有关蚕豆根尖微核试验的问题分析及改进策略

有关蚕豆根尖微核试验的问题分析及改进策略 有关蚕豆根尖微核试验的问题分析及改进 策略 河北农业科学,2010,14(7):166—169 JournalofHebeiAculturalSciences编辑杜晓东 有关蚕豆根尖微核试验的问题分析及改进策略 肖健,王璐(南京农业大学资源与环境学院,江苏南京210095) 摘要:蚕豆根尖微核技术是1种新兴的快速生物测试方法.该方法已被列入国家" 生物监测技术规范(水环境 部分)",而且在监测重金属,有机污染物等环境致突变性物质方面也得到了充分应 用.综述了蚕豆根尖细胞微 核技术从产生到最终确立的进程,并重点就实际操作过程中存在的一些问题进行 了讨论,提出了相应的改进策 略,以期为蚕豆根尖微核试验技术的完善和广泛使用提供依据. 关键词:蚕豆根尖微核试验;生物测试方法;问题;改进 中图分类号:X502文献标识码:A文章编号:1008—1631(2010)07-0166-03 ProblemsofMicronucleusTestinViciafabaRootTipsandImprovementStrategy XIAOJian,WANGLU (CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China) Abstract:ThemieronucleustechnologyinVicia知 baroottipswasanewrapidbioassaymethod,whichwasarrayedinthe NationalBiologicalMonitoringTechnicalSpecificationforWaterEnvironment.Itwaswidelyusedinmonitoringtheheavy metals,organicpollutantsandotherenvironmentalmutageniematters.Thedevelopmentprocessofmicronucleus technologyinbaroottipsWaSintroduced,theproblemsinpracticaloperationwerediscussed,andtheimprovement strategieswereputforwardtoprovidethebasisfortheperfectionandwideapplicationofthete chnology. Keywords:MicronucleustechnologyinViciafabaroottips;Bioassaymethod;Problems;Im provement 随着工农业生产的迅速发展,新的化学物质和工业 "三废"不断进入人们的生活环境,其中有许多可能对 遗传物质产生损害并造成致癌,致畸,致突变等遗传毒 理效应的环境致突变物("三致"物质)对人类健康和 生存构成严重危害.因此,人们希望能够找到快速检测 环境致突变物的方法,准确测定相关"三致"物质的 毒性以及环境的受污染程度. 蚕豆根尖微核技术是一种新兴的快速生物测试方 法,已被列入国家"生物监测技术规范(水环境部 分)",而且在监测重金属和有机污染物等环境致突变 性物质方面也得到了充分应用.以目前科学发展的实际 情况为基础,对蚕豆根尖微核试验在具体应用中存在的 一 些问题进行了综述,并就相应的改进措施进行了 探讨. 1微核试验简介 微核试验技术是以动植物为材料,利用细胞生物学 的方法检测细胞的微核率(micronucleusfrequency, MNF),以此表示动植物细胞染色体受损程度的一种方 法.它能较准确地反映致突变因子对细胞产生遗传毒害 作用的大小和该种细胞染色体的稳定性. 微核试验的研究对象已经从骨髓红细胞扩展到多种 收稿日期:2010-05-29 基金项目:南京农业大学SRT项目(0907A16) 作者简介:肖健(1989一),女,江苏南京人,本科在读,专业方 向为环境工程.E—mail:1117118@njau.edu.cn. 在体细胞和离体培养细胞.体外培养的血淋巴细胞,各 种哺乳动物细胞系,原代肿瘤细胞,肝细胞等动物细胞 以及蚕豆根尖,紫露草等植物细胞等已广泛用于微核试 验研究,可根据试验需要选择合适的细胞进行微核试验 研究. 微核试验因灵敏,稳定且能检测染色体完整性改变 和染色体分离改变2种遗传学终点,而得到广泛应用. 随着分子生物学技术的发展,现已成为可检测多终点的 分子毒理学方法,在致突变物筛选和外来化合物生物毒 性作用机制研究等领域有广阔的应用前景. 2蚕豆根尖微核试验(Vicia-micronucleustest)原 理及其建立 蚕豆细胞染色体数目较少(只有12条)且体积较 大,是细胞遗传学研究常用的材料之一,又因为其根尖 分生细胞多,因此染色体的形态和数目变化很容易观 察.早在1959年,放射生物科学家已经用蚕豆的根 尖细胞来进行x射线的遗传损伤研究.到了20世纪 70年代,蚕豆根尖染色体畸变技术已发展得相当成熟, 作为1种监测化学品遗传学毒性的方法为人们所知,并 得到了广泛采用.1982年Degrassi和Rizzoni正式创立 蚕豆根尖微核试验.他们指出微核试验与染色体畸变 实验同样具有准确,快速,有明显的剂量.效应关系等 特点,操作更简便,也更适于大批量样品的检测,并提 出建立检测淡水污染诱变剂的警报系统.陈光荣等 从筛选并应用敏感品种——松滋青皮豆开始,经过一系 第7期肖健等:有关蚕豆根尖微核试验的问题分析及改进策略?167? 列监测水质污染,大气污染和农业土壤污染之后,提出 了"污染指数法".他们首先在国内建立了利用蚕豆初 生根尖微核技术监测淡水污染的报警系统和监测系统. 蚕豆根尖细胞微核试验技术发展很快,目前已广泛 应用于医药,农药,食品,化妆品和环境化学物质等的 检测,成为有关毒理安全性评价的必做试验,特别是在 环境致突变物检测方面的应用更是日益成熟.分别从试 验准备,试验过程和结果处理3个方面阐述该试验的特 点,并讨论应用该方法所存在的一些问题. 2.1试验准备 2.1.1蚕豆材料的选择金波等从1983年开始研究 有关蚕豆根尖微核试验蚕豆筛选的问题,采用水胺硫 磷,马拉硫磷(4049),乐果等农药以及5.溴脱氧尿嘧 啶核苷等化学药剂,设置不同浓度梯度,分别侵染通山 大板豆,应城蚕豆,襄阳大脚板,巴东胡豆,阳新蜜蜂 豆,松滋青皮豆,浙江田鸡青,浙江大白蚕,四川鞋板 豆,启东矮秆豆,白皮蚕豆和行皮蚕豆等14个品种, 然后对侵染后蚕豆的微核率进行F测验和SSR测验,结 果发现,松滋青皮豆对农药和化学试剂的敏感性较为理 想,可在较广泛的浓度范围内进行毒性监测试验.目 前,有关蚕豆根尖微核试验大多选用松滋青皮豆作为试 验材料. 虽然这能够削弱由于试验材料的差异所导致试验结 果的不一致性,但是蚕豆个体和蚕豆生长环境的不同, 同样也会对试验结果带来一定的影响.用蚕豆根尖细胞 微核技术对大理州2种蚕豆(鹤庆白皮蚕豆和凤仪青皮 蚕豆)对重金属毒害的敏感性进行了比较测试,结果发 现,虽然都是蚕豆,而且生长在同一地区,但二者对重 金属的敏感程度却不同,后者明显高于前者.Qianxw 等进行了蚕豆对cd和Ph"的敏感性研究,其结果与段吕群等的研究结果也不一致. 可以看出,蚕豆根尖微核试验不可避免地存在由于 品种,个体,培养的生长环境等方面带来的影响.因 此,如何将这种影响降低到最低程度,需要通过大量试 验来进一步确定. 2.1.2样本浓度的配置该方法主要用于水环境样品 的测试,而水样需要进行前处理,包括沉降,过滤,稀 释或浓缩等步骤,必要时还要调节pH值,以避免其他 因素对试验结果造成干扰.但是,有关适合蚕豆生长的 pH值研究报道很少,这需要进一步通过试验确定. 同时,样本浓度梯度的设置也是1个非常关键的问 题.研究发现,蚕豆根尖细胞与细菌细胞和其他真核细 胞一样,具有应激反应,在接触低剂量压力因子(如诱 变剂,热休克,重金属离子)之后,会对更高的剂量产 生适应性,而在适应中导致遗传毒作用对细胞的表观损 伤变小.有人提出在诱变因子的2次处理之间将温 度降低到12(=c,或在预处理前先用放线菌酮抑制蛋白 质的合成作用,可导致这种适应反应的终止.这一问题 的研究,有助于研究生物,特别是植物对诱变剂适应性 的产生和进化机理,并且有一定的实际应用价值.但是 到目前为止,该问题没有得到很好解决,这难免会成为 蚕豆根尖微核试验的一大弊端. 如在测定重金属毒性的试验中,段昌群等研究表 明,不同浓度的重金属对细胞分裂的影响不同,低浓度 时表现为促进作用,而高浓度时则表现为抑制作用.如 果不知道低浓度,高浓度所指的具体范围,而我们在试 验开始就任意设置浓度梯度,若都设置在1个区间或是 两者之间等,就会得出类似于某某浓度的重金属水样是 严重污染的结论,这显然没有任何意义.而且浓度梯度 的设置要与有关国家一致,这是需要特别注意的. 2.2试验过程 蚕豆根尖微核试验过程主要分为蚕豆浸种催芽,毒 液浸染蚕豆根尖,根尖细胞修复培养,固定,解离,席 夫试剂(Sniff试剂)染色,显微镜下观察微核等步骤. 目前运用的蚕豆根尖微核试验检测,大部分是遵循这些 步骤进行的,所得结果也比较符合实际污染情况.这里 重点讨论微核的确定和计数方面的问题. 在微核的确定方面,因人而异,具有很大的主观 性,因此,往往造成试验结果不准确.究竟该如何判断 微核,需要科学的方法.微核的识别应从大小,着色深 浅,有无染色质颗粒和折光率等几方面进行判断.正常 情况下,本底微核率应?10%o.如果本底太高,有可能 反映出试验条件,方法或试剂需要重新检查.目前多数 学者认为,在镜检细胞微核时,应按下列标准计数微 核:(1)凡主核大小1/3以下,与主核分离的小核; (2)小核的着色与主核相当或稍浅;(3)小核形态可 为圆形,不规则等. 计算微核的数量也是一件复杂的事情.通常正常步 骤是取出根尖分别置于载玻片上,切除根冠0.5mm后 截取1mm左右的根尖分生组织,对各种不同处理的根 尖分生组织进行常规压片,每个处理各取3个根尖压 片,在高倍镜下观察压片根尖分生区细胞分散良好的区 域,并统计不少于1000个细胞中的微核数,计算出每 个根尖的MCN(%.).目前已有的方法是人工计数,但 其工作量较为庞大.近几年来,人们对微核技术的研究 更趋于精细化,新近研究的一种双激光流式术监测方 法,对微核自动检测速度较人工观察高40倍以上". 为了研究微核的需要,制备微核标本技术也在发展,但 主要是应用在动物微核检测方面,而针对蚕豆根尖微核 计数的开发研究有待于有关专家进行研究与突破. 2.3结果处理 通常以各测试样品(包括对照组)的微核率或污 染指数来确定f亏染物的污染程度. 2.3.1计算微核率蚕豆微核试验中微核率的计算公 式为: MCN(%.)=某测试样点(或对照组)观察到微 ? 168?河北农业科学 核的细胞数/某测试样点(或对照组)观察的细胞数× l000%0 2.3.2判断污染指数(PI)污染指数的计算公式为: PI=样品实测MCN平均值/对照组MCN平均值 根据《全国生物技术监测规范一蚕豆根尖微核技 术》规定的污染指数划分标准,采用污染指数(PI)值 来划分受污染程度.具体标准为:PI值0,1.5,基本 无污染;PI值1.5,2.0,轻污染;P1值2.0,3.5,中 污染;PI值3.5以上,重污染".凡数值在上,下限 时,定为上一级污染.该方法可避免因试验条件等因素 带来的微核率本底的波动. 当然这是一种标准的数据处理办法.但是这种污染 指数(PI)仅是用来评价水质污染情况的,那么如果将 这个标准推广到土壤,大气乃至环境"三致"物质的 监测,将得不到科学的结果.这将限制蚕豆根尖微核试 验更广泛的用途.有研究借鉴国家环境保护总局用蚕豆 根尖微核试验对水质污染评价的"污染指数"概念, 提出"微核指数"的概念作为判断环磷酰胺是否致蚕 豆根尖细胞突变的指标,以直观反映试验材料是否致突 变及其严重程度. 微核指数计算公式为: 微核指数=样本的微核率/阴性对照的微核率 根据污染指数在0,1.5为基本没有污染,1.5, 2.0为轻污染,2.0,3.5为中污染,3.5以上为重污染, 将样本的蚕豆根尖微核指数>1.5定为开始产生致突变 作用.这为我们提供了一个很好的思路.应该将蚕豆微 核试验的结果与土壤,大气,环境"三致"物质等相 关标准做好一一对应的衔接,使其成为更具有生命力的 检测方法. 可以看出,至少到目前为止,以蚕豆根尖微核试验 为基础建立的世界范围内通用的遗传毒理学检测/监测 系统,仍然或多或少地存在一些问题,该方法的进一步 成熟和推广需要时间和实践的考验. 3蚕豆根尖微核试验的改善 针对蚕豆根尖微核试验过程中出现的一些问题,应 该采取一些措施尽量避免误差的产生,使测定结果更具 有科学价值. 3.1充分准备试验 在设计试验步骤时,从蚕豆材料的选用,个体差异 的考虑,毒液浓度的配置,试验环境的安排等方面考 虑.在试验方法和结果处理过程中要在遵循国家标准的 情况下适当进行改进,通过对数据的分析来确定结果的 可信性. 3.2与彗星试验结合 应用蚕豆根尖微核试验和彗星试验分别测定扬中地 表水遗传毒物污染,结果表明,2种试验方法测定的水 样污染趋势一致.各水样引起的DNA损伤与溶剂对 新坝大桥水样,根据微核试 照组比较均有极显着差异. 验结果判断为基本无污染(P/<1.5),而在彗星试验 中较低剂量(相当于原水2mL/管)时就可引起彗星细 胞拖尾率极显着增加,损伤程度也明显高于溶剂对照 组,并表现一定的剂量一效应关系.可以看出,彗星试 验比蚕豆根尖微核试验更为敏感.Goethem等"在微核 试验与彗星试验的比较研究中也指出,微核试验与彗星 试验结合使用,在研究化学物质的致突变性和致突变机 理中是值得推荐的. 3.3标准的广泛性 可以借鉴污染指数(PI)的思路,进一步制定蚕豆 根尖微核试验在土壤,大气和环境"三致"物质等测 定方面的污染鉴定标准.并且能够结合相关国家标准以 及其他检测方法,建立起1个更加科学,快速,准确的 检测体系,以满足时代发展的不同需要. 4小结 蚕豆根尖微核试验是一种世界范围内广泛推广运用 的环境致突变性检测技术.其具有材料方便,培养简 单,技术容易掌握,成本低等优点,而成为目前研究和 运用较多的,拟以代替动物培养细胞检测环境"致癌, 致畸,致突变"物质的高等植物体细胞检测系统. 包括中国在内的许多国家和世界组织,如美国,欧共体 成员国以及联合国环境规划署(UNEPA),世界卫生组 织(WHO)等,已将它作为1种常规的环境污染物和 危险化学品的检测技术'. 在充分肯定该方法优点的情况下,我们也要认识到 其自身存在的一些问题.通过大量的试验分析,希望能 够有效地得到解决其在试验准备,试验过程,结果处理 方面存在的不足.蚕豆根尖微核试验一定会在不断发展 的过程中得到更好的改进和推广. 参考文献: [1]张俊然,朱惠刚.遗传毒理学短期测试方法的发展及在 检测饮用水方面的应用[J].上海环境科学,1986, 15(2):38—41. 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