试验六 过氧化物酶活性测定[优质文档]

试验六 过氧化物酶活性测定[优质文档] 实验六 过氧化物酶活性测定 一、实验目的 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握愈创木酚法测定过氧化物酶。 二、实验原理 在过氧化物酶(POD)催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470 nm处有最大光吸收值，故可通过测470 nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。 四、设备与试剂 分光光度计，TDL-5000B型低速冷冻多管离心机(R=18cm)，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。0.05mol?L-1的磷酸缓冲液(pH5.5)，0.05 mol?L-1愈创木酚溶液，2, HO。 22 五、实验步骤 (一)酶液的制备 取1.0,5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000×g离心10min，上清液转入25mL容量瓶中。沉淀用5mL磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。 (二)过氧化物酶活性测定 酶活性测定的反应体系:依次加入2.9mL0.05mol?L-1磷酸缓冲液;1.0mL2,H2O2;1.0mL 0.05mol?L-1愈创木酚和 0.1mL 酶液。用加热煮沸 5min 的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于 34?水浴中保温 3min，然后迅速稀释 1倍，470nm 波长下比色，每隔1min1次吸光度A470，共记录5次，然后以每分钟内A470变化0.01为1个酶活性单位(U)。 六、实验结果 以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)。 W——马铃薯鲜重(g); t——反应时间(min); VT——提取酶液总体积(mL); VS——测定时取用酶液体积(mL)。 七、注意事项 酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行。H2O2要在反应开始前加，不能直接加入。 实验七 过氧化氢酶活性的测定 一、实验目的 过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。熟悉过氧化氢酶活性的不同测定方法。 二、实验原理 滴定法:过氧化氢酶(CAT)属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据 H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量(反应过量)的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的过氧化氢，即可求出消耗的H2O2的量。 5HO+2KMnO+4HSO?5O+2KHSO+8HO+2MnSO 224242424 氧电极法:过氧化氢在过氧化氢酶的作用下，放出氧气，其放氧量与过氧化氢酶的活性成正比。放出的氧可用氧电极定量测定。 磷酸盐缓冲液(pH7.0) 取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml，用水稀释至100ml，即得。 磷酸盐缓冲液(pH7.8):取磷酸氢二钠35.9g，加水溶解，并稀释至500ml。