声触诊组织量化技术对大鼠肝纤维化分期诊断及与病理相关性研究（可编辑）

声触诊组织量化技术对大鼠肝纤维化分期诊断及与病理相关性研究（可编辑） 声触诊组织量化技术对大鼠肝纤维化分期诊断及与病 理相关性研究 广州医学院 硕士学位论文声 触 诊 组 织 量 化 技 术 对 大 鼠 肝 纤 维 化 分 期 诊 断 及 与 病 理 相 关 性 的 研 究 Correlation Research of Virtual Touch Tissue Quantification and Pathology on Liver Fibrosis Model in Rats 作 者 姓 名: 胡 志 文学 科 、 专 业 : 影 像 医 学 与 核 医 学 指 导 教 师: 柳 建 华 教授2012 年 3 月 目 录 中英文对照表1 中文摘要. 2 英文摘要. 5 前 言8 材料与方法. 10 1 实验材料10 1.1 主要试剂10 1.2 主要抗体11 1.3 主要仪器. 11 1.4 试剂配制. 12 2 实验方法13 2.1 实验动物. 13 2.2 实验方法. 13 结 果 18 1 超声监测下皮下注 射 TAA 建立肝纤维化模型 成模结果. 18 2 血清学检查结果. 19 3 病理结果20 3.1 病理大体观察:20 3.2 病理学分析:20 4 影像学检查. 22 讨 论 27 结 论 34 展 望 36 参考文献39 学习期间发表论文情 况. 42 综 述 43 致 谢 49 学位论文原创性声明50 广州医 学院 硕士 学位 论文声 触诊 组织 量 化技术 对大 鼠肝 纤维 化分 期诊断 及与 病理 相关 性的 研究 中 英 文 对 照 表 英文缩写 英文全称 中文名 ALT Alanine Aminotransferase 谷丙转氨酶 ARFI Acoustic Radiation Force Impulse Imaging 声辐射力脉冲成像 AST Aspartate Aminotransferase 谷草转氨酶 CE Compression Elastography 压迫性弹性成像 CIV Collagen Type IV ?型胶原 ECM Extra Cellular Matrix 细胞外基质 FS FibroScan 瞬时弹性波扫描 HA Hyaluronic Acid 透明质酸 HF Hepatic Fibrosis 肝纤维化 IV-C Type IV Collagen IV 型胶原 LN Laminin 层粘连蛋白 PIIIP Procollagen Type III Protein ?型前胶原 ROI Regions of Interest 感兴趣区 TAA Thioacetamide 硫代乙酰胺 TE Transient Elastography 瞬时弹性成像 UE Ultrasonic Elastography 超声弹性成像 VS Vibration Sonoelastography 振动性弹性成像 VTQ Virtual Touch Tissue Quantification 声触诊组织量化技术 1 广州医 学院 硕士 学位 论文声 触诊 组织 量 化技术 对大 鼠肝 纤维 化分 期诊断 及与 病理 相关 性的 研究 声 触 诊 组 织 量 化 技 术 对 大 鼠 肝 纤 维 化 分 期 诊 断 及 与 病 理 相 关 性 的 研 究 作 者 姓 名: 胡 志 文学 科 、 专 业 : 影 像 医 学 与 核 医 学 指 导 教 师: 柳 建 华 教授 中文 摘要 研究背景 肝纤维化(Hepatic Fibrosis ,HF ) 是 肝 脏 对 各 种 原 因 所 致 的 慢 性 肝 损 伤 的 过 度 [1,2] 修 复 反 应 , 是 慢 性 肝 病 发 展 成 为 肝 硬 化 必 经 的 病 理 过 程 。 早 期 的 肝 纤 维 化 如 给 予 有效的治疗可以发生 逆 转 , 早 期 诊 断 和 治 疗 可 阻 止 其 向 肝 硬 化 和 肝 癌 方 向 的 恶 性 发 [3,4] [5] 展 。 目 前 , 肝 纤 维 化 诊 断 的 金 标 准 是 肝 组 织 活 检 和 病 理 学 检 查 , 然 而 肝 脏 穿 刺 [6,7] 是一种有创性检查, 具 有一定风险 , 因 此 寻 找 准 确 、 可 靠 的 无 创 检 查 方 法 为 肝 纤 [8,9] 维化的病情判断和疗 效 考核提供依据非常有 必 要 。 近 年 来 , 随 着 超 声 诊 断 技 术 的 发 展 , 超 声 弹 性 成 像 (Ultrasonic Elastography ,UE ) 技术受到广泛关注 并 迅猛发展。 它能客观、无创、真 实 地还原肝脏受累部位 的 情况及肝脏形态特点 , 有望成为新的 诊断肝纤维化及早期 肝 硬化的无创手段。 研究目的 本研究拟通过大鼠肝 纤 维化模型,应用德国 Siemens Acuson S2000 型 高 档 彩 色 多 普 勒 超 声诊 断 仪的 声触 诊 组 织 量化 技 术(Virtual Touch Tissue Quantification , VTQ ) 诊 断 大 鼠 肝 纤 维 化 程 度 , 以 肝 生 化 指 标 、 病 理 学 诊 断 作 为 金 标 准 , 评 价 VTQ 检查结果 的准确性 及 灵 敏 性 , 为 VTQ 的 临 床 应 用 提 供 重 要 的 基 础 资 料 。 2 广州医 学院 硕士 学位 论文声 触诊 组织 量 化技术 对大 鼠肝 纤维 化分 期诊断 及与 病理 相关 性的 研究 材料与方法 1 、50 只 SD 大 鼠 在 超 声 监 测 下 使 用 4% 硫 代 乙 酰 胺TAA皮下注射法制备大鼠 肝纤维化模型(模型 组 45 只,对照 5 只 ) 。 首 次 注 射 采 取 大 腿 内 侧 腹 壁 皮 下 注 射 4%TAA 生理盐水溶液 1ml 为 初 始 剂 量 诱 导 制 模 , 从 第 二 次 用 药 开 始 调 整 药 量 为 200mg/kg。每周称重并使用超声诊断仪进行 VTQ 检查。根据检查结果 对用药次数 进行调整。建模开始 后 5w 、9w 在 模 型 组 中 随 机 抽 取 15 只 大 鼠 , 对 照 组 中 抽 取 2 只 大 鼠 , 经 超 声 检 查 采 集 数 据 后 处 死 并 采 血 进 行 血 清 学 检 查 , 肝 脏 取 材 作 病 理 分 析 , 其余动物在 12w 全 部 以 同 样 方 法 处 死 取 材 。 2 、 大鼠麻醉脱毛后经皮 使用德国 Siemens Acuson S2000 型 高 档 彩 色 多 普 勒 超 声 诊断仪的声触诊组织 量 化技术(Virtual Touch Tissue Quantification , VTQ)及弹性 硬度半定量分析诊断 大 鼠肝纤维化程度,收 集 肝脏纤维化数据。 检 测 部 位 均 为 右 侧 肝叶组织,弹性成像 的 感兴趣区域均尽量 避 开 肝叶分界处及肝内大 血 管。 每 只大鼠 均 选用不同 的 区 域 测 量 7 次。 3、检测患鼠肝脏生 化指 标(ALT 、AST 、HA 、LN 和 IV-C 等),以组织病理 学结果及评分作为金 标 准,采用统计学方法 分 析评价声触诊组织量 化 技术对大鼠肝 纤维化模型的病变程 度 诊断敏感性和特异性 , 并在此基础上探讨声 触 诊组织量化技 术对大鼠肝纤维化模 型 分级的准确程度及诊 断 应用价值。 结 果 l 、 动 物 模 型 造 模 成 功 : 模 型 组 动 物 共 45 只 , 对 照 组 4 只。模型组 造 模 期 间 死 亡 5 例 , 其 中 3 例(60% ) 死 于 5w 前 , 提 示 诱 导 失 败 ,6w -8w 未 发 生 模 型 动 物 死 亡,9w 后 因 动 物 肝 功 能 损 害 明 显 出 现 了 正 常 死 亡 2 例。经 过 12w 的 造 模 , 成 功 建 模: S1-S2 期 12 只,S3-S4 期 11 只 , 肝 硬 化 期 14 只 。 各 期 肝 纤 维 化 及 肝 硬 化 总 造 模成功 36 例 , 成 功 率 为 90%,全部 纳 入 实 验 研 究 。 2、病理诊断结果:S1 -S4 模 型 组 动 物 肝 脏 肿 胀 , 颜 色 暗 红 , 较 正 常 变 浅 , 符 合肝纤维化表现。肝硬化模型组动物肝脏失 去 光泽,质地变硬,体 积 萎缩,表面凹3 广州医 学院 硕士 学位 论文声 触诊 组织 量 化技术 对大 鼠肝 纤维 化分 期诊断 及与 病理 相关 性的 研究 凸 不 平 , 呈 小 颗 粒 状 改 变 , 符 合 肝 硬 化 表 现 。HE 染色及 Masson 三 色 染 色 均 提 示 动 物模型造模成功并符 合 实验分组要求。 3 、 肝 纤 维 化 不 同 分 期 血 清 学 纤 维 化 指 标 变 化 : 各 血 清 学 纤 维 化 指 标 随 纤 维 化 分 期进展依次升高, 在肝硬 化期达到高峰。 血 清 学 正 态 性 检 验 显 示 AST 、 ALT 、 IV-C 、 HA 的分布不符合正态 分布,而 LN 符 合 正 态 分 布 。 4、影像学 VTQ 数 据 统 计 表 明 : 建 模 成 功 的 36 例肝纤维化/ 肝 硬 化 动 物 及 5 例 对照测得:VTQ 值 测 得 最 低 0.79,最高 3.56 。 对 照 组 1.25?0.20 ,A 组 1.52?0.22 , B 组 1.89?0.18 , C 组 2.45?0.34 。 组 组 间 两 两 相 比 统 计 学 差 异 有 显 著 性 意 义 (p0.000 ) 。 Control ,Group A ,Group B ,Group C 分 布 区 间 有 明 显 聚 集 , 区 分 良 好 。 5 、VTQ 结果分析显示 ALT 、IV-C 与 VTQ 各项指标间均存在正相 关 关系,但 相 关 程 度 不 强 , 相 关 系 数 均 在 0.3-0.4 。AST 、HA 与 VTQ 各 项 指 标 间 不 存 在 相 关 关 系 ,P 值均大于 0.05 。 6 、VTQ 与 病 理 金 标 准 对 比 , 可 以 构 建 出 判 别 方 程 为 Y3.519* VTQ03+3.302* VTQ07-12.813 。 采 用 回 代 验 证 和 交 互 验 证 的 方 法 验 证 该 判 别 方 程 , 结 果 显 示 回 代 验 证和交互验证的判别 准 确率均为 92.3% 。 结 论 1 、 通 过 超 声 监 测 下 皮 下 注 射 TAA 法建立 SD 大 鼠 梯 度 肝 脏 纤 维 化 模 型 效 果 良 好 , 超 声 监 测 造 模 组 动 物 死 亡 率 为 10% , 肝 纤 维 化 形 成 率 为 90% , 效 果 明 显 优 于 传 统方法组。根据超声 弹 性成像结果调整 TAA 的 诱 导 剂 量 , 可 成 功 诱 导 大 鼠 肝 纤 维 化,降低大鼠死亡率 , 并显著提高肝纤维化 形 成率和质量。 2、通过大鼠肝纤维 化模 型进行的动物实验显 示 :以超声弹性成像技 术 ,运用 VTQ 诊断大鼠肝纤维化 程度是可行的。VTQ 数 值 与 肝 生 化 指 标 关 系 不 密 切 。 以 病 理学诊断作为标准的 对 比研究表明 ,VTQ 与 病 理 金 标 准 的 对 比 , 可 以 构 建 出 判 别 方 程为 Y3.519* VTQ03+3.302* VTQ07-12.813 。 采 用 回 代 验 证 和 交 互 验 证 的 方 法 验 证 该判别方程,结果显 示 回代验证和交互验证 的 判别准确率均为 92.3%,具有较高的 准确性。 关 键 词 : 超 声 弹 性 成 像 ;声触诊组织量化技 术 ;大鼠;肝纤维化模 型 4 广州医 学院 硕士 学位 论文声 触诊 组织 量 化技术 对大 鼠肝 纤维 化分 期诊断 及与 病理 相关 性的 研究 Correlation Research of Virtual Touch Tissue Quantification and Pathology on Liver Fibrosis Model in Rats Abstract Background Hepatic Fibrosis HF is an excessive repair response to chronic liver damage in the liver due[1, 2] to various reasons. It is an intermediate process of chronic liver disease to CirrhosisEarly Hepatic Fibrosis can be reversed if give effective treatment.Early diagnosis and treatment can [3, 4] prevent or stop the process and reduce the chance of Cirrhosis and Liver CancerCurrently, [5] Liver Biopsy and pathological diagnosis is the gold standard for diagnosis of HFHowever, [6, 7] Liver Biopsy is an invasive examination with certain risksTo find an accurate, reliable and [8, 9] noninvasive method for the diagnosis of HF is necessary and urgentlyIt can provide help for diagnosis and evaluate the effect of the treatment for HF. In recent years, with the significant development of ultrasound diagnostic techniques, Ultrasonic Elastography UE receives widely concern. It is an objective, non-invasive technique to exam the liver and can restore the liver affected area and liver morphological characteristics vividly. It is expected to become the new non-invasive means of diagnosis of HF and early Cirrhosis replacing Liver BiopsyPurposes Our research apply Siemens Acuson S2000 German Color Doppler ultrasound using the Virtual Touch Tissue Quantification VTQ technique to examine a rat Hepatic Fibrosis model, and try to diagnose the degree of Hepatic Fibrosis in rats. Analyze the correlation of VTQ and Serological Test results. By using pathological diagnosis as gold standard, we aim to find out the accuracy, sensitivity of the VTQ examination and provide basic research of clinical application base on ARFI techniqueMethod 1. We build Hepatic Fibrosis animal model with 50 SD rats using 4% Thioacetamide TAA under ultrasound monitoring (model group 45 , control group 5 ) Using 4% TAA 1ml for the first injection as a induction dose and adopt abdominal subcutaneous inner thighs. We adjust the dose to 200mg/kg from the second induction. Weighing and examine weekly with ultrasound. Adjust the dose based on ultrasound examination results. Randomly selected 15 rats from model group, and 2 from the control group, execute and take blood test after ultrasound examination. Take the liver out for histological analysis. Execute all the remaining animals 12w all were sacrificed in the same way 2. Rat percutaneous anesthesia checked by Acuson S2000 color Doppler Ultrasound made in Germany using Virtual Touch Tissue Quantification VTQ technique and eSie touch technique 5 广州医 学院 硕士 学位 论文声 触诊 组织 量 化技术 对大 鼠肝 纤维 化分 期诊断 及与 病理 相关 性的 研究 Gather and analyze the data of the hepatic fibrosis. All data was taken from the right lobe of the liver organization and tried to elastography region of interest as far as possible to avoid the lobe boundary between and intrahepatic blood vesselsMeasure 7 times for each selected rat in different regions3. We checked the biochemical indices ALT and AST, HA, LN and IV-C, etc. for each ratusing Evaluate the sensitivity and specificity of the VTQ technique for checking Hepatic Fibrosis model using histopathological findings and score as the gold standard. On this basis, we investigate the accuracy and diagnostic value of eSie touch and VTQ technique on classifying of liver fibrosis installments in ratsResults 1. Animal modeling success: Model group 45 cases, Control group 4 cases. 5 cases died during modeling in model group, 3 cases 60% died in 5w, suggesting induction failure. No death cases in 6w-8w2 deaths occurred in 9w-12w because of significantly liver dysfunctionSuccessful modeling in 12w: S1-S2:12 cases, S3-S4:11 cases, cirrhosis: 14 cases. Total successful modeling: 36 cases, with a success rate of 90%, all successful cases have been put into the experimental study2. Pathological result: Model group livers swelling and have a dark red color shallow than normal liver. Cirrhosis model group livers are smaller, lost their luster and have a harder textureTheir surfaces are uneven, showing granular change, in line with cirrhosis performance. HE and Masson trichrome staining results indicate a successful modeling and in accordance with the requirements of the experimental design3. Serological data of Hepatic Fibrosis in different stages: The serological fibrosis indicators increased with fibrosis stage elevated and reach a peak when cirrhosis occurred. Normality test shows the distribution of AST, ALT, IV-C, the HA does not meet the normal distribution, while the LN fit the normal distribution4. VTQ Test show: 36 cases of liver fibrosis / cirrhosis cases and 5 cases control VTQ result: The VTQ value measured minimum 0.79, imum 3.56. Control group: 1.25 ? 0.20, group A 1.52 ? 0.22, group B 1.89 ? 0.18, and group C 2.45 ? 0.34. Variance analysis indicated that there is statistically significant between each group. Control, Group A, Group B and Group C has a very good distribution range with each other5. The VTQ results were positively correlated with ALT, IV-C and VTQ indicators, but correlation is not strong, correlation coefficients were 0.3-0.4. AST, HA indicators were not and correlated with VTQ , respectively P > 0.056. Compared VTQ result and pathological gold standard, we can build a discriminant equation Y 3.519 * VTQ03 +3.302 * VTQ07-12.813. We use back to the generation of validation and 6 广州医 学院 硕士 学位 论文声 触诊 组织 量 化技术 对大 鼠肝 纤维 化分 期诊断 及与 病理 相关 性的 研究 cross validation methods to verify the discriminant function, the results show back to the generation of validation and cross validation of the discriminant accuracy rate was 92.3%Conclusion 1. Establishing SD rats HF model with injection of TAA under ultrasound monitoring was successful, animal mortality rate was 10%, model rate was 90%. This modeling method is more effective than traditional methods group. TAA induction dose adjusted according to ultrasound elastography results can successfully induced rat liver fibrosis, reducing the mortality of rats, and significantly increase the rate and quality of hepatic fibrosis modeling2. The in vivo experiment carried out by rat liver fibrosis model shows: To diagnosis rat liver fibrosis with ultrasound VTQ techniques is feasible. VTQ values and liver biochemical markers are not close correlated. Comparative study using pathological diagnosis as a standard showed that we can build a discriminant equation: Y 3.519. * VTQ03 +3.302 * VTQ07-12.813. We use back to the generation of validation and cross validation methods to verify the discriminant function, the results show back to the generation of validation and cross validation of the discriminant accuracy rate was 92.3%, with high accuracyKey Words :Ultrasound elastography; ARFI; rats; Hepatic Fibrosis model 7 广州医 学院 硕士 学位 论文声 触诊 组织 量 化技术 对大 鼠肝 纤维 化分 期诊断 及与 病理 相关 性的 研究前 言慢 性 肝 病 是 影 响 人 类 健 康 的 重 要 疾 病 , 无 论 在 发 达 国 家 还 是 在 发 展 中 国 家 , 其 [3] 发病率一直居高不下 。 我国以病毒性肝炎 致 肝 脏 疾 病 为 主 。据 WHO 报 道 , 全 球 每 年约有 100 万人死于 HBV 感染所致的肝衰竭、 肝硬化和原发性肝细 胞 癌。 慢性肝病 的 诊 断 和 治 疗 是 众 多 学 者 及 机 构 的 研 究 热 点 之 一 。 早 期 发 现 并 治 疗 肝 硬 化 及 原 发 性 [10,11] 肝细胞癌,治愈率超过 90% 。 因 此 , 慢 性 肝 病 的 早 期 诊 断 对 于 防 治 疾 病 , 降 低 [12-13] 发病率及死亡率具有 决 定性的意义 。 一、肝纤维化(Hepatic Fibrosis ,HF): [1,2] 肝纤维化是慢性肝病 发 展为肝硬化必经的病 理 过程 。 肝 纤 维 化 是 肝 脏 对 各 种 原 因 所 致 的 慢 性 肝 损 伤 的 过 度 修 复 反 应 , 其 主 要 病 因 是 细 胞 外 间 质 合 成 和 降 解 的 平 衡 被 慢 性 持 续 性 的 炎 症 与 坏 死 所 破 坏 , 其 病 理 特 点 为 汇 管 区 和 肝 小 叶 内 有 大 量 纤 维 组 织 增 生 和 沉 积 , 但 尚 未 形 成 小 叶 内 间 隔 。 肝 内 结 缔 组 织 异 常 增 生 , 增 生 以 胶 原 纤 维 、 弹 性 纤 维 及 基 质 成 分 氨 基 多 糖 增 生 为 主 , 但 以 胶 原 纤 维 增 生 更 为 突 出 。 肝 纤 维 化是肝硬化形成的病 理 基础及初级阶段, 其中 25~40% 最 终 发 展 成 肝 硬 化 乃 至 肝 癌 。 早 期 的 肝 纤 维 化 如 给 予 有 效 的 治 疗 可 以 发 生 逆 转 , 否 则 极 易 发 展 成 高 致 死 率 的 肝 硬 [3] 化 。由于早期肝纤维化具有可逆转性,因此,肝纤维化的早期诊断和治疗可阻断 [4] 其向肝硬化和肝癌方 向 的恶性发展 。 二、肝纤维化的诊断 手 段及其特点: 常规肝脏 B 超 、 彩 色 多 普 勒 、 螺 旋 CT 、 肝 穿 刺 活 检 、 血 清 指 标 诊 断 检 查 等 。 以 上 检 查 手 段 均 存 在 着 各 自 的 局 限 , 因 而 寻 找 准 确 、 可 靠 的 无 创 检 查 方 法 为 肝 纤 维 化 [9] 的病情判断和疗效考核提供依据 ,以及 发展更有效的影像学技术做出准确诊断和 [10] 评估肝纤维化程度对 肝 纤维化的防治及预后 具 有非常重要的意义 。 三、触弹性成像在肝 纤 维化分期诊断中的原 理 及意义: 本 研 究 所 使 用 的 Siemens ACUSON S2000 超 声 仪 具 有 的 声 触 诊 组 织 量 化 技 术 (virtual touch tissue quantification ,VTQ ) 就 是 基 于 声 辐 射 力 激 励 的 声 辐 射 力 脉 冲 成 [13-16] 像技术(ARFI )的原理开发出来的 。 该 技 术 是 一 种 对 组 织 弹 性 进 行 检 测 及 评 价 [28] [29] 的新技术 ,其原理 是利用调制的聚焦超声波束在生物粘弹性组织内产生声剪切 波 , 然 后 用 特 定 的 电 子 系 统 采 集 组 织 内 反 馈 的 剪 切 波 信 号 , 由 于 聚 焦 区 外 辐 射 力 迅8 广州医 学院 硕士 学位 论文声 触诊 组织 量 化技术 对大 鼠肝 纤维 化分 期诊断 及与 病理 相关 性的 研究 速 衰 减 , 剪 切 波 只 局 限 于 组 织 内 部 区 域 , 因 此 可 以 获 得 感 兴 趣 区 域 的 低 频 剪 切 波 的 传播速度,进而通过 检 测剪切波传播进行组 织 弹性模量估计。 该 技 术 作 为 一 种 无 创 、 快 速 、 价 廉 、 可 动 态 评 价 肝 脏 纤 维 化 程 度 的 检 查 方 法 , [17,18] 同 时 在 针 对 肥 胖 、 肋 间 隙 狭 窄 难 以 实 行 瞬 时 弹 性 成 像 检 查 和对 ALT 升高的患者 的检查方面有独特的 优 势,未来在临床上有 望 取代肝脏组织活检术 。 四、课题的目的、研 究 内容和意义 本研究使用硫代乙酰 胺 (TAA ) 建 立 大 鼠 肝 纤 维 化 模 型 成 功 后 , 应 用 德 国 Siemens Acuson S2000 超 声 仪 的 VTQ 诊断大鼠肝纤维化 程度,以肝生化指标 (ALT 、AST 、 HA 、LN 、IV-C 等)、病理学诊断作为标准 , 对比 VTQ 检 查 结 果 以 证 明 其 准 确 性 、 灵 敏 性 。 在 此 基 础 上 分 析 其 可 信 度 区 间 , 对 指 导 VTQ 的 临 床 应 用 研 究 提 供 极 其 重 要 的 价 值 , 不仅 降 低 各 种 病 因 造 成 的 肝 纤 维 化 对 广大 患者 的 危 害 , 减 少 国 家 对 肝 纤 维 化的诊治支出 , 同 时 还 可 填 补 VTQ 在 动 物 实 验 方 面 的 空 白 , 丰 富 超 声 弹 性 成 像 技 术 的理论基础,增加研 究 VTQ 的方法与途径。 本研究另一创新是 B 超 监 测 下 指 导 用 药 剂 量 法 使 用 硫 代 乙 酰胺(TAA ) 建 立 大 鼠肝纤维化模型。 以 TAA 建立大鼠肝纤维化模 型成功率高, 肝生 化检 查结果示各项 指 标 均 存 在 明 显 改 变 , 但 是 传 统 方 法 建 模 死 亡 率 较 高 而 且 成 模 率 欠 佳 , 其 主 要 原 因 是 动 物 个 体 差 异 较 大 。 为 了 提 高 资 源 利 用 率 , 简 化 实 验 前 期 工 作 , 本 研 究 在 建 模 过 程 中 通 过 超 声 弹 性 成 像 监 测 大 鼠 肝 脏 纤 维 化 程 度 指 导 用 药 量 及 时 间 的 调 整 。 对 大 鼠 进 行 个 体 化 用 药 后 , 既 可 有 效 形 成 肝 纤 维 化 模 型 , 又 可 减 少 大 鼠 死 亡 , 而 且 建 模 成 功率高达 90% ,同时 可 排 除 因药物过量形成 所 致 的 肝 硬 化 可 能 。 这 样 , 既 大 大 降 低 了 建 模 过 程 中 大鼠 的 死 亡 率 , 提 高 资 源 利 用 率 , 减 少 不 必 要 的 资 源 浪 费 , 而 且 同 时 提 高 了 造 模 成 功 率 和 建 模 一 致 性 , 是 一 种 较 为 理 想 且 稳 定 的 实 验 性 肝 纤 维 化 模 型 制 备方法,值得在科研 实 验中推广使用。 9 广州医 学院 硕士 学位 论文声 触诊 组织 量 化技术 对大 鼠肝 纤维 化分 期诊断 及与 病理 相关 性的 研究 材 料 与 方 法 1 实 验 材 料 1.1 主 要 试 剂 试 剂 名 称 供货公司 硫代乙酰胺TAA , 批 号 :930805 天津市科密欧化学试 剂 有限公司 中山大学 生理盐水 天津市百世化工有限 公 司 甲醛 广州化学试剂厂 NaH PO42 广州化学试剂厂 Na HPO4 2 广州化学试剂厂 苏木素 广州新成精细化工厂 硫酸铝钾广东彩虹生物科技钱 盛 化工有限公司 柠檬酸 天津西尔斯化工有限 公 司 水合氯醛广州 裕 ? 化 工 有 限 公 司 碘酸钠青岛海博生物技术有 限 公司 伊红 广州新成精细化工厂 75%酒精 广州新成精细化工厂 无水乙醇 广州新成精细化工厂 冰醋酸 上海信然生物技术有 限 公司 丽春红 上海信然生物技术有 限 公司 酸性品红 上海信然生物技术有 限 公司 亮绿 广州新成精细化工厂 TO 透明剂 广州新成精细化工厂 中性树胶 10 广州医 学院 硕士 学位 论文声 触诊 组织 量 化技术 对大 鼠肝 纤 维 化分 期诊断 及与 病理 相关 性的 研究 1.2 主 要 抗 体 抗 体 名 称 供货公司 透明质酸HA 放 射 免 疫 分 析 测 定 盒 北京华大吉比爱生物 技 术有 限公司 IV 型胶原C-IV 放 射 免 疫 分 析 测 定 盒 北京华大吉比爱生物 技 术有限公司 层粘连蛋白LN放射免疫分析测定盒 北京华大吉比爱生物 技 术有限公司 1.3 主 要 仪 器 仪 器 名 称 供货公司 纯水仪 厦门锐思捷科学仪器 有 限公司 Zeiss 手术显微镜 Sartorius 电子天平 Olympus 光学显微镜 Thermo forma 超低温冰箱 上海 恒温水浴箱 北京六一仪器厂 调速多用振荡器 Siemens ACUSON S2000 彩 色 多 普 勒 超 声 诊 断仪,高频探头 9L4 , 频 率 9MHz leitz 公 司 Leitz-1512 型切片机 11 广州医 学院 硕士 学位 论文声 触诊 组织 量 化技术 对大 鼠肝 纤 维 化分 期诊断 及与 病理 相关 性的 研究 1.4 试 剂 配 制 (1 )4%硫代乙酰胺 w/v :0.2μm 滤 膜 过 滤 ,4? C 保存备用。 硫代乙酰胺(TAA ) 4g 生理盐水 100ml 超声溶解 (2 )10% 中 性 甲 醛 固 定 液 : NaH2PO4 1.6g Na2HPO4 5.2g 40%甲醛溶液 48ml 超纯水 352ml (3 )Mayer 苏木素: 苏木素 1g 硫酸铝钾50g 柠檬酸 1g 水合氯醛50g 碘酸钠 200mg 蒸馏水 定容到 1000ml (4 )0.25% 伊 红 工 作 液 ( 醇 溶 性 ): 伊红 2.5g 75%酒精1000ml冰醋酸 缓 慢 滴 加几滴至半透明状 (5 ) 丽 春 红 酸 性 品 红 液 : 丽春红 0.7g 酸性品红0.3g 蒸馏水 99ml 冰醋酸 1ml 。 (6)亮绿液: 亮绿 0.2g 蒸馏水100ml 冰醋酸0.2ml 。 12 广州医 学院 硕士 学位 论文声 触诊 组织 量 化技术 对大 鼠肝 纤 维 化分 期诊断 及与 病理 相关 性的 研究 2 实 验 方 法 2.1 实 验 动 物 健康 8 周 龄 清 洁 级 雄 性 Sprague-DawleySD大鼠 50 只 , 体 重 约 180-210g , 由 广 东省医学实验动物中 心 提供, 给予普通颗粒饲 料喂养, 可自由饮水。 动 物使用批号: SCXK(粤)2008-0002 。 2.2 实 验 方 法 (1 ) 笼 养 适 应 性 一 周 。 (2 )50 只 大 鼠 随 机 分 为 两 组 , 对 照 组 5 只 。 模 型 组 45 只 。 对 照 组 生 理 盐 水 2ml/100g 大 腿 内 侧 腹 壁 皮 下 注 射 , 每 周 两 次 。 模 型 组 用 4%硫代乙酰胺TAA皮下注 射法制备大鼠肝纤维 化 模型。首次注射采取 大 腿内侧腹壁皮下注射 4%TAA 生理盐 水溶液 1ml 为 初 始 剂 量 诱 导 制 模 , 从 第 二 次 用 药 开 始 调 整 药 量 为 200mg/kg , 仍 然 使 用 4%TAA 进 行 注 射 给 药 , 每 周 两 次 。 (3 ) 每 周 称 重 并 使 用 超 声 诊 断 仪 进 行 检 查 , 每 周 2 次 。 根 据 检 查 结 果 对 用 药 次 数进行调整。调整方 法 为:如果肝组织超声 弹 性硬度评分大于全组 平 均水平,则暂 停注射一次;第六周 后 评分明显小于全组平 均 水平则继续 给 药 建 模 。 根据我们的前 期 研 究 表 明 , 使 用 TAA 皮下注射法进行肝纤 维 化模型建模, 从诱导开 始至大约 5w 左右大部分动物能达 到 肝纤维化 2 期,9w 达到 3 、4 期,12w 后超过 95%的动物都 达到肝硬化期。所以 正 式实验采取 5w 、9w 、12w 进行取材 。 又 因 为 大 鼠 的 个 体 差 异,建模进展速度往 往 存在着参差,预实验 解 剖发现 超 声 弹 性 硬 度 评 分较大的与预 期进程不一致,而在 平 均水平附近的则与预 期 进程一致,超声监测 可 将肝纤维化进 程过快或太慢调整至 基 本一致, 可提高建模的成 功率。 TAA 本 身 对 动 物 的 损 伤 较 大 , 建模过程中容易造成 模 型动物死亡,所以我 们 在实验早期不分组, 采 取整体建模, 利用超声监测将大部 分 动物的肝损伤进展程 度 控制在一定的范围内 , 到达预实验已 经验证的特定时间再 随 机挑选动物进行分组 。 此建模方法是本研究 的 一个创新,相 关资料已另文发表。 (4 ) 检 查 方 法 : 给 药 前 及 每 次 给 药 24 小 时 后 , 使 用 Siemens ACUSON S2000 彩色多普勒超声诊断 仪 对大鼠进行检查,使 用 高频探头 9L4,频率 9MHz。大鼠经 乙醚麻醉脱毛后取仰卧 位固定在固定板上,检 测部位均为右侧肝叶组 织,弹性成 像13 广州医 学院 硕士 学位 论文声 触诊 组织 量 化技术 对大 鼠肝 纤维 化分 期诊断 及与 病理 相关 性的 研究 的感兴趣区域均尽量 避 开肝叶分界处及肝内大 血管(图 1 ) 。 进 行 弹 性 硬 度 半 定 量 分 析 (eSie touch ) 检 查 时 , 保 证 QF 值在 40 以 上 。 分 析 标 准 参 照 日 本 筑 波 大 学 植 野 [2] 教授 提出的 5 分法:1 分:病变区完全为粉 红 色所覆盖。2 分 : 病 区 以 紫 色 为 主 , 混杂少量绿色。3 分 : 病 区 以 绿 色 为 主 , 混 杂 少 量 黄 色 。4 分 : 病 区 以 黄 色 为 主 , 混 杂 少量红色。5 分 : 病 区 以