雷帕霉素及其衍生物开发现状、作用机制及生物合成研究进展

雷帕霉素及其衍生物开发现状、作用机制及生物合成研究进展 雷帕霉素及其衍生物开发现状、作用机制及 生物合成研究进展 中国抗生素杂志2011年l1月第36卷第11期 文章编号:1001-8689(2011)11-0806.08 雷帕霉素及其衍生物开发现状,作用机制及生物合成研究进展 李进邹祥’ (西南大学药学院,重庆400715) 摘要:目的介绍了近年来雷帕霉素及其衍生物的开发现状,作用机制与生物合成途径,探讨了通过前体定向生物合成与 诱变生物合成的方式,获得雷帕霉素衍生物的研究进展,展望了雷帕霉素及衍生物的研究前景.方法分析,归纳,近年 来发的相关文献.结果与结论雷帕霉素及其衍生物是新型强效的免疫抑制剂与抗肿瘤药物,具有抗真菌,抗增殖及潜在延 长哺乳动物寿命周期等作用.采用前体定向生物合成,诱变生物合成与组合生物合成的方式,可快速获得其具药理活性的衍生 物.基于生物合成途径,采用系统生物学相关手段可获高产工程化菌种应用于工业化生产. 关键词:雷帕霉素;mTOR;生物合成;前体定向生物合成;诱变生物合成 中图分类号:R979.5文献标识码:A Progressondevelopmentsituation,mechanismandbiosynthesisofrapamycin anditsanalogs LiJinandZouXiang (CollegeofPharmaceuticalSciences,SouthwestUniversity,Chongqing400715) Abstract0bjectiveTherecentdevelopmentsituation,mechanismandbiosynthesisofrapamycinandits derivativeswerereviewed.andtheresearchprospectofrapamycinanditsanalogswerefurtherforecasted.Methods Theliteraturespublishedinrecentyearswereanalyzedandsummarized.ResultsandConclusionRapamycinand someitsanalogsarenewpotentimmunosuppressiveandanticancerdrugs.whichhaveobviouseffectsonanti—funga1. anti—proliferation.andthepotentialtoextendthelirespanofmammalianandSOon.BytheWaysofprecursor-directed biosynthesis.mutationalbiosynthesisandcombinatorialbiosynthesis.somenovelanalogsofrapamycincanbe obtained.andthehigh.yieldstrainstendtobereconstructedforindustrialproductionbythemeansofsystembiology. KeywordsRapamycin;mT0R:Biosynthesispathway;Precursor-directedbiosynthesis;Mutationalbiosynthesis 雷帕霉素(rapamycin)3L称为西罗莫~(sirolimus), 主要由发酵法生产,现已被开发成为强效免疫抑制 剂应用于临床.1975年Veniza等【l】从复活岛上的土壤 中,分离得到产雷帕霉素的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus);1993年Kojima等[2]发现在游动放线菌 ctinoplanessp.N902—109)也具有合成雷帕霉素的能 力.之后,以雷帕霉素为中间体半合成一些结构新 颖的衍生物,并发现雷帕霉素衍生物还具有免疫抑 制,抗癌,抗帕金森氏症与艾滋病等方面具有新的 治疗作用,以及用于血管涂层支架功能等.最近, Nature杂志报道以小鼠动物模型,雷帕霉素在延长 哺乳类动物的生命周期上具有一定的潜在作用[3],这 一 发现被美国《科学》杂志评为2009年度十大科学 发现之一.近几年,有关雷帕霉素新的药理作用机 收稿日期:2010.12—01 基金项目:国家新药创制重大专项项目(2010ZX09401—306—4—4);重庆市创新能力建设项目(CSTC,2009CB1010)~西南大学基本科研业务 费科研项目(XDJK2009C175);西南大学博士基金项目(SWU109034) 作者简介:李进,男,~T-1984年,在读硕士研究生,主要研究方向为微生物与生化药学.’通讯作者,E-mail:zhxl030l@SWH.edu.cn 雷帕霉素及其衍生物开发现状,作用机制及生物合成研究进展李进 等807 制,代谢调控机制等方面研究成为热点.因此,本 文就当前雷帕霉素及其衍生物的生物合成进展,开 发现状和作用机制进行介绍. 1雷帕霉素及其衍生物的开发现状及其作用机制 雷帕霉素于1999年9月美国FDA正式批准作为 肾移植的免疫抑制药物投放市场,临床活性比环孢 H3C Teinsirolimus O 菌素强10,100倍,毒副作用更小;并且在器官移植 患者中,因其他免疫抑制剂如环孢菌素的应用,患 者的肿瘤发生率会大大增大,而雷帕霉素在抑制排 斥反应同时也会抑制肿瘤的生长.在众多的雷帕霉 素衍生物中,雷帕霉素的几种半合成衍生物在水溶 性及其他药理活性上均强于雷帕霉素(见图1).雷 CH o. ~jOH R~pmnycin H3 Eveml~nm , —N 图1雷帕霉素及其同系物结构 Fig.1ThestruCturesofrapamycinanditsanalogs 帕霉素衍生物替西罗莫司(temsirolimus),依维莫司 (everolimus),Deforolimus(AP23573,MK-8669)由于 能对多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用,现已被应 用于临床或临床试验中.替西罗莫司是2007年美国 FDA正式批准的一种可溶性酯化衍生物,主要用于 晚期肾癌的治疗,且该药物现已通过治疗乳腺癌的 二期临床[4.s】;依维莫司是一种口服剂型,已于2009 年3月被FDA批准用于肾癌的治疗,同时用于治疗霍 杰金淋巴瘤的试验已经完成二期临床[6];Deforolimus 是雷帕霉素C40位衍生物,己被FDA以快速通道方 式,批准用于治疗软组织与骨肉瘤,现已完成治疗 血液癌(白血病和淋巴瘤)的二期临床,对子宫内膜癌 的治疗也进入了二期临床【】.Zotarolimus是雷帕霉素 C40位四唑取代物,相比雷帕霉素具有体内半衰期短 的特点,Zotarolimus用于血管涂层支架,能有效的 预防冠状动脉治愈后再狭窄的效果[8]. 雷帕霉素的多种有效生物活性,依赖于其特殊 的作用分子靶位:雷帕霉素靶蛋~mTOR(mammalian targetofrapamycin)[9].这是一种丝氨酸.苏氨酸激 酶,分子量为289kDa,在调控细胞内环境及细胞生 长的信号通路中,处于核心的地位.mTOR与不同 的小分子蛋白结合形成复合物的形式,呈现其不同 的功能,主要复合物有两种:mTORC1复合物(包 含mTOR,Raptor和mLST8)~[1mTORC2复合物(包 含mTOR,Rictor,G/3L和mSin1)[1~](见图2).mTOR 上游的调节因子如:胰岛素样生长因子(IGF.1)和 PDK.1等,级联磷酸化激活蛋白激酶B(Akt),Akt一 方面磷酸化抑制富含脯氨酸的Akt受体(PRAS40),促 808中国抗生素杂志2011年11月第36卷第11期 图2雷帕霉素及衍生物的作用机制 Fig.2Themechanismofrapamycinanditsanalogs 使PRAS40脱离roTOR,进而激活mTORC1复合物. 另一方面,Akt抑制TSC1/TSC2复合物中TSC2的GTP 激酶活性,进而诱导GTP绑定蛋白(GTP—Rheb)的含 量,从而激活mTORC1复合物.mTORC1复合物通 过磷酸化作用,一方面激活核糖体S6激酶(P70S6K) 使核糖体蛋白磷酸化促进mRNA的翻译,另一方面 促使真核生物翻译起始因子4E结合蛋白1(4E.BP1) 磷酸化,4E—BP1是真核生物翻译起始因子4E(elF4E1 的抑制剂,4E.BP1磷酸化后,释放出真核生物翻译 起始因子4E(elF4E1,允许mRNA翻译.脂溶性的雷 帕霉素及其衍生物与细胞蛋白FKBP.12(FK506bind protein)结合之后,再与mTORC1形成复合物从而抑 制其向下游靶点传递信号,抑~IJmRNA的翻译,从 而间接或直接的调控翻译起始阶段,膜的转运,微 丝的形成,tRNA的形成与转录等,产生免疫抑制和 抗肿瘤作用.鉴于mTOR信号网络的复杂性,采用其 他药物和雷帕霉素进行联合用药往往具有良好的效 果.Puli等[11]发现与雷帕霉素单独用药相比,利用雷 帕霉素与异黄酮类药物进行联合用药,对人恶性胶 质瘤细胞具有更好的治疗效果. 2雷帕霉素的生物合成 雷帕霉素是当前最有前途的药物之一,由于其 复杂的结构,较大的分子量,难以进行化学合成, 现主要采用发酵的方法进行生产,然而生产过程存 在菌种产量低,发酵周期长,中间产物多,下游分 离提取方法复杂等关键技术难题.近年来,雷帕霉 素的生物合成途径逐渐被阐明,主要由合成起始, 聚酮链的延长,环化以及修饰4个部分组成. 1995年schwecke等报道[12]雷帕霉素的合成基因 簇序列全长为107.3kb,包含26个开放阅读框(ORF, (见图3,4).该合成基因簇最大的特点就是含有3个 格外巨大的阅读框:rapA,rapB和rapC.这3个阅读 框分别编码多肽域RAPSl,RAPS2和RAPS3.这3个 结构域共含有合成起始模块和14个催化合成模块, 每个催化合成模块催化1个延伸单位结合到雷帕霉素 的聚酮链上. 聚酮合酶(polyketidesynthase,PKS)是催化形成聚酮 化合物的多酶复合体,在雷帕霉素的I型PKS上【,】,含有 如下的结构域:D一酮脂酰合成酶(13.ketoacylsynthase, KS),酰基转移酶(acyltransferase,AT),酰基载体蛋 (~(acylcarrierprotein,ACP),脱氢酶(dehydratase, DH),烯酰还原酶(enoylreductase,ER),13-酮脂 酰还原酶(p—ketoacylreductase,KR)~I羧酸连接酶 (carboxylicacidligase,CL,. 雷帕霉素及其衍生物开发现状,作用机制及生物合成研究进展李进等 A WVRSUTQONMLKJIHGFED 图3雷帕霉素生物合成基因簇[12】 Fig.3Organizationoftherapamycinbiosyntheticgenecluster 图4雷帕霉素合成酶基因[I2] Fig.4Thesynthetasegeneofrapamycin 1.1ACP蛋白的活化与聚酮链合成的起始 酰基载体蛋白是PKS合酶的必需结构域之一, ACP在翻译之后,必须经过磷酸泛酰巯基乙胺基转 移酶的催化,才能进入活化状态.具体的活化机制 为:辅酶A是磷酸泛酰巯基乙胺基的供体,它在磷酸 泛酰巯基乙胺基转移酶的催化下与ACP进行反应, ACP的丝氨酸支链攻击CoASH的焦磷酸键,从而将 磷酸泛酰巯基乙胺基转移到AcP蛋白上,使ACP进 入活化状态[. 同位素示踪实验证】:雷帕霉素结构的环己烷 部分,来源于莽草酸或莽草酸途径中间物,莽草酸途 径是芳香簇氨基酸生物合成途径.Lowden等[】6_617]研究 发现二羟基环己烷羧酸为雷帕霉素生物合成的起始 羧酸单位,推测由莽草酸或莽草酸途径中间物衍生 物产生的二羟基环已烷羧酸在起始模块的羧酸连接 酶的催化下,被ATP活化,形成AMP.起始单元.之 后转移到已经活化的酰基载体蛋白上,被烯酰还原 酶还原后,转移~JRAPS1的8一酮脂酰合成酶上,由 二二二==二 l ________-___?___---_-__ 此开始大环内酯链的延伸. 1.2聚酮链的延长 Paiva等[I8】利用”C标记同位素示踪实验发现雷帕 霉素内酯环是由6个乙酸和7个丙酸组成,3个甲氧基 来自蛋氨酸.在雷帕霉素的基因序列研究中【],也 在编码I型PKS中的酰基转移酶序列中发现了丙二酰 辅酶A的识别序列. 辅酶A在聚酮化合物生物合成过程中的另一作 用是作为羧酸前体的载体,形成CoA.羧酸前体的 形式,进行聚酮链的延伸.雷帕霉素生物合成过程 中,延伸单位为丙二酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A, 它们通过缩合反应结合并延伸聚酮链. 通过乙酰辅酶A羧化酶(acetyl—CoAcarboxylases, ACCs)羧化乙酰辅酶A,形成丙二酰辅酶A是聚酮化 合物合成过程中形成丙二酰辅酶A采用的主要途径. 甲基丙二酰辅酶A来源于丙酰辅酶A羧化酶(PCC)对丙 酰辅酶A的羧化;甲基丙二酰辅酶A变位酶(MCM)使 琥珀酰CoA的差向异构化和重排等五个途径[19-20].这 中国抗生素杂志2011年11月第36卷第11期 些途径的前体多数是来源于脂肪的代谢,脂肪分解成 为甘油和脂肪酸.脂肪酸经过p.氧化途径生产乙酰辅 酶A,故在发酵培养基中添加甘油或酸酯可以提高雷 帕霉素产量,Krol等[2l】通过在线雷帕霉素发酵液 中的溶解二氧化碳的量,来控制发酵过程甘油流加速 率,120h发酵终点时雷帕霉素产量达到了500mg/L. 雷帕霉素结构类似物他克莫司(FK506)也是由链 霉菌属产生的23元环大环内酯免疫抑制剂.FK506生 物合成是以二氢环已烷羧酸为起始单元,丙二酰辅 酶A,甲基丙二酰辅酶A,丙酰丙二酸单酰辅酶A, 甲氧基丙二酰一ACP为延伸单位,由I型PKS与NRPS 复合酶系统催化所得.韩国Mo等【20]以棒状链霉菌 CKD1119为研究菌株,通过前体供应和基因工程的 方法,发现甲基丙二酰辅酶A是产FK506的关键前体 之一,当培养基中添加油酸甲酯后FK506产量提高, 并发现丙酰辅酶A羧化酶,甲基丙二酰辅酶A变位酶 和丙二酰/甲基丙二酰辅酶A连接酶催化的三个甲基 丙二酰辅酶A产生途径中,甲基丙二酰辅酶A变位酶 途径最为有效. 1.3聚酮链的环化 雷帕霉素的生物合成中聚酮链的环化,采用较 特殊的机制进行,通过雷帕霉素基因簇序列相似性 分析,发现了rapL~lrapP基因与编码鸟氨酸环化脱 氨酶和非核糖体肽合成酶(NRPS)的基因序列惊人的 相似[z】.之后Cheng等【]在化学成分确定的培养基 中,添加L.赖氨酸发现雷帕霉素的产量达为提高至 150%.Haydock等[3】根据这种相似性提RapL为L一 赖氨酸环化脱氨酶负责催化L.赖氨酸转变为L一哌可 酸的构想.于是Khaw等[24】通过对rapL进行移码突 变以及补料实验,对上一假设进行了证明,并发现 雷帕霉素生物合成过程中,将L.哌可酸纳入聚酮链 的非核糖体肽合成酶(NRPS)不具有严格的底物专一 性,当在培养基中添加脯氨酸及其类似物时,rapL 突变菌株合成雷帕霉素衍生物.Konig等【z5】研究证 实rapP编码的非核糖体肽合成酶催化L.哌可酸结合 到雷帕霉素聚酮链骨架上,促使链的环化.非核糖 体肽合成酶(NRPS)是含肽类抗生素,生物合成必需 的多功能,多模块的复合催化酶,包括起始模块, 延伸模块和终止模块,每种模块包含一定的催化 区域.NRPS包含如此下的区域:腺苷酰化区域fA domain),缩合区域fcdomain),肽基载体区域(PCP domain),差向异构化区域fEdomain),甲基转移酶 区域(MTdomain),硫酯酶(TEdomain)~261. 1.4Post—PKS的修饰 Gregory等【271对雷帕霉素合成PKS基因右侧的 rapQ至rap基因被敲除,其他的基因被保留.当将 rapK~建~IJPKS基因基因簇后,通过对发酵提取物分 析发现Tper-rapamycin(见图3).在雷帕霉素生物合成 的中间体per—rapamycin合成之后,由PKS基因右侧的 几个基因编码的蛋白进行催化及修饰形成雷帕霉素. 主要的修饰酶有:rapI,rapM~rapQ编码的甲基转移 酶;口,编码的细胞色素P450单加氧酶;rapO 编码的铁氧还蛋白[23.28].Gregory等【8】进一步采用基因 互补和异源转化等实验,对菌株的发酵产物进行分离 纯化分析,提出了修饰路径为:?通过RapI对C39进 行甲氧基化;?利用RapJ对C9进行氧化产生酮基; @RapM催化Cl6甲氧基化;?RapN催化C27的羟基 化以及RapQ对C27甲氧基化[28-29(见图3). 1.5雷帕霉素生物合成过程代谢调控 雷帕霉素的生物合成过程是一个相当复杂的过 程,要求一个高效的调控网络来保证初级代谢而来 的前体供应,以及前体在PKS上的结合与催化和PKS 的后修饰过程.通过基因序列相似性分析,发现 rapR,rapS,rapY,rapK,rapH~IIrapG均有可能在 生物合成过程中发挥正向或负向的调控作用【23】,然 而至今雷帕霉素生物合成的调控机制还并不清晰, 这也是当前研究热点之一. Gregory等[27】通过基因敲除,前体羧酸补入实验 以及序列的相似性分析,提出TrapK~码的RapK蛋 白在莽草酸或莽草酸途径中间物衍生物产生的二羟 基环已烷羧酸过程中起调节作用.英国Kuscer等[,o】通 过基因敲除,过表达与互补实验,发现rapH~HrapG 在都具有正向的调控作用,其中rapG是合成的必 需,rapH起到了辅助的作用,过表达其中之一都会 增加雷帕霉素的产量. 3雷帕霉素衍生物的生物合成 微生物来源的天然产物衍生物的获得,主要通 过前体定向生物合成,诱变生物合成,化学修饰, 组合生物合成,基因工程等操作手段进行.现已上 市或临床试验中的雷帕霉素衍生物如替西罗莫司, 依维莫司,Deforolimus都是对雷帕霉素C40位进行化 学修饰得来.现今通过前体定向生物合成及诱变生 物合成方法获得生物活性提高的雷帕霉素衍生物, 是当前研究的热点. 前体定向生物合成(precursor-directedbiosynthesis, PDB)是将生物学知识与化学知识相结合获得新化合物 雷帕霉素及其衍生物开发现状,作用机制及生物合成研究进展李进等8l1 图5雷帕霉素的生物合成途径 Fig.5Thebiosynthesispathwayofrapamycin 的有效方法.前体定向生物合成方法是直接将可变 的前体同系物添加入微生物发酵液中,而获得可变 产物的方法.相对于其他方法,前体定向生物合成 具有直接方便,绕过费时的基因操作的优点,但在 生产中,具有产量低且下流工艺对分离技术要求较 高的缺点[3】】.由于PKS/NRPS对前体不具有专一性, Lowden等[,z】将21种羧酸加入培养基中,进行前体定 向生物合成,发现环己烷羧酸,环庚烷羧酸和环己 烯羧酸能够装载到PKS的起始模块中,能产生衍生 物.美国Ritacco等[33】研究发现L.哌可酸的类似物哌 啶酸可以竞争性抑SOL一赖氨酸环化脱氨酶的活性, 减少L.哌可酸的产量.于是在含有5mg/mL哌啶酸培 养基的培养基中加入2mg/mL的L.哌可酸类似物1,4. 硫氮杂苯羧酸和1,3一硫氮杂苯羧酸分别获得了20.硫 代雷帕霉素和15.脱氧一l9硫氧雷帕霉素两种含硫雷 帕霉素衍生物. 诱变生物合成(mutationalbiosynthesis,MBS) 是指采用物理,化学或基因改造的方式,对产物生 物合成途径的某一点进行定点突变,获得丧失合成 产物能力的突变株.再在这一突变株发酵过程中, 添加天然或人工合成的化合物作为前体,从而获得 相应产物衍生物的过程【,】.诱变生物合成是化学合 成与生物合成相结合的方法,可以快速的建立次生 代谢产物库.通过组合生物合成的方式,采用可变 的起始前体单元,选择性地进行Post.PKS的修饰程 序,利用可变氨基酸替代L.哌可酸,结合对PKS/ NRPS基因簇进行改造,可获得大量新的,具有药物 活性价值的衍生物.Gregory等[34】通过基因工程定点 突变的手段,对PKS基因右侧的rap(KIJMNOQL)基 因进行敲除,在培养基中补入二羟基环已烷羧酸的 结构类似物,发现了多种pre.rapamycin的衍生物. 4展望 自雷帕霉素生物合成基因簇1995年被报道以来, 虽然吸水链霉菌中雷帕霉素生物合成途径已基本阐 明,但合成过程中的调控途径还并不清晰.并且,至 今未见游动放线菌生物合成雷帕霉素基因簇的报道. 基于现阶段雷帕霉素生产过程中的技术难点, 结合雷帕霉素的生物合成机制,采用基因工程,代谢 工程与传统诱变育种方式的结合,对合成基因簇特别 是调控基因进行强化表达,有可能获得雷帕霉素高产 工业菌株.Chen等J通过原生质体育种技术,获得 了高产雷帕霉素的菌株(345mg/L)比起始菌株产量提 8l2中国抗生素杂志2011年11月第36卷第l1期 高了23.6%.再采用了基因组重排技术获得了产量达 ~lJ445mg/L的高产菌株.Zhu等『36]通过传统紫外诱变 结合理性化筛选的方法,获得高产菌株(450rng/L), 并成功放大至20000L发酵罐(783mg/L).但是在缺 乏系统性的观点下,仅仅对微生物进行随机诱变与 遗传修饰,往往会导致细胞内代谢途径负向转变, 在系统生物学框架下,以整个细胞网络作为优化对 象,结合转录组,蛋白组,以及代谢组分析,并建 立相应模型进行模拟分析,可以快速评估细胞内不 同的调控系统,如:转录调控,翻译调控,反馈抑 制和代谢流的分布,筛选出关键限速节点,进行代 谢工程改造,有可能获得优良的高产菌种. 近十年来,新的抗生素的筛选产生越来越困难, 同时耐药性的问题目益突出,迫切的需要开发出新的 药物.随着组合生物合成与合成生物学技术的快速发 展,高通量筛选技术,特别是高内涵筛选技术的逐 步成熟,在系统生物学,生物信息学的协助下,基 于雷帕霉素生物合成基因簇的新药开发,必然具有 巨大的潜力和广阔的应用前景. 参考文献 V6zinaC,KudelskA,SehgalSN.Rapamycin(AY-22,989), anewantifungalantibiotic[J].JAntibiot,1975,10:721—726. NakaoK,YasuhiroK,TatsuoS,eta1.Novelrapamycin producer:European,022446[P].1993—11-11. HarrisonDE,S~ongR,SharpZD,eta1.Rapamycinfed lateinlifeextendslifespaningeneticallyheterogeneous mice[J].Nature,2009,460:392—395. HudesG,CarducciM,TomczakP,eta1.Temsirolimus, interferonalfa.orbothforadvancedrenal—cellcarcinoma[J]. 81. NEnglJMed,2007,356:2271— ChanS,ScheulenME,JohnstonS,eta1.PhaseI1study oftemsirolimus(CCI一779),anovelinhibitorofmTOR,in heavilypretreatedpatientswithlocallyadvancedormetastatic breastcancer[J].JClinOncol,2005,23:5314-5322. JohnstonPB,InwardsDJ,ColganJP,eta1.APhaseIItrial oftheoralmTORinhibitoreverolimusinrelapsedHodgkin lymphoma[J].AmJHematol,2010,85(5):320-324, RizzieriDA,FeldmanE,DiPersioJF,eta1.Aphase2 clinicaltria1ofdeforolimus(AP23573,MK一8669),anovel mammaliantargetofrapamycininhibitor,inpatientswith relapsedorrefractoryhematologicmalignancies[J].Clin CancerRes,2008,14(9):2756—2762. [8]8ChenYSmithML,SheetsM,eta1.Zotarolimus,anovel sirolimusanaloguewithpotentanti?proliferativeactivity oncoronarysmoothmusclecellsandreducedpotentialfor systemicimmunosuppression[J].JCardiovascPharmacol, 2007,49:228—235. [9]9VignotS,FaivreS,AguirreD,eta1.mTOR-targetedtherapy ofcancerwithrapamycinderivatives[J].AnnalsofOncology, 537. 2005,16:525— [10]GarciaJA,DanielpourD.Mammaliantargetofrapamycin inhibitionasatherapeuticstrategyinthemanagementof uro~cmalignancies[J].MolCancerTher,2008,7:13471354. [11]ShilpaAditiJ,JamesCKL,eta1.Effectofcombination treatmentofrapamycinandisoflavonesonmTORpathway inhumanglioblastoma(U87)cells[J].NeurochemRes, 2010,35:986—993. [12]SchweckeT,KhswLE,HaydockSeta1.Thebiosynthetic geneclusterforthepolyketideimmunosuppressant rapamycin[J】_NatlAcad,1995,92:7839-7843. [13】ShenB.PolyketidebiosynthesisbeyondthetypeI,IIand IIIpolyketidesynthaseparadigms[J].CurrOpinChemBiol, 2003.7:285—295. 【14]SattelyES,FischbachMA,WalshCT.Totalbiosynthesis: /nvitroreconstitutionofpolyketideandnonribosomal peptidepathways[J].NatProdRep,2008,25:757—793. [15]PaivaNL,RobertsMF,DemainAL.Thecyclohexane moietyofrapamycinisderivedfromshikimicacid[J].JInd Microbiol,1993,12:423—428. [16]PhilipASL,PeterFL,JamesS,eta1.Thenatureofthe starterunitfortherapamycinpolyketidesynthase[J].Angew chemIntEdEngl,1996,35:2249—2251. [17]SandeepH,WilkinsonB,BarrieW,eta1.Originand truenatureofthestarterunitfortherapamycinpolyketide synthase[J].AngewChem,2001,113:799—780. [18】PaivaNL,DemainAL,RobertsMF.Incorporationofacetate, propionate,andmethionineintorapamycinbyStreptomyces hygroscopicus[J].JNatProd,1991,54(1):167—177. [t9]ChanYA,PodevelsAM,KevanyBM,eta1.Biosynthesis ofpolyketidesynthaseextenderunits[J].NatProdRep, 2009,26:90-114. [20]MoSJ,BanYH,ParkJ,?’eta1.EnhancedFK506production inStreptomycesclavuligerusCKD1119byengineeringthe supplyofmethylmalonyl?CoAprecursor[J].JIndMicrobiol Biotechnol,2009,36:1473.1482. ? 雷帕霉素及其衍生物开发现状,作用机制及生物合成研究进展李进 等813 [21】ChenYL,KrolJ,HuangWM,eta1.DCO2on—line measurementusedinrapamycinfed—batchfermentation progress[J].ProcessBiochem,2008,43(4):351-355. [22】ChengYR,FangA,DemainAL.Effectofaminoacidson rapamycinbiosynthesisbyStreptomyceshygroscopicus[J]. ApplMicrobiolBiotechnol,1995,43:1096-1098. [23】MolnfirI,AparicioJF,HaydockSF,eta1.Organisationof thebiosyntheticgeneclusterforrapamycininStreptomyces hygroscopicus:Analysisofgenesflankingthepolyketide synthase[J].Gene,1996,169(1):1-7. [24]KhawlE,MetcalfeS,LeadlayPF,eta1.Mutational biosynthesisofnovelrapamycinsbyastrainofStreptomyces hygroscopicusNRRL5491disruptedinrapL,encodinga pumtivelysinecyclodeaminase[J].JBacteriol,1998,180(4): 809.814. [25】SchweckT,StauntonJ,LeadlayPeta1.Thepipecolate- incorporatingenzymeforthebiosynthesisoftheimmuno- suppressantrapamycin[J].EurJBiochem,1997,247:526—534. 【26]ChallisGL,NaismithJH.Structuralaspectsofnon-ribosomal peptidebiosynthesis[J].CurrOpinStrucBiol,2004,14: 748.756. [27】GregoryMA,GaisserS,WilkinsonB,eta1.Isolationand haracterizationofpre—rapamycin.thefirstmacrocyclic intermediateinthebiosynthesisoftheimmunosuppressant rapamycinbyhygroscopicus[J].AngewChemIntEd. 2004,43:2551—2553. [28】GregoryMA,LillRE,GaisserS,eta1.Rapamycin biosynthesis:Elucidationofgeneproductfunction[J].Org 日iomolChem.2006.4:3565.3568. [29]GrazianiEI.Recentadvancesinthechemistry,biosynthesis andpharmacologyofrapamycinanalogs[J].NatProdRep, 2009,26:602-609. [30】CoatesN,ChallisI,GregoryM,eta1.RolesofrapHand rapGinpositiveregulationofrapamycinbiosynthesisin Streptomyceshygroscopicus[J].JBacteriol,2007,189(13): 4756—4763. [31]KirschningA,TaftKnoblochTotalsynthesisapproaches tonaturalproductderivativesbasedonthecombination ofchemicalsynthesisandmetabolicengineering[J].Org BiomolChem,2007,5:3245-3259. [32]LowdenPAS,StauntonJ,MetcalfeS,eta1.Newrapamycin derivativesbyprecursor—directedbiosynthesis[J].Chem BioChem,2004,5:535-538. (33]RitaccoFGrazianiEI,CarterGeta1.Productionofnovel rapamycinanalogsbyprecursor-directedbiosynthesis[J].Appl EnvironMicrobiol,2005,71(4):1971—1976. [34]GregoryMA,PetkovicH,LillRE,eta1.Mutasynthesisof rapamycinanaloguesthroughthemanipIulationofagene governingstarterunitbiosynthesis[J].AngewChem,2005, 117(30):4835-4838. [35】XiyangC,PeilianW,Limeieta1.Generationofhigh—yield rapamycin-?producingstrainsthroughprotoplasts?-related techniques[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2009,83:507-512. 【36】ZhuXC,ZhangWjChenXY’eta1.Generationofhigh rapamycinproducingstrainviarationalmetabolicpassway— basedmutagenesisandfurthertiterimprovementwithfed- batchbioprocessoptimization[J].BiotechnolBioeng,2010, 107(3):506-515.