血小板/T细胞活化抗原1

血小板/T细胞活化抗原1 【文档标题】 血小板/T细胞活化抗原1 【文档】 1985年burns等以活化t细胞为免疫原制备了抗活化t细胞表面抗原的单克隆抗体，并将其中1株单克隆抗体leo-a1识别的抗原命名为人t细胞系特异性活化抗原1(t lineage-specific activation antigen1, tlisa1)，实验证实tlisa1参与了ctl细胞的活化与分化〔1-3〕。随后的实验发现tlisa1也高表达于血小板表面，并与血小板的活化和凝集功能有关，遂将此抗原重新命名为血小板/t细胞活化抗原1(platelet and t cell activation antigen 1, pta1)〔4〕。1997年我实验室与澳大利亚newcastle大学癌症研究中心合作成功克隆了人pta1 cdna〔5〕。随后，我室又成功克隆了长臂猿和猴pta1全长cdna。pta1基因的克隆为进一步深入探讨pta1的功能打下了良好的基础。 有趣的是，pta1的基因序列与1996年dnax分子与细胞生物学研究院shibuya等发表的dnam-1分子(dnax accessory molecular-1, dnam-1)序列相同。dnam-1分子的发现过程同pta1十分相似，最初作者制备针对人ctl的单抗，发现其中dx11单抗能明显抑制ctl对多种肿瘤细胞系(如colo205、pa-1、mcf7等)的杀伤作用。shibuya等首先从外周血单个核细胞(pbmc)中通过dx11单抗亲和层析纯化了dx11识别的抗原，进行了部分蛋白序列测定，以多肽对应的pcr引物扩增出dnam-1的部分片段，再以32 p标记的探针进行筛选，最终获得了dnam-1的cdna序列。shibuya认为dnam-1分子是一种新的粘附分子，并可能与信号转导有关〔6〕。 到目前为止，pta1的配体(pta1 ligand, pta1l)尚未基因克隆成功。本实验室已成功构建、表达了pta1胞膜外区/igg1 fc段融合蛋白，通过pta1/ig融合蛋白进行的免疫组化及粘附阻断实验证实pta1配体表达于肿瘤细胞系colo205细胞膜表面。pta1配体的鉴定正在进行之中。 pta1的基因及结构 1997年sherrington等从以pcdm8为载体的活化jurkat细胞cdna文库中，通过leo-a1单抗panning的方法筛选得到人pta1阳性克隆〔5〕。人pta1基因为单拷贝基因，定位于染色体18q22-q23。其cdna全长1.4kb，53174bp和111bp非编码区。开放读框1 011bp，编码336个氨基酸，包括18个疏水氨基酸的信号肽，成熟蛋白由318个氨基酸组成，属i型跨膜糖蛋白。胞膜外区由232个氨基酸组成，形成2个免疫球蛋白超家族v样结构域，这种结构在免疫球蛋白超家族成员中是唯一的一个。pta1分子第19和90位的保守半胱氨酸形成链内二硫键，第134和204位的保守半胱氨酸形成第二个链内二硫键，这2个二硫键分别起到稳定胞膜外区2个结构域的作用。在90位和204位半胱氨酸处均存在免疫球蛋白超家族v样结构域的特征性基序asp-x(gly或ala)-x-try-x-cys基序。pta1胞膜外区含有8个潜在的n-糖基化位点和3个潜在的o-糖基化位点。当用内切糖苷酶(endo f)消化n-连接的糖基后，pta1的相对分子质量减小了30×103，表明pta1分子胞膜外区是高度糖基化的，这可能与pta1参与分子识别有关。pta1的糖基中含有大量的唾液酸，神经氨酸酶(neuraminidase)消化唾液酸后，其pi由3.5,4.2转变为7.8,8.2。pta1穿膜区由25个疏水氨基酸组成。胞浆区有61个氨基酸，含有3个酪氨酸、6个丝氨酸和6个苏氨酸， 胞浆区尾部含有一段ediyvny基序，中央酪氨酸的氨基端有2个带负电荷的谷氨酸和天冬氨酸(ed)，羧基端为缬氨酸、天冬酰胺和酪氨酸(vny)，此基序可作为非受体型蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, ptk)的底物。并可以和蛋白酪氨酸磷酸酶2(protein tyrosine phosphatase 2, ptp2)氨基端的sh2结构域结合。另外，在pta1胞浆区还存在着酪蛋 白激酶?(casein kinase ?)和pkc作用的底物s/t结构。胞浆区的上述结构和基序提示pta1分子可能参与t细胞和血小板活化的信号转导过程〔4，5〕。人、猿、猴pta1分子cdna及蛋白水平的同源性为93%,95%，表明pta1在生物进化过程中高度保守并可能具有重要的功能。 burns等通过leo-a1单抗亲和层析的方法从血小板上纯化了pta1分子，并进行了蛋白部分序列测定，证实pta1分子为一全新的分子。通过纯化的pta1分子再次免疫制备了抗pta1的单克隆抗体newe1和newi1〔3〕。而后通过免疫沉淀证实从血小板、jurkat细胞和t细胞上沉淀下来的分子是相同的。采用流式细胞仪检测发现leo-a1和newe1能结合到pma刺激的jurkat细胞膜表面，并且平均荧光强度相同，但newi1不能在pma刺激的jurkat细胞膜表面着色，当增加jurkat细胞膜通透性后，newi1能使jurkat细胞着色，并且获得与leo-a1和newe1相同的荧光强度，表明newi1识别的表位位于pta1胞浆区。 用leo-a1单抗进行的血小板裂解物免疫沉淀证实pta1相对分子质量为(65,70)×103，蛋白带并不均一。o’farrell双维电泳(two dimensional gel analysis)表明从活化t细胞免疫沉淀得到的pta1分子为一弥散产物，pi范围为4.0,6.5，而血小板来源的pta1分子的pi为3.5,4.2，其差别可能是由于糖基化不同造成的，用神经氨酸酶切除唾液酸后，两种来源的pta1分子pi均转变为8.0，相对分子质量减少为(60,65)×103〔4〕。burns等还发现，在不同的细胞系及不同的刺激条件下，通过免疫沉淀有2,3种相关蛋白同pta1分子共沉淀下来，相对分子质量为(65,90)×103不等，pi4.0,6.5。当用leo-a1单抗及不同血小板活化剂刺激血小板时，pta1被快速磷酸化，同时相关蛋白中的部分分子也发生了低水平的磷酸化〔4，7〕。但这些共沉淀分子的特性、作用及结构仍不清楚。这些附加蛋白在人类嗜t淋巴细胞?型病毒感染的hut102b2细胞系中总能被免疫沉淀下来，在pha刺激的t细胞中有时能沉淀下来，而在jurkat细胞系中未能沉淀下这种蛋白。这些蛋白的发现总与肌动蛋白(actin)同时存在，提示这些蛋白定位于细胞内。 用125i标记pma刺激的jurkat细胞及血小板胞膜，再用磷酸肌醇磷脂酶c(phosphatidyl inositol phospholipase c)处理细胞，然后在jurkat细胞上清中可以检测到从细胞膜上释放的pta1抗原，表明pta1分子至少是部分通过糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol, gpi)方式锚定于细胞膜上的。其它参与细胞信号转导的膜表面分子中，有部分是通过gpi方式锚定于细胞膜表面的。而在血小板上清中未发现pta1抗原的释放，可能血小板pta1分子主要以跨膜方式连接于血小板胞膜上，另一种可能是血小板胞膜对外源性酶的作用不敏感。 pta1的表达及表达调节 已获得的实验证据表明，pta1主要表达于巨核/血小板谱系、活化t细胞、nk细胞、单核细胞、胸腺细胞、及多种转化的造血细胞系。pta1较高水平地表达于血小板，平均1 200个分子/每个血小板〔4〕。pta1在巨核/血小板谱系有组成性表达，并且受到tpa(pkc激活剂)及pha的上调。在部分白血病细胞系中，pta1具有异质性表达(如红白血病细胞tf-1、巨核细胞dami及hel组成性表达pta1，而红白血病细胞k562不表达pta1〔9〕。上述结果提示，pta1可能与髓样干细胞?cfu-gemm?巨核细胞?血小板的发育过程及功能有关。另外，某些t细胞杂交瘤、t细胞白血病细胞高表达pta1，hut-102b2细胞系表达较高水平的pta1，长臂猿细胞系mla-144也高表达pta1分子〔8〕。 pha活化的正常t细胞及混合淋巴细胞反应中的活化t细胞表达pta1分子，并受细胞因子及其它活化剂的调节，其中il-1α、il-1β、il-2、il-3、tnf-α及佛波酯pma(phorbol ester)均对pta1表达有上调作用。il-1和il-2最佳反应剂 量为200u/ml，pma的最佳浓度为20,50ng/ml。几乎所有的刺激实验均表明pta1在刺激后半小时至1小时内引起leo-a1 mcab结合的减少，随后在10,20小时内pta1的表达达到高峰。tgf-β对pta1的表达有下调作用〔3〕。 pma和il-2对pta1表达的上调作用依赖于蛋白质的合成。100μg/ml放线菌酮(cycloheximide)即完全抑制了il-2和pma对pta1表达的诱导。而il-1的刺激实验有所不同，在实验早期pta1的表达没有减少，表达的高峰在刺激后7,8小时，15,18小时后降回本底水平，放线菌酮对il-1的诱导作用几乎无影响，表明il-1诱导的pta1快速表达过程不依赖于蛋白质的合成。这一现象，提示可能存在细胞内pta1分子的储存和pta1受细胞因子调节的再分布。而且，在血小板中确实存在着膜结合的空泡结构和tortou管道系统，可以作为血小板pta1分子的胞浆储存池〔4〕。 pha或cd3 mcab能刺激静止t细胞pta1抗原的表达。但pha对jurkat细胞pta1的表达无刺激作用，组成性高表达pta1的hut102b2细胞在受pha刺激后，表达水平反而下降。 除mla-144细胞受pma刺激后pta1表达下降外，几乎所有测试细胞受pma刺激后pta1的表达均升高。其中，jurkat细胞对pma的刺激反应最为敏感和强烈，静止jurkat细胞不表达pta1 mrna，当jurkat细胞受pma刺激12小时后开始转录pta1 mrna，其转录子1.6,5.0kb不等。pha预先刺激的外周血t细胞受pma刺激后，首先pta1的表达下降并低于未处理水平，6小时后开始渐渐升高，24,30小时后达到高峰(pta1表达几乎增高5倍)，但这种上调作用出乎意料地被a23187完全阻断。单独的pha、cd3 mcab和a23187均无刺激pta1表达的作用，当上述试剂分别同pma同时作用时，均明显减弱或完全阻断了pma对pta1表达的诱导作用。 pta1的功能 1.刺激血小板活化及聚集 pta1 mcab属于血小板刺激型抗体，这类抗体与巨核细胞发育及免疫性血小板减少有密切的联系，如cd41/cd61(gp?b/?a)、cd9、cd36抗体。pta1 mcab可以诱导血小板活化、聚集，这种作用需要抗体fc段的介导，leo-a1 mcab去除fc段后即失去了刺激血小板聚集的功能〔4，7〕。有意义的是pta1 mcab对格兰茨曼血小板功能不全(glanzmen’s thrombasthenia)患者血小板无活化及促聚集作用，提示pta1可能与血小板功能异常性疾病的发病机理有关〔4〕。newe1在5μg/ml以上浓度均能直接刺激血小板分泌和凝集，newe1刺激血小板凝集的潜伏期明显延长，并且这一潜伏期依赖于抗体的浓度。 2.在混合淋巴细胞反应中抑制ctl的分化 将leo-a1 mcab或其f(ab’)2片段加入mlc或t细胞培养体系中能抑制t细胞向细胞毒t细胞分化，明显减少ctl及lak细胞产率，这一作用不依赖抗体的fc段。pta1 mcab只能在mlc初期发挥作用，抑制ctl的分化，在杀伤阶段leo-a1 mcab不能抑制ctl的细胞毒活性，提示pta1作用于ctl的分化阶段〔1-3〕。但dx11 mcab能在杀伤相抑制ctl对多种肿瘤细胞的杀伤〔6〕，提示leo-a1及dx11 mcab识别的pta1表位可能不同。 leo-a1及newe1 mcab能以剂量依赖方式抑制cd3诱导的t细胞增殖，它们单独或联合均不能刺激pbmc和纯化的t细胞的增殖。在mlc反应体系中加入10μg/ml抗体，第7天时实验组3h-tdr的掺入率要比对照组低50%左右。 但leo-a1及newe1 mcab对pha诱导的单个核细胞增殖无抑制作用，对亚适剂量的pha (1μg/ml)和绵羊红细胞刺激的纯化t细胞的增殖也无抑制作用，这2种抗体对cd2(t111和t112 刺激)诱导的t细胞增殖反应亦无抑制作用，提示pta1与cd2活化通路是不相同的。 3.pta1可能参与信号转导 pta1与tactile、neuroglian及cea家族的粘附分子有一定的同源性，pta1的表达特点 及上述同源性提示pta1可能是某种细胞外分子的细胞膜受体〔7〕。pta1胞浆区具有ptk、酪蛋白激酶?、pkc等多种蛋白激酶的底物结构，其胞浆区的ediyvny基序可以作为非受体型蛋白酪氨酸激酶的底物，在其氨基端有2个带负电荷的氨基酸残基，这2个残基与其羧基端的3个残基构成了sh2分子的识别位点，提示pta1可能参与细胞的信号转导〔5〕。血小板颗粒的释放被认为与蛋白激酶c(pkc)的活化有关，leo-a1 mcab能持续性诱导血小板聚集，且这一过程不依赖于血小板颗粒的释放。 当leo-a1 mcab结合pta1分子后引起了该分子的酪氨酸磷酸化，抑制蛋白磷酸化的激酶抑制剂能抑制血小板的聚集，酪氨酸磷酸化被公认为是信号转导中的主要生化事件〔7〕。由于pta1分子的胞浆区不含任何激酶活性及可能的结构域，因此pta1可能通过此sh2识别位点与胞浆内的其它信号转导分子发生相互作用。 4.pta1与疾病的关系 已获得的实验证据显示，pta1与免疫相关性疾病有着密切的关系，这些疾病主要包括自身免疫性疾病、病毒感染性疾病、肿瘤及移植排斥反应。pta1在移植物抗宿主病、肾综合征出血热、尖锐湿疣患者pbmc，及胃癌浸润淋巴细胞、桥本氏甲状腺炎浸润t细胞中有较高水平的表达。由于pta1分子表达于活化t细胞，因此pta1可能参与了这些疾病的免疫应答或免疫病理过程〔9，10〕。 tabata等发现，类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮患者的外周血及关节液t细胞pta1的表达水平明显增高。在上述患者中存在着全身或局部t细胞的活化，这可能与上述疾病的发病机理有关〔11〕。在肌炎患者中，pta1表达水平比正常对照增高，并且pta1的表达水平与疾病的活动性相关〔12〕。在出血热患者中，cd25及pta1的表达均升高，在急性期明显高于康复期，提示出血热患者处于较高水平的细胞免疫状态，这有利于机体清除病原体〔13〕。在心脏及肾脏等器官移植患者中，pta1以及其它的t细胞活化标记(如il-2r)均高于正常对照，但在心脏移植患者中，pta1的表达水平与病情未见明显的联系〔14〕。 pta1分子是具有重要功能的新分子，有关pta1的进一步研究尚有大量的工作要做。pta1及pta1l的组织细胞分布、功能、pta1/pta1l的相互作用及其介导的信号转导过程、pta1与疾病的关系及pta1l基因克隆是本课题今后进一步研究的主要内容。