大肠埃希氏菌

大肠埃希氏菌 大肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜(禽)，常引起严重腹泻和败血症，它是一种普通的原核生物，是人类和大多数温血动物肠道中的正常茵群。但也有某些血清型的大肠杆菌可引起不同症状的腹泻，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类:致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。 大肠杆菌0 157:H7血清型属肠出血性大肠杆菌，自1982年在美国首先发现以来，包括我国等许多国家都有报道，且日见增加。日本近年来因食物污染该菌导致的数起大暴发，格外引人注目。在美国和加拿大通常分离的肠道致病菌中，目前它已排在第二或第三位。大肠杆菌O 157:H7引起肠出血性腹泻，约2,,7,的病人会发展成溶血性尿毒综合征，儿童与老人最容易出现后一种情况。致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起疾病暴发流行，病情严重者，可危急生命。 大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli) 革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1,3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵很多糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。兼性厌氧菌。在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。因此，大肠菌群数(或大肠菌值)常作为饮水和食物(或药物)的卫生学标准。大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原(O)、鞭毛抗原(H)和面抗原(K)，后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多型，其中有16个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料，如局限性转导就是1954年在大肠杆菌K12菌株中发现的。莱德伯格(Lederberg)采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验，奠定了研究细菌接合方法学上的基础，以及基因工程的研究。大肠杆菌培养 1. 培养基配制:培养基从形态上分为液体与固体培养基。根据有无抗生素和其他选择性药物分为普通与选择培养基，常用LB培养基。 1)LB(Luria-Bertain)液体培养基配制 精解蛋白胨(bacto-tryptone) 1.0% 酵母浸出粉(bacto-extract) 0.5% 氯化钠 1.0% 搅拌使之完全溶解，用5molNaOH(about0.2ml/1000ml培养基)调pH至7.0，如用进口试剂可不 必调， 高压灭菌20min(120? 0.1Mpa) 2)含琼脂的固体培养基配制 (1)普通培养基:固体培养基是在液体培养基中加 1.5%琼脂制成，先配液体培养基，然后加入 1.5%琼脂，高压灭菌20min，取出后再无菌状态下铺平板 (2)选择性培养基:将消毒好的固体培养基置室温下冷却50?时加抗生素或其他必加成分， 摇匀后倒入灭菌皿中厚度2-3mm, 室温固化。 (抗生素用三蒸水溶解后，用无菌滤头过滤到无菌瓶中, 氨苄青霉素终浓度 50μl/ml)新制备的固体培养基较湿，铺上的液体不易吸收，可在室温下放 2-3天，或37?放半小时，然后4?保存备用。 (3)LB培养基中所用抗生素终浓度:氨苄青霉素-50μl/ml;氯霉素-20μl/ml;庆大霉素-15μl/ml;卡那霉素-30μl/ml;春日霉素-1000μl/ml;壮观霉素-100μl/ml;链霉素-30μl/ml;四环素-12μl/ml。 注意:除了四环素保存-20?，其余均应保存4?，所有抗生素均应溶于无菌去离子水。 四环素对光敏感 2. 液体细菌培养 1)小量培养: (1) 取灭菌 16 或 18mm 口径培养管，加 3-5mlLB 培养基，再加 50mg/ml 氨苄青霉素 3-5ul(宿主菌不加抗生素) (2) 无菌牙签挑取单菌落，送入培养液中，或取菌液 5-10ul，转入培养液中，封好管口 (3) 37?摇床培养 100-200r/min 至生长饱和，约 6-12 小时 2)大量培养:取 500ml 培养瓶内装培养基 100-200ml，及相应抗生素。以 0.5-1%浓度接种菌液，37 度摇床培养100-200r/min至OD值0.6-0.8。 3. 固体细菌培养: 用于单一菌落的挑选，转化后抗性菌落的筛选。 方法:采用划痕接种法。用接种环从菌种中沾取少量菌液，划线。 酵母菌是一些单细胞真菌。酵母可以通过出芽进行无性生殖，也可以通过形成子囊孢子进行有性生殖。无性生殖即在环境条件适合时，从母细胞上长出一个芽，逐渐长到成熟大小后与母体分离。在营养状况不好时，一些可进行有性生殖的酵母会形成孢子，在条件适合时再萌发。 培养酵母最适pH 值为pH4.5-5.0。最适生长温度一般在28?~30?之间。 酿酒酵母，用到的培养基有: 1、酵母完全培养基YPD:酵母提取物10g，蛋白陈20g,葡萄糖20g，定容至1L。加入1.5%琼脂粉则成为固定培养基。 2、SC(合成完全培养基)培养基(用于筛选酵母转化子):YNB(不含氨基酸的酵母氮源) 6.7g，葡萄糖20g，加入相应的氨基酸，定容至1L。加入1.5%琼脂粉则成为固定培养基。 由于葡萄糖和氨基酸，灭菌是用115度，30min的灭菌条件。 液体摇菌时一般在30度下摇24,30min，就可以，固体培养一般在30度下要3,5天。 酵母破壁的液氮研磨方法的详细步骤: 取1L酵母，诱导完后，离心(centrifugation)收菌体，称湿重，用蛋白(protein)纯化buffer悬浮菌体，重量(g):buffer体积(毫升),1:1,,1:2。用注射器将菌液加入液氮中，控制加入速度，使得菌液进入液氮中后形成小颗粒,太快容易结成块。将菌体液氮颗粒转入高速打碎器(用的是打碎草药的机器，RMB600)中，注意不要将多余液氮倒入，大约2,3万转/分破碎1分钟，菌体颗粒应该成粉末状。倒出粉末，37度水浴融化后，再用注射器加入液氮中，重复上述步骤，重复3次。高速(20000rpm，4度30分)离心(centrifugation)收上清，如上清杂质较多，需要多离几遍，上清中目标蛋白(protein)纯化同E.coli. 微载体的直径在60,250μm , 由天然葡聚糖、凝胶或各种合成的聚合物组成, 如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由这些材料及其改良型制成的微载体主要参考了细胞的粘附特性, 在其表面带有大量电荷及其他生长基质物质, 因而有利于细胞的粘附、铺展和增殖。 微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术。这种培养技术是在生 物反应器内加入培养液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒(微载 体) , 使细胞在微载体表面附着和生长, 并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面, 1 g 微载体其比表面积可达6 000 cm2 , 从而可实现细胞的高密度培养。 采用微载体培养具有以下优点: ?比表面积大, 单位体积培养液的细胞产率高; ?采用均匀悬浮养, 无营养物或产物梯度; ?可用简单显微镜观察微载体表面的生长情况; ?细胞收获过程相对简单, 劳动强度小; ?培养基利用率高, 占地面积小; ?放大容易, 国外已有公司以1 000 L 规模培养人的二倍体细胞来生产β- 干扰素。但其缺点是搅拌桨及微珠间的碰撞易损伤细胞; 接种密度高; 微载体吸附力弱, 不适合培养悬浮型细胞。 清洁级 clean grade 是指生产环境中清洁等级，以单位体积空气中的微粒数分级，如10万级清洁级，就是表示在1ft3【立方英尺】(1ft3=0.028m3)体积的空气中含有的大于5μm的微粒不多于10万颗(中国标准为每升空气中含有的大于5μm的粒子数小于3500颗)，100级即指在上述体积中大于5μm的微粒不多于100颗，通常是采用三级空气过滤并在建筑物按清洁级要求和兴建来实现，一般医用产品应在10万级厂房中生产，而植物材料以及一些电子集成电路的生产则需在100级厂房中生产。 SPF级动物 所谓SPF级动物是指无特定病原体级实验动物， 无特定病原体(Specific pathogen Free,SPF)动物是指机体内无特定的微生物和寄生虫存在的动物，但非特定的微生物和寄生虫是容许存在的。一般指无传染病的健康动物，是目前国外使用最广泛的实验动物，它的来源，既可来自无菌动物繁育的后裔，亦可经剖胎取后，在隔离屏障设施的环境中，由SPF亲代动物抚育。它不带有对人或动物本身致病的微生物，但不能排除可经胎盘屏障垂直传播的微生物。 由于用疫苗和药物进行预防及治疗，或用淘汰带菌动物来作出SPF动物的方法并不实用(既浪费时间，又难保确除病原)，故一般大多先培育无菌动物或悉生动物后，再把其移到有封闭系统设施中去饲育繁殖。原则上SPF动物室内不容许存在病原菌，但在封闭的环境中，难免有很多非病原性微生物会逐渐进入动物机体中去，故亦有人把这个转移过程称之为通常动物化。SPF动物的祖先是无菌动物，按理来说，无菌动物的子宫内和卵中是无菌的，然而，有些微生物实际上是通过其亲代传给胎儿的，因此，培育无菌动物和SPF动物之前，就必须考虑这个问题。即应该严格地选择剖腹产 母体，该动物应未感染上规定的各种微生物和寄生虫，最好通过几代连续剖腹，来培育原种无菌动物后再培育SPF动物。 “SPF”一词的含义是不明确的，因为在特定条件下，“非”病原体是可以成为病原体的。而且有些病原体目前缺乏有效的检查手段。“SPF”是多年来使用的名称。目前还没有更好的统一的名称，所以仍沿用。现在有COBS(经剖腹产取得并饲养在屏障中的)、BS(在屏障系统中饲养)、DF(无病)等不同名称，都是指“SPF”动物。