结直肠腺癌和结直肠腺瘤相关生物标志物的临床病理的研究

结直肠腺癌和结直肠腺瘤相关生物标志物的临床病理的研究 结直肠腺癌和结直肠腺瘤相关生物标志物的临床病理 的研究 . 分类号: 密级 ?『’ 结直肠腺癌和结直肠腺瘤相关生物标志物 郗洪庆 的临床病理研究作者姓名: 学科专业:病理学与病理生理学 导 师:赵坡教授 答辩委员会主席: 谚眇// 论文答辩日期:二?年五月二十六日 院校地址:北京复兴路号 邮政编码: ~。?? 、,?军医进修学院 研究生学位论文原创性声明 秉承我院“敬业、勤奋、求实、创新”的学风,本人声明:所呈交的论文 是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了 ,文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含任何其他个人或集体已 经 发表或撰写过的研究成果,也不含为获得我院或其他教育机构的学位及证 而使用过的材料,对本文的研究作出贡献的个人或集体,均已在文中作了说 明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。 论文作者签名:钥、也乡日期:抄/,寸、,。彳 指导教师签名:芎二岩久日期:冽良岁?一‘ 军医进修学院 研究生学位论文版权使用授权书 本人保证毕业离院后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位为军医 进修学院或解放军总医院。学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文 原件、复印件和电子版本,可以采用影印、缩印、扫描或其他手段保存论文 以供被查阅和借阅。学院可以公布学位论文的全部或部分内容保密内容除 外。 如,夕. 篇篡帮‰嚣 指导教师签名: 期: 沁,防,. 电够~鬈., ???目 录 缩略词表. 中文摘要?一??一~. 英文摘要. ,..一 日舌一?. 正文??.? 材料与方法. 结果一 讨论??一?一?一 结论一一?. 参考文献?一 综丕??~??. 发表文章. 致谢?一.??.军医进修学院硕:学位论文 缩略词表 英文缩写 英文全称 中文译名激活蛋白 ? 碱基对 互补二氨基联苯氨乙二氨四乙酸辣根过氧化物酶 免疫组织化学 信使核糖核酸 硝酸纤维素聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸缓冲盐冲液多聚酶链式反应 苯甲磺酰氟每分钟转数 巾 玎 反转录受体酪氨酸激酶十二烷基磺酸钠,’’,’’四甲基.,乙二胺组织微阵列 确 三羟基氨基甲烷 ???军医进修学院硕.学位论文 结直肠腺癌和结直肠腺瘤相关生物标志物临床病理研究 中文摘要 研究目的 研究生物标志物、、、及鼬.在结肠腺癌 、 中的表达与肿瘤生物学行为特点并探讨上述标志物与患者无瘤生存时间关 一 系。寻找与结直肠腺癌预后相关的新的分子标志物,以期为临床治疗提供更 多的信息,减少复发与转移。 研究生物标志物及在结直肠腺瘤中表达与肿瘤生物学行为特 点并探讨在结直肠腺瘤中上述标志物之间的相关性。为临床早期诊断腺瘤癌 变提供更多的信息,指导治疗。 研究方法 采集解放军总医院病理科.年间实施根治性手术切除的并 有完整随访资料的结直肠腺癌例,手工制成组织芯片块,进而采用 二步法检测结直肠腺癌相关标志物、、、 及.在结直肠腺癌组织中的表达,其与临床病理特征及患者预后的 关系。采集.年间实施手术或内镜下切除的结直肠腺瘤例,用 二步法检测结直肠腺瘤相关标志物及在结直肠腺瘤中表 达,分析其与临床病理学特征的关系。 印记杂交法比较例结直肠腺癌组织与相对应的癌旁正常 组织中和蛋白表达的不同。 检测基因的和在例结直肠腺癌组织和相 应的癌旁正常组织中的表达情况。 结果 、、、及飚.的表达随肿瘤浸润程度加 ??, 深而增高.;、、、及鼬.的表达随淋 巴结转移数目增多而增高.;、、及鼬.在有 腹腔及远处转移组的表达均明显高于无转移组.;、、 、及一的表达均随分期递增而增高.;、 及鼬.的表达随肿瘤分化程度的降低而升高。 军医进修学院硕:学位论文 鼬.在结直肠腺癌中表达与、及呈正相关相 关系数分别为:.,.,.,.。 、、、及鼬.在癌组织中的表达明显高 于癌旁正常组织.. 单因素术后生存分析显示:、、、、.、 肿瘤大体类型、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、腹腔及远处转移和 分期这 种因素与患者的术后生存时间相关.。 多因素生存分析显.:及的阴性表达、肿瘤组 织学分级低、肿瘤肠壁浸润深度浅、未发生远处转移及分期低的患者 术后生存时间长,预后较好.。 对例新鲜结直肠癌手术标本进行蛋白提取及定量,并通过 印迹杂交法比较结直肠腺癌组织与癌旁正常组织中及蛋白表 达异同的实验结果显示,结直肠腺癌及癌旁组织均能与兔抗人多克隆 抗体及兔抗人多克隆抗体有特异性结合,分别在处和处 可见有深染条带,而且结直腺肠癌组织标本及蛋白的表达均 高于相应的癌旁正常组织.。 对例新鲜结直肠腺癌手术标本进行检测结果显示, 在癌组织中表达高于相应的癌旁正常组织.。 及在结直肠腺瘤中表达与肿瘤大小,病变程度及肿瘤组 织学分型有关均.。 和在结直肠腺瘤中的表达呈正相关产.,.。 及在腺瘤组织中表达明显高于正常粘膜组织.. 结论 、、、及.在结直肠腺癌的表达情况 ????? 与患者术后生存时间相关,.在结直腺肠癌中表达与、及 相关。 、、组织学分级、浸润深度、腹腔及远处转移及 分期是结直肠腺癌术后生存时间的独立预后因子。 、、、及.均与结直肠腺癌的发生发 军医进修学院硕.:学位论文 展和或转移密切相关,上述生物标志物可能对结直肠腺癌的演化和进展 起重要作用,并可能成为新的临床辅助诊断和监测预后的指标。 及在结直肠腺瘤的发生发展中起着重要作用,可能成为 临床新的辅助诊断和监测预后的指标。 \ 关键词 一 . 结直肠腺癌;结直肠腺瘤;免疫组织化学;反转录;印迹 杂交; ??,? 军医进修学院硕:学位论文 ?, ,, . ,, , , .,. . ’ .. , ,,,. ., . . . 军医进修学院硕:学位论文.、 . ? ,,,, , 尸.. . .. ,,, .,一 , ..尸..., .,., .,尸.. , ,,., , , ,, 一, , , , ,.. ,, , , .. 军医进修学院硕:学位论文 ... .. ?,.. . .,.. 尸... ,,,, . , . , ,,, , . . ,,,...,. ; ; ; ; 军医进修学院硕’:学位论文 刖菁 结直肠癌是大肠粘膜上皮和腺体发牛的恶性肿瘤,它是一种常见的恶性 肿瘤,在过去的多年间世界大多数国家或地区结直肠癌发病呈上升趋势, 并以发病率低的发展中国家上升更为明显。随着生活水平的不断提高,饮 食 。、 习惯的改变,我国结直肠癌的发病率也日渐增高,目前其发病率在各种恶性 ~ 肿瘤中仪次于肺癌及乳腺癌排在第位,死亡率位于第位,而且据预测,我 国结直肠癌的发病率与死亡率在今后很长一段时期内将稳步上升,成为我国 最常见的发病率上升的恶性肿瘤之一。近年来,随着分子牛物学的不断发展, 一些新的牛物标志物已经出现,不仪对结直肠癌的病理诊断提供了很大帮 助, 并为其预后判断、治疗的选择提供了更为全面的依据,在一定程度上发 挥了独特的作用。同时,通过对结直肠腺瘤到结直肠癌演变的过程中分子标 志物表达水平的研究,对研究结直肠癌发牛发展,早期诊断有重要意义。 、、、及鼬一是近几年逐步逐步应用于科 研和临床的新型肿瘤牛物标志物,目前许多报道对它们的临床应用价值作了 探讨和研究,已对其有一定的认识。 .分子量是,包含个跨膜区的糖蛋白。最初被认为是 造血干细胞标志物,后发现正常非淋巴造血组织中也可检测到 转录本‘?。目前丰要用于各种恶性肿瘤癌.细胞的研究。等【】 将大肠癌细胞经皮注射到免疫缺陷小鼠身上培养,可以迅速复制出 原肿瘤细胞,并可以连续繁殖,形成的肿瘤细胞表型没有发牛显著改变;而 .细胞在同等条件下却并不形成肿瘤。嘶【】等用流式细胞仪纯化 结肠癌组织中的细胞。并把它移植到小鼠肾被膜下使其形成肿瘤。 并对分选出的细胞进行分析认为细胞中高度富集结肠癌干 细胞。亦有个别报道【】对作为结直肠癌细胞标志物观点表示质疑, 他们发现来源于转移性结肠癌.细胞不仅具有形成肿瘤的能力,也和 亚群增长的一样迅速。另外,他们发现在正常粘膜普遍表达。 等【】认为不一定是结直肠癌干细胞标志物。到目前为止,国内 外很少有关于在结直肠癌组织中表达于其临床病理学联系的报道,并 且在结直肠腺瘤到癌变过程中的作用尚未有人研究。 军医进修学院硕‘:学位论文 . ,细 胞外基质金属蛋白酶诱导因子是一种跨膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族 成员,广泛存在于肿瘤组织及正常组织,丰富表达于肿瘤细胞表面,通过刺 激基质金属蛋白酶 ,生成使细胞外基质和基 膜降解,从而促进肿瘤的侵袭和转移【。】。据报道,在人类的许多种肿 瘤有表达,包括恶性黑色素瘤、胶质瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、肾癌掣。 在一些肿瘤中发现随着肿瘤恶性程度的增高,表达也增高【】。因此, 可以作为肿瘤牛物标志物之一,有望以此为靶点进一步开展针对大肠 癌浸润转移的控制和治疗方面的研究。 、隶属于受体酪氨酸激酶家族最大的一个分支一一 亚家族。 它是第一个被克隆出来的家族分子,最初是从前细胞急性淋巴母细胞 白血病细胞膜中分离出来的,它的功能研究早期丰要集中在神经系统中,并 且研究的较为充分。近年来研究结果显示,在肾癌、肝癌、黑色素瘤 和肉瘤中表达上测】。新近发现及其配体在免疫系统、骨骼、干 细胞、内皮细胞以及部分肿瘤的进展和转移中发挥作用,在神经系统 研究的较充分,但目前尚无在结直肠癌中作用的报道。本研究通过检 测在结直肠癌组织中的表达,探索其与结直肠腺癌的预后的关系。 、基因是解放军总医院韩为东【眨等于年发现的一个人的新 基因,它是从成人外周血淋巴细胞中克隆获得,定位在染色体.,其编 码蛋白质分子量为.,是一种核蛋白。也是一种激素反应性基因, 研究证实。研究证实雌激素通过激活,最终与基因上游调控区的 一段序列直接结合,上调该基因的转录【】,到目前为止,对于基因具 体功能及作用机制仍不很清楚。研究发现,在乳腺癌患者中,肿瘤直径大、 发牛腋窝淋巴结转移、分期晚的患者,的表达水平高,提示其可 能在雌激素的调控下参与乳腺癌的甲.期转移【】。有研究报道,在胃癌 中表达与患者临床预后有关【”】本研究通过检测在大肠癌组织及正常 粘膜组织中表达情况并分析了的表达和我国大肠癌患者临床病理学 关系。 军医进修学院硕:学位论文 .一的人类基因定位于第号染色体的长臂上,鼬.是一种与细 胞增殖相关的核抗原,为细胞增殖的一种标记,主要表达在增殖细胞的细胞 核中,与细胞周期密切相连,在增殖细胞的、、和期均有表达。 鼬.与细胞增值活性、肿瘤牛长方式、肿瘤分化程度、浸润转移以及预后 密切相关,因此在对肿瘤的诊断,判断其恶性程度和预后中起着重要作用。 .基因位于号染色体短臂.上,有野牛型和突变型之分, 自然存在的野牛型基因是一种重要的抑癌基因。基因在细胞增殖周 。。 期中发挥保持细胞周期正常运转,调节细胞周期,介导细胞凋?的功能【 人类大部分肿瘤存在基因突变, 突变型基因通过多种途径致癌, 包括可以..扰细胞的信息传递过程,促进细胞增殖。在结直肠癌中高表 达与肿瘤的侵袭、转移及预后有关,是判断结直肠癌预后的一个重要指标。 检测结直肠腺瘤轻度、中、重度不典型增生及癌变过程中的表达情况及 与其它结直肠癌标记物进行相关分析,对于探讨结直肠癌发生、演进过程及 早期诊断有重要意义。 本课题一部分为回顾性研究,以解放军总医院.年部分经切除 术的结直肠腺癌患者的临床及病理学资料为研究对象,采用组织芯片技术、 免疫组织化学技术、印记杂交法 、逆转录一聚合酶链反 , 研究牛 应技术物标记物、、、及鼬.在结直肠癌中的表达并 探讨上述标记物与肿瘤生物学特点及转移的关系。寻找新的与结直肠诊断及 预后相关的牛物标记物,以期为临床提供更多的信息,指导治疗。减少复发 与转移,提高患者术后牛存率及牛存质量。同时以年间实施手术 或内镜下切除的结直肠腺瘤临床病理学资料为研究对象用免疫组织化学技 术 检测结直肠腺瘤相关标志物及在结直肠腺瘤中表达,分析其与临 床病理学特征的关系。并探讨在结直肠腺瘤中上述标志物之间的相关性。为 临床甲.期诊断腺瘤癌变及判断预后提供更多的信息,指导治疗。 军医进修学院硕:学位论文 材料与方法 一、病例选择 .复习解放罕总医院病理科.年间根治性手术切除并有完整随访资 料的结直肠腺癌病例,总计例。 复习?年间实施手术或内镜下切除的结直肠腺瘤例。 .结直肠腺癌:查阅相关临床病历,并记录病人的临床及病理特点,包括患 者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、大体类型、分化程度、浸润深度、淋 巴结转移、临床病理分期等,并随访肿瘤复发转移以及术后健康情况。 结直肠腺瘤:查阅相关临床病历,并记录病人的临床及病理特点,包括 患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤数目、肿瘤部位、肿瘤病理分型及病变程 度。 二、组织芯片的制作 .前期准备工作: 收集和选择病例,挑选相应切片及蜡块并标记靶点。 .制作空白蜡块即受体蜡块:通过反复实验我们制作了一个由薄 铜片及不锈钢针构成的打孔模见图,把打孔模放在石蜡模具上,将融 化的石蜡倒入模具,待冷却至室温后,将整个模具放入.?冰箱,然 后将与打孔模固定为一体的蜡块从模具中取出。 图自制组织芯片打孔模 将蜡块放入?的温箱中 ,将蜡块与打孔模轻轻分离,有孔空白蜡 块. . . , 制作完成,孔径. ,孔间距.军医进修学院硕叶:学位论文 共点微阵列。 的骨穿针在蜡块的标记部位打洞,采 .获取供体蜡块组织芯:用内径. 集组织芯见图采集深度要略短于打孔模中不锈钢钉的长度。将组织芯推 出,小心插入受体蜡块的孔内并向下按平。 、 图制作完成的有孔空白蜡块、原组织蜡块及穿刺工具 .把制成的组织芯片放入?烤箱内烤 ,用载玻片将所有组织芯按平, ,使组织芯与蜡块融为一 再放入蜡块制作模具,于~?烤箱内烤 体。 .从烤箱中取出模具,让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约 ,再放 入.?冰箱内冷冻 ,将组织芯片蜡块从模具中取出,放入?冰箱内 保存备用。 三、免疫组织化学 将制作好的块组织芯片均连续切取 厚的白片多张,以供做免疫 组化染色,应用二步法检测。 .主要试剂 兔抗人多克隆抗体北京博奥森、兔抗人多克隆抗体解 放军总医院分子生物实验室馈赠。 兔抗人多克隆抗体、兔抗人单克隆抗体、 鼠抗人鼬.单克隆抗体,均购自北京中杉金桥牛物技术有限公司。 购自北京友谊中联牛物科技有 兔抗人多克隆抗体 限公司。 军医进修学院硕:学位论文 枸橼酸抗原修复液.、抗体稀释液、二步法免疫组化检 测试剂盒、浓缩型试剂盒、均购自北京中杉金桥牛物技术有限公 司。 .主要仪器 型切片机 德国 .型烤片机 天津天利航空机电有限公司 ?型展片机 天津天利航空机电有限公司 型微波炉 顺德格兰仕有限公司 电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂 .型光学显微镜 日本公司 .染色过程 .脱蜡 ?烤片,二甲苯脱蜡次,梯度酒精返水:%酒精 次,%酒精次,%酒精,蒸馏水洗。 .热修复 高压锅内加入枸橼酸抗原修复液.预热至沸腾,将切片浸于缓冲 液内,至加压阀加压后开始计时加热. ,以暴露抗原决定簇。取出室温 冷却 。洗, 次。 过氧化氢封闭 %室温孵育 ,消除内源性过氧化酶活性,蒸馏水洗。 .滴加抗体 :: 抗体稀释: :: ::、 .及采用工作液。 ? 滴加一抗,?孵育过夜,冲洗 次。 滴加二抗?/ : 滴加试剂聚合物辅助剂,室温下,蒸馏水冲洗遍,冲洗 , ×次。滴加试剂辣根酶标记山羊抗兔/,、鼠多聚体,室温下 蒸馏水冲洗遍,冲洗 次。 . 显色军医进修学院硕上学位论文 避光滴加显色液,. 后自来水洗。 .复染至封片 .%苏木素复染细胞核, ,水洗;%盐酸酒精分色秒,水洗; %氨水返蓝 :梯度酒精脱水:%酒精 ,%酒精 ×次,% 酒精 次;二甲苯透明 次,中性树脂胶封片。 .染色部位 及.为细胞核表达;为细胞质表达;为细胞膜、 质表达;为细胞核、质表达;为细胞膜表达。 .结果判断 . 、..以细胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞,其中及 鼬.阳性细胞%为阳性。 . :以细胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞,阳性细胞% 为阳性。 . :以细胞膜、细胞质出现黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞,阳性细胞 %为阳性。 . :以细胞核、细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞,阳性细胞% 为阳性。 . :以细胞膜出现黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞,阳性细胞%为 阳性。 .统计学处理 使用.软件包对数据进行统计学处理。结直肠腺癌、结直肠腺瘤 与癌旁正常组织各项指标表达的差异以及各种牛物标志物的表达与结直肠 腺 癌、结直肠腺瘤临床病理参数间关系采用等级资料相关分析和 检验。 检验; 单因素无瘤生存分析: 多因素无瘤牛存分析:比例风险模型; 所有统计数据均以值.为有统计学意义。 四、 检测及在结直肠癌中的表达情况 组织标本 . 军医进修学院硕:学位论文 所收集例结肠腺癌新鲜手术标本均取自中国人民解放军总医院普通外 科年月至月手术治疗的患者,术前及术后均有明确的病理诊断。每套 病理组织包括原发结直肠腺癌组织及癌旁正常组织距癌块至少以上处 的结直肠粘膜组织。所有患者术前均未接受放疗和化疗。 .主要药品试剂 丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺上海化学试剂一厂 过硫酸铵 上海无机化工厂 一抗:兔抗人多克隆抗体 北京博奥森牛物公司 美国 公司 兔抗人多克隆抗体 北京中杉金桥牛物技术有限公司 二抗:羊抗兔/ 试剂盒 普利莱基因技术有限公司 显影、定影液 北京鼎国牛物技术发展中心 .主要溶液 %丙烯酰胺:先将,’.甲叉双丙烯酰胺溶于水中,再加 入丙烯酰胺,补加去离子水至终体积,过滤,避光保存。 ./..:碱.,加入去离子水,用浓 盐酸调节至.,加水定容至终体积。 ./?.:碱.,加入去离子水,用浓 盐酸调节至.,加水定容至终体积。 %:在水中溶解电泳级,加热至?助溶,用 浓盐酸调节至.,加水定容至。 %过硫酸铵:过硫酸铵溶于去离子水中,临用前配制。 甘氨酸电泳缓冲液:去离子水溶解.和. 甘氨酸,然后加入电泳级,用去离子水补至用时稀释成×。 电泳转移液:称取.甘氨酸,.碱,并加入甲醇, 加水至总量为。 .%?:称取碱., 入水中,军医进修学院硕.学位论文 一,加水定容至终体积。 用盐酸调至.,加. 封闭液:.%.中加入%新鲜脱脂奶粉,现用现 配。 考马斯亮蓝染色液定氮用:称取考马斯亮蓝一溶于 、 %乙醇中,加入 %磷酸,加水,用时:稀释。 , 组织裂解液用配制:%,脱氧胆酸钠.%, 使之终浓度为/: .%,临用前./ 溶于异丙醇,一。保存。 .主要仪器 上海医用分析仪器厂 台式低温高速离心机 恒温水浴箱 天津中发科技开发公司 . 电子天平紫外分光光度仪? 凝胶电泳图像扫描分析仪 ? 垂直电泳槽 .台式恒温振荡摇床 北京四环科学仪器厂 .操作步骤 .癌及癌旁组织总蛋白提取 取.。冻存的组织约,在液氮中研磨成粉状,加入到 次;。 裂解液中,置于冰上,超声破碎 离心;将上 清液移至另一个新管中,即为组织总蛋白溶解液。 . 法测定蛋白质浓度 将总蛋白溶解液稀释倍,加考马斯亮蓝染色液,混匀,分光光度计 测定蛋白质浓度。 . .电泳分离蛋白样品 ..准备.凝胶用玻璃槽: 将两条垫片放入两块特制的玻璃板中 间其中一块为凹形,用凡士林将两边及底边封严,确定灌制分离胶液面标 志线。 .. %?聚丙烯酰胺凝胶的配制: 军医进修学院硕:学位论文 分离胶依次加入 %丙烯酰胺. ./ . . % . 双蒸水 . % . . ..将上述液体用吸管轻轻加入凝胶玻璃槽中,使其液面至标志线位置避 免产生气泡,立即用三蒸水覆盖胶面,使凝胶与空气隔绝,并有助于保持凝 胶面平直,温箱中放置约至分离胶凝固。 ..配制积层胶 %浓缩胶依次加入: %丙烯酰胺. . ./?. % . . 双蒸水 . % . ..倒掉分离胶表面的三蒸水,并用滤纸吸出残余水分,用吸管轻轻加入积 层胶,插入样品梳,使液面至样品梳上标记线位置,室温凝胶约至其 凝固。 ..轻轻拔取梳子,去掉玻璃夹板之间的少许凡士林,将玻璃夹板固定在电 泳槽中。 ..蛋白样的计算:每个样品的上样量为,根据测出的每例样品的浓 度换算其相应的上样微升数。 按:的比例沸水煮,然后 ..将蛋白样加入 使每个样品孔中加入的样品量一 立即插入冰中,加入适量 致。 ..将变性的蛋白样轻轻加入凝胶孔中,把电泳仪设置成稳压状态,将电压军 医进修学院硕:学位论文 调至,当样品通过积层胶的标志线后约,将电压调至,继续 电泳使染料至分离胶适当位置约.结束电泳。 .转膜 ..裁剪与胶大小一致的膜,先将其浸泡在三蒸水中,再在转膜 液中浸泡,同时裁剪同样大小的六层滤纸浸泡于转膜液中。 ..取下电泳板,将其平置,小心将夹在中间的电泳胶取出,切除多余凝胶, 浸泡在转膜液中。 ..取出转膜夹板,从阴极开始,依次为海绵垫片一三层滤纸一样品胶一 膜一三层滤纸一海绵垫片,排除气泡,扣紧转膜夹板,放入含有转膜液 的转膜电泳槽中。 .. 恒流转膜约。 .封闭及抗体孵育 ..将转移后的膜放入封闭液中,室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭。 ..将一抗即和均与洗膜液按照:的比例配好,把封闭 后的膜分别放入两种一抗工作液中,然后反应过夜,然后再在摇床上摇 。 ..洗膜:用洗涤次,每次在室温下摇床上缓慢摇动,洗净 未结合的一抗。 ..将二抗即羊抗兔/与洗膜液按照:的比例配好,把洗涤后 的膜直接放入二抗工作液中,室温、避光摇床上缓慢摇动。 ..洗膜,方法同“..”,洗去游离二抗。 .曝光及洗片: ..按:/混合试剂盒中的两种液体。 ..在铺有保鲜膜的曝光盒中放入膜,将上述混合液均匀铺在膜上, 室温作用,再将保鲜膜折叠,包裹住膜。 ..在暗室中将光片直接压于包裹后的膜上,于曝光盒中曝光约。 ..将曝光后的光片放入显影液中,在红光下观察显影结果,适时将 光片放入清水中终止显影,最后将光片放入定影液中定影约。 .数据分析 军廷进修学院硕学位论文 将显色后的膜或底片照相,并用软件对图像进行灰度分析。 测定各标本的所要检测的蛋白条带灰度值和.条带灰度值,各标本的所 要测定的蛋白表达水平所要检测的蛋白条带灰度值/.条带灰度值。 .统计学处理 实验资料以 软件建立数据库。实验结果用.统计 软件进行分析:计量资料用均数?标准差表示,统计方法用配对检验。 .认为差异有显著性。 五、检测结直肠癌及癌旁正常组织中的表达情况 .组织标本 所收集侈结肠腺癌新鲜手术标本均取自中国人民解放军总医院普通外 科年月至月手术治疗的患者,术前及术后均有明确的病理诊断。每套 病理组织包括原发结直肠腺癌组织及癌旁正常组织距癌块至少以上处 的结直肠粘膜组织。所有患者术前均未接受放疗和化疗。 .实验试剂与仪器 .试剂 抽提试剂盒 北京尚柏牛物公司 试剂盒 其余生化试剂都为进口分析纯试剂 .仪器 仪 杭州博日科技有限公司 台式高速冷冻离心机? 湘仪 型电泳仪 北京六一仪器厂 .型水平式电泳槽 北京宾达英创科技有限公司 紫外分析仪 上海金鹏分析仪器有限公司 紫外分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司 移液枪 军医进修学院硕。:学位论文 .引物设计 .引物设计软件 等生物软件。 及 .设计引物序列 、:. 上游:’..’ ... 下游:’.一’ 上游:’一.’ 下游:’..’ .实验步骤 . 提取前的实验准备 ..一次性枪头、离心管等塑料制品,用.%的水溶液浸泡过液,第 二天高压灭菌,再用烘箱烘干。 ..玻璃器皿、研钵烘烤小时。 ..溶液的准备:用.%处理水配制,于至少处理小时,然 后进行高压灭菌。 .北京博迈德提取试剂盒离心柱型 ..样品处理:将组织在液氮中磨碎。每?组织加裂解液, 用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过裂解液体积的十分之一。 ..将匀浆样品剧烈震荡混匀,在。放置分钟,使得核酸蛋白复 合物完全分离。 ..可选步骤: 离心分钟,取上清,转入一个新的无 的离心管中。 ..每 加入.氯仿,盖好管盖,剧烈振荡秒,室温放置 ’ 分钟。 ..离心分钟,将最上层转移到新管中。 ..缓慢加入倍体积乙醇,颠倒混匀此时可能会出现沉淀。将得 到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中。 离心秒,弃掉废液, 将吸附柱放回收集管中。军医进修学院硕‘:学位论文 ..加入.去蛋白液,离心秒,弃掉废液。 ..加入.漂洗液使用前检查是否已加入乙醇, 离心秒,弃掉废液。 ..加入.漂洗液, 离心秒,弃掉废液。 ..将吸附柱放回空收集管中, 离心秒,弃掉废液。 ..将吸附柱转入一个 . 离心管中,加. ,室温放置分钟, 离心分钟。 ..用%的琼脂糖,电压跑分钟检测带的完整性。 .反转录 .. 。 管中配制下列模板/弓物混合液,全量 试剂名称 使量 模板.山 .. ?保温分钟后迅速在冰上急冷分钟以上。 ..离心数秒钟使模板/弓物的变性溶液聚集于管底部。 ..在上述管中配制下列反转录反应液。 试剂名称 使用量 上述模板/三 物变性溶液 ×. 山 各 ..仙 / ?保温小时。 .. 保温分钟后冰上冷却,得到溶液。 军医进修学院硕:学位论文 .反应 表 反应体系 反应步骤 温度? 时间 循环 .产物测定 取的扩增产物加入.%溴乙锭琼脂糖凝胶中,以/电 压电泳分钟一在紫外线下可见相应长度的目的基因和内参基因的扩增 条带将电泳胶置于凝胶分析系统中,对条带进行灰度测定。 .对照设置 阳性对照用已知基因表达阳性的人结直肠组织为模板;阴 性对照用灭菌水代替模板。操作步骤同上述。 结果判断及半定量分析 . 阴性结果为只在相应分子量位置出现电泳条带;阳性结果为除 基因的条带外尚有目的基因的电泳条带。电泳结果在紫外光下采像;用 凝胶电泳成像分析系统 .测定各标本的目的基因和内参基因电泳 条带的灰度值:以目的基因与内参基因两电泳条带的单位面积内的灰度比值 来反映目的基因的相对表达水平,即用电子表格建立数据库并进行计军医进 修学院硕:学位论文 算,公式为:各标本的目的基因相对表达水平目的基因灰度值/内参基因灰 度值。 .统计学处理 实验资料以 软件建立数据库。实验结果用.统计 软件进行分析计量资料用均数士标准差表示,统计方法用配对检验。军医进 修学院硕上学位论文 结 果 第一部分例结直肠腺癌患者及例结直肠腺瘤患者的临床病理资料 例结直肠腺癌患者的临床病理情况如下: 、 .患者性别情况 例结直肠腺癌患者中,其中男侈.%,女仞.%,男 女之比为.:。 .患者年龄状况 例结直肠腺痛患者中,年龄最小者为岁,年龄最大者为岁, 平均年龄为.岁。年龄低于岁者例%,.岁者例%, .岁者例.%,.岁者例%,?岁者例.%, .岁例.%,岁以上者例.%。.岁患者占其总数 的.%,其中又以.岁者为最多。 .肿瘤发牛的具体部位 例结直肠腺癌,发牛于回盲部的例.%,右半结肠的例 .%,横结肠例%,左半结肠侈.%,乙状结肠例.%, 直肠例.%。 .肿瘤的大小及大体类型 例结直肠腺癌中,肿瘤直径的例.%,直径大于 且的例.%,直径的例.%。此外,肿瘤的大体类 型为隆起型的例.%,溃疡型侈.%,浸润型例.%,胶 样型例.%。 .肿瘤分化程度 ? 例结直肠腺癌中,高分化腺癌例.%,中分化腺癌例 .%,低分化腺癌例.%。 .随访情况 例病例取自.年在我院实施外科手术治疗并有完整随访资 料的结直肠腺癌患者,随访截至时间为年月。其中例存活, 例死亡;患者术后生存时间最长者为个月,最短者为周;年生存率 为%,年牛存率为.%,年生存率为.%。军医进修学院硕‘学位论文 .统计分析 对已成功获访且临床资料、蜡块均完整的例结直肠腺癌患者进行单 因素及多因素分析,结果如下: .单因素分析 单因素分析显示表,结直肠腺癌患者肿瘤大体类型.图 、组织学分级仁.图、肠壁浸润深度.图、淋巴 结转移情况.图、腹腔及远处转移情况.图及 分期.图均为影响预后的单因素指标;而患者性别、年 龄、肿瘤大小及肿瘤部位与术后生存时间无紧密联系分别为.、 .、.、.图、、、。 军医进修学院硕士学位论文 表 例获访结直肠腺癌患者临床病理特征及预后单因素分析?? 、军医进修学院硕:学位论文 ? ? .几。 . ??? ?? 图结直肠癌不同人体类型.生存曲线, 蓝色:隆起型:绿色:溃疡型;灰色:浸润型;紫色:胶样型。 ????? ? . 舯 图结直肠癌不同分化程度.生存曲线, 蓝色:高分化;绿色:中分化;灰色:低分化。 .埔 舯 ?“ ,。? ?? ‘.?? ? 图结直肠癌不同浸润深度.生存曲线,蓝色:粘膜或粘膜卜.层; 绿色:侵及肌层:灰色:穿透肌层至浆膜卜.;紫色:其他结构或器官。 军医进修学院硕:学位论文 』』 。瑟 、 图结直肠癌不同淋巴结转移情况.生存曲线, 蓝色:淋巴结无转移;绿色:有.枚淋巴结转移;灰色:超过枚淋巴结转移。 ”?? 图结直肠癌有无远处转移.生存曲线, 蓝色:无腹腔远处转移;绿色:有腹腔及远处转移。 “ “ . ?? ‘?“ 图结直肠癌不同分期生存曲线, 期;绿色: 期;灰色: 期;紫色:?期。 蓝色:军医进修学院硕:学位论文 ‖嬲?州 』门 图结直肠癌患者不同性别.生存曲线, 监色:男性;绿色:女性。 ?:扰 门门 图结直肠癌患者不同年龄分期.生存曲线, 蓝色:患者年龄?:绿色:患者年龄、:灰色:患者年龄。 』』 。慧 图结直肠癌不同人小.生存曲线, 监色:肿瘤直径绿色:肿瘤直径、 ;灰色:肿瘤直径?。 军医进修学院硕上学位论文 %“舯 ?几舯 “ ‘?? ‘?? 、 ‘??? .?? 图结直肠癌不同部位.生存曲线,蓝色:同盲部;绿色:升结肠; 灰色:横结肠:紫色:降结肠:黄色:乙状结肠;红色:直肠。 .多因素牛存分析 表多种临床病理因素及赋值 因素 赋值 性别 男,女 ?,?, 年龄 ? ,? , 肿瘤人小 同盲部,升结肠,横结肠,降结肠, 肿瘤部位 乙状结肠,直肠 肿瘤人体类型 隆起型,溃疡型,浸润型,胶样型 级,级,级 肿瘤组织学分级 粘膜或粘膜下层,侵及肌层,穿透肠 肠壁浸润深度 壁肌层至浆膜卜.,其它结构或器官 无转移,转移~枚,转移/枚 淋巴结受累 腹腔及远处转移情况 无转移,有转移 分期 期,期,期,?期 阴性,阳性 阴性,阳性 阴性,阿性 阴性,性 . 阴性,辟性 对患者的术后生存时间进行多因素分析表,,种入选的单因素军医进修学院 硕:学位论文 中,种入选多因素模型,分别是、、大体类型、组织学分级、 浸润深度、腹腔及远处转移、分期。这种因素的回归系数均为正,表 明它们与患者的术后生存时间呈正相关。患者肿瘤组织学分级越高、浸润的 越深、有腹腔及远处转移,分期越高、及的表达为阳性 者,术后生存时间短。 表术后生存时间多因素分析结果 例结直肠腺瘤患者的临床病理情况如下: .患者性别情况 例结直肠腺瘤患者中,其中男 .%,女 .%,男 女之比为.:。 .患者年龄状况 例结直肠腺瘤患者中,年龄最小者为岁,年龄最大者为岁, 平均年龄为.岁。年龄低于岁者例.%,.岁者例.%, .岁者例%,.岁者例.%,.岁者例.%,军医进修学院硕’:学位论文 .岁例..%,岁以上者例.%。.岁患者占其总 数的.%,其中又以.岁者为最多。 .肿瘤发生的具体部位 例结直肠腺瘤,发牛于左半结肠侈.%,右半结肠的例 .%,直肠例.%,混合存在例.%。 .肿瘤的大小及数目 例结直肠腺瘤中,肿瘤直径的例.%,直径?且 的例.%,直径一的侈.%。单发肿瘤例.%, 多发肿瘤例.%。 .肿瘤病理分型 例结直肠腺瘤中,管状腺瘤例.%,绒毛状腺瘤例 .%,管状绒毛状腺瘤例.%,锯齿状腺瘤例.%。 .肿瘤病变程度 例结直肠腺瘤中,非典型增牛例.%,轻度不典型增牛 例.%,中.重度不典型增牛例.%,早期癌变例.%。 .结直肠腺瘤临床病理特征与病变程度关系 用卡方检验分析结直肠腺瘤患者性别、年龄、大小、肿瘤数目、部位及 病理学分型与病变程度单纯腺瘤、轻度不典型增生、中~重度不典型增牛及 癌变的关系。结果显示:肿瘤大小及肿瘤病理学分型与病变程度之间具有 统计学意义分别为.,.。随着肿瘤直径增加,其癌变率增 高;绒毛状腺瘤癌变率管状绒毛状腺瘤锯齿状腺瘤管状腺瘤。 表 军医进修学院硕:学位论文 表结直肠腺瘤临床病理特征与病变程度的关系