疗诊断试剂盒，生产其产品的性能与质量均超过了传统的HRP-I(转录 [2]调节蛋白抗体)试剂盒;在树脂生产工业中POD成功的代替了传统合成工业中的甲醛， 1 大大降低了成本。此外，许多大公司都争先恐后的研究开发了POD在生物芯片、多种塑料及建筑材料胶合剂生产中的应用;POD污染水和污染土壤的生物修复中也会有极高的应用价值。 [3]本次实验的主题是探究POD的活性，采用的实验方法是愈创木酚法。即以愈创木酚(邻甲氧基苯酚)和HO为底物，过氧化物酶催化HO放出新生态氧，使无色2222 的愈创木酚氧化成红棕色的四邻甲氧基连酚, 则过氧化物酶活力的大小在一定范围内与产物颜色的深浅呈线性关系，故可通过测定A的变化率来测定过氧化物酶的酶活436 力单位，从而分析比较过氧化物酶的生物性、组织特性。 愈创木酚 + 过氧化氢 ?四邻甲氧基连酚 + 水 实验意义在于更具体、全面的了解、掌握它的特性及催化作用环境，以便更好的在现代生活、高新科技进行应用。 1、实验材料与方法 1(1 原料、试剂与仪器 电分分析天平、研钵、纱布、冰箱、冷冻离心机、微量进样器、比色杯、紫外可见分光光度计、秒表 30%的HO、0.018mol/L的愈创木酚、0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)和22 0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH7.2)、鲤鱼(市场上购买) 1. 2 实验方法及步骤、 1.2.1 待测酶液的制备 称取鲤鱼的心脏，肾脏和肌肉三种组织各4.8g，放进研钵中，再分别加入20ml 2 0.1mol/L的pH7.2的磷酸缓冲液，于冰浴中研磨。再用纱布过滤，取滤液用冷冻离心机在10060r/min的条件下离心10min。沉淀弃去，取上清液，即得到酶原液。给鲤 [1]鱼的心脏、肾脏和肌肉三个不同组织的酶原液分别贴上标签，置于冰箱中冷藏备用。 1.2.2 酶活力测定 向比色杯中加入0.008mol/L的HO溶液0.05ml，0.1mol/L的pH7.0的磷酸缓22 冲液2.8ml，0.018mol/L的愈创木酚0.05ml，于25?的水浴中恒温10min，迅速加入待测酶液0.1ml，以磷酸缓冲液代替酶液作空白对照，反应液总体积3ml。用分光光度计在436nm下测定溶液的光吸收值(A)，每30s读一次，共读3min。重复步骤3 [4]和4五次。 1.2.3 计算 以每半分钟A变化0.01为1个活力单位。以时间为横坐标，A值为纵坐标进行436436 -1线性作图(或用统计方法求得回归方程)，进而计算A的变化速率(A?min)436436来定义酶活力单位(1u)，最后计算鲤鱼不同组织每克鲜重样品中过氧化物酶POD活力 [4]-1-1 的大小，即用A?min?gFw表达过氧化物酶活性。 436 ΔA436nm/min=ΔA样/min-ΔA空白/min 过氧化物酶的活力单位(U/g.min)=ΔA436nm/min×15?(4.8×0.1×0.01×0.5 ) ×30 [其中，15为提取酶液总体积(ml)，4.8为鲜重(g)，0.1为测定时提取酶液体积 (ml),0.5为测定时反应时间(t)，30为酶液稀释倍数.] 2、结果 2.1 实验结果 2.1.1 绘制鲤鱼三种组织过氧化物酶的光吸收值曲线图: 以A值为纵坐标，记录时刻T为横坐标。 436 表1 鲤鱼三种不同组织光吸收值 (A) 时间(min) 0.5 1 1.5 2 2.5 3 心脏 0.111 0.121 0.121 0.120 0.120 0.122 肾脏 0.271 0.277 0.280 0.286 0.288 0.289 肌肉 0.021 0.023 0.022 0.022 0.022 0.022 3 0.2950.1250.29 0.2850.120.28 0.2750.115 0.270.11A/432nm(u/g)0.265t(min)A/432nm(u/g)t(min)0.260.10500.511.522.500.511.522.5 图2 肾脏组织光吸收值曲线图 图1 心脏组织光吸收值曲线图 0.0235 0.023 0.0225 0.022 0.0215 0.021 A/432nm(u/g)0.0205t(min) 0.02 00.511.522.5 图3 肌肉组织光吸收值曲线图 表2 重复性实验数据 (U/g.min) 序号 1 2 3 4 5 6 平均酶活 心脏 288.6 293.4 277.8 282.3 296.1 285.1 287.1 肾脏 309.9 301.8 322.8 315.6 305.7 319.2 312.6 肌肉 150.9 153 164.1 157.5 167.7 155.1 158.1 2. 2 实验数据校对 对所得到的重复性实验数据两两进行方差分析，看置信水平为0.01 时是否有显著性差别，即几次测定结果重复性的好坏。 表3 方差分析表1( T 检验,置信水平a = 0. 10) 心脏 1号 2号 3号 4号 5号 6号 1号 0.1 0.05 0.07 0.06 0.11 4 2号 0.01 0.08 0.12 0.06 3号 0.11 0.05 0.13 4号 0.06 0.14 5号 0.09 表4 方差分析表2( T 检验,置信水平a = 0. 10) 肾脏 1号 2号 3号 4号 5号 6号 1号 0. 08 0. 04 0. 09 0.11 0.05 2号 0. 01 0. 07 0. 13 0. 06 0. 04 0. 09 0. 05 3号 4号 0. 10 0. 06 5号 0. 02 表5 方差分析表3( T 检验,置信水平a = 0. 10) 肌肉 1号 2号 3号 4号 5号 6号 1号 0. 09 0. 06 0. 07 0. 11 0. 08 2号 0. 04 0. 05 0. 10 0. 06 3号 0. 04 0. 09 0. 05 4号 0. 10 0. 06 5号 0. 12 T 0 .95(10) = 1. 81 , T 0 .95(8) = 1. 86 。 由以上数据可知, 六次平行实验测定结果的重复性较好,该酶活测定方法的稳定性 较好，表明方法是可靠的。 3 讨论 3.1 鲤鱼不同组织过氧化物酶的活性比较 通过试验得到鲤鱼肾脏、心脏、肌肉三种不同组织过氧化物酶酶活性分别为312.6 u/g、287.1 u/g、158.1u/g，可以看出过氧化物酶的活性在鱼类肾脏组织中最强，心脏 组织次之，肌肉组织最弱。 3.1.1 过氧化物酶对鲤鱼肾脏的影响 5 肾脏是泌尿系统的组成器官之一，是机体的主要排泄器官。它通过生成和排出尿液，排出体内代谢废物及有害物质，重吸收有用物质，可调节水、渗透压及酸碱平衡来维持机体内环境的稳定，它分泌的各种物质与机体的多种代谢有关，而过氧化物酶(POD)是一种生物氧化中的末端氧化酶，能够分解生物体内某些代谢产物需氧脱氢后产生的，对机体有害物质。 [5]铅、镉、汞等重金属是当前环境污染最重要的因素之一，一些重金属(如铅)为人体及动物体非必需元素。近年来，由于工业的发展，环境中重金属特别是铅的含量越来越高，其毒性已引起人们的普遍重视。肾脏和肝脏是铅的主要蓄积部位，也是铅毒作用的主要靶器官。而过氧化物酶同工酶能够反映生物生长发育的特点、体内代谢状况以及对外界环境的适应性，在铅染毒下，蟾蜍肝、肾组织POD同工酶带活性的强弱发生了明显变化，这种现象可能反映了蟾蜍对重金属毒害的适应性。当重金属进入动物体内后，动物通过同工酶的改变与这种不良环境相适应，使动物体得以生存下去。由此可见，铅染毒可引起动物肝脏和肾脏的中毒性损害，而这种损害又与组织内POD同工酶的变化有着一定的相关性，提示POD同工酶的变化在铅使肝、肾中毒的过程中起着重要作用。 3.1.2 过氧化物酶对鲤鱼心脏的影响 [6]心脏的作用是推动血液流动，向器官、组织提供充足的血流量，以供应氧和各种营养物质，并带走代谢的终产物(如二氧化碳、尿酸等)，使细胞维持正常的代谢和功能。由静脉系将使用后不需要的东西带走，运送到排泄废物的器官，也就是通过渗透及处理，回收可以再利用的部分，排出无用或有害部分。这一套密闭的管道系统就是循环系统。而POD在心血管也有广泛的分布，具有多种生物学效应，可促进脂肪细胞分化和脂肪生成，增强机体对胰岛素的敏感性，调节体内糖平衡，抑制炎症因子生成及炎症形成，影响肿瘤生长等。过氧化物酶在组织过氧化反应过程中发挥重要的保护作用，是抗心肌缺血损伤的重要因子。 [7]血红蛋白是脊椎动物红细胞内的呼吸蛋白，在生物体内起着传输氧、分解H0、22传递电子等与氧和能量代谢有关的重要作用(人们对其的研究主要集中在其结构、输 氧功能，以及蛋白质分子与电极之间电子转移过程的机理等方面(对于其具有的过氧化物酶催化特性的研究有限。血红蛋白和天然过氧化物酶具有相同的铁卟啉辅基和相似的空间结构，可以作为过氧化物模拟酶催化H0氧化对甲基酚的反应，发现具有典型的过22 氧化物酶的特性，并且有良好的酶催化活性。 3.1.3 过氧化物酶对鲤鱼肌肉的影响 6 在肌肉组织中，它的含量相对就较少了，因为肌肉组织主要作用是供能，以及连接,保护,支持和营养等作用，进行代谢分解的作用相对较弱，所产生的代谢产物、代谢废物也相对堆积较少。 3.2 过氧化物酶在生物体内的作用 酶是生物体内产生的具有专一性和高度催化活性的蛋白质，生物体的生长、发育、繁殖等各种生命活动部离不开酶的催化作用。 [8]过氧化物酶(peroxidase，POD，EC 1.11.1.7)是以铁卟啉为辅基的氧化酶，催化HO氧化某些酚类、芳香胺和抗坏血酸等还原性物质。它是一类从植物、动物、22 微生物中提取出来的氧化还原酶，其以血红素为辅基，参与生物体内的生理代谢。在生命活动过程中，过氧化物酶主要是催化分解生物体内的氧化物或过氧化物氧化分解其它毒素。由于过氧化物酶对氢受体HO具有独特的活化作用，其可以高效地催化活化22 HO。在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用，如清除细胞内的有害物质HO、保22 22护酶蛋白以及促进生物体分解体内某些代谢产物需氧脱氢后产生的，对机体有害物质。它在肝脏和肾脏含量较高, 具有一定的解毒功能。在此方面,已经有许多的学者对机体的生理意义以及在临床方面的作用做过深入的研究工作 。 除此之外, 它还是生物体生长及抗病重要生理生化指标。因此, 不少学者都对该酶做了深刻的研究 , 特别是植物体中过氧化物酶的研究, 其特殊的理化性质已受到重视。 同样的，过氧化氢酶也可以帮助催化机体内的过氧化氢分解为水和分子氧以解毒，所以，两种酶在氧化还原作用体系中最起作用的酶活性，是生物体抗病性的重要生化指标。过氧化物酶与过氧化氢酶的区别在于:过氧化氢酶能使HO分解为HO和O。反应2222式如下 而过氧化物酶还能利用HO氧化酚类及胺类等有毒的代谢产物，故它对机体有 22 双重的保护作用。 [9_10]在某些组织细胞内还有一种含硒的谷胱甘肽过氧化物酶，是生物体内一种重要的含硒酶, 硒是该酶活性中心的构成成分。 硒是人类和动物的一种必需微量元素, 它的缺乏和过量均可导致疾病的发生。在生物体内, 它主要通过构成含硒酶来发挥作用。该酶能利用还原型谷胱甘肽(G-SH)作电子供体使HO还原为HO，也能使其它过222 7 氧化物还原，所以对组织细胞有保护作用，减少它们对机体的损伤作用。 谷胱甘肽过氧化物酶是机体抗氧化防御体系中重要的酶之一,能清除HO防止细22胞脂质过氧化,延缓生命衰老。自由基学说是现代抗衰老学说中的一种。自由基学说认为,自由基能使细胞受到损害,导致人体衰老和死亡。同时,这种学说还认为凡能抑制和消除自由基的物质,均具有抗衰老作用。因此研究和完善自由基学说,筛选能防御自由基损害的抗衰老药物,对防治老年病和提高人类生存质量,延年益寿有着不可低估的作用。综上所述,人体产生的自由基能加速人体衰老和死亡,而抑制和清除自由基能延缓人体衰老过程。因此研究和应用抗氧化剂和抗氧化酶类药物,防御自由基对人体的健康损害有重要的现实意义。 3.3 对过氧化物酶的展望 [6] 过氧化物酶是存在于生物体的一类较丰富的酶蛋白，通过化学手段合成的过氧化物模拟酶既可以保持天然酶的催化活性，又可以克服天然酶在稳定性差、价格昂贵等方面的不足;而固定化酶可以较好地避免酶易失活的缺点，并且可以根据需要固定化酶和载体的结构，制备高活力的固定化酶，同时使其能重复使用而不失活;对酶催化反应微环境模拟的研究，将为人们提供更多的有关于生物体内酶催化反应的信息，为揭开生命奥秘提供信息;优良的氢供体底物可以提高酶反应的响应性能，在研究酶与底物的构效关系、酶的作用特点方面有重要的意义。酶法分析是将生命科学、分析化学和医学等学科结合起来进行研究的热点内容，其研究具有很大的前景。 3.4 实验过程中应特别注意的事项 (1)保持待测材料的酶活:买鲫鱼时应保证材料的新鲜，及时制酶液，研磨时必须保证是在冰浴的环境中，制得的酶液在冰箱中冷藏，测酶活时每次取了酶液要及时放回冰箱中，避免酶失活。 (2)测定时注意控制反应时间:实验过程中一定要注意各步骤的时间，特别是加了酶液后要立即用分光光度计进行光吸收值的测定，测定过程特别要严格控制时间，每30s读一次，共读3min。 实验过程中误差是不可避免的，但我们进行每一步都要尽可能地精确以减小实验误差。 参 考 文 献 1、 赵操,冯兴水. 黑斑蛙过氧化物酶活性测定的研究.四川动物,2006,25,2,: 241-243. 8 2、 李增新, 王彤.对氨基联苯—HO—HRP 分光光度法测定HRP的研究. 化学试剂, 22 2005 ,27卷 3期 3、 周远明, 刘均洪.过氧化物酶活性测定的研究. 四川动物～2006～25,2,:241-243. 4、 宁正祥.食品成分分析手册. 中国轻工业出版社, 1994 5、 贾秀英～董爱华.铅对蟾蜍肝、肾过氧化物酶和酯酶同工酶的影响. 生态学杂志～ 2005～24(2):159 162 6、 罗勇军～罗光富～黄应平. 过氧化物酶模拟及应用研究进展. 分析测试学报～2004～ 23卷 5期 7、 王全林～刘志洪～蔡汝秀～吕功煊. 血红蛋白的过氧化物酶催化特性研究. 化学学 报～2OO3～61卷 1期 8、 刘稳,方靖,高培基. 过氧化物酶研究进展. 纤维素科学与技术,2000 ,8(2) :60 -64. 9、 王咏梅.自由基与谷胱甘肽过氧化物酶.解放军药学学报～2005～21卷 5期 10、雷明光～张舒～张冰.谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶研究进展. 生物学通报～2005～ 40卷 5期 9 10 11