琥珀酸脱氢酶的提取与活力测定的研究进展_1205

琥珀酸脱氢酶的提取与活力测定的研究进展_1205 琥珀酸脱氢酶的提取与活力测定的研究进展 【摘要】 琥珀酸脱氢酶是线粒体的一种标志酶，是连接氧化磷酸化与 电子传递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能 的呼吸链提供电子，其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度的指 标。本文从琥珀酸脱氢酶的提取、纯化及活性检测等几方面介绍了 琥珀酸脱氢酶的研究进展情况。 【关键词】 琥珀酸脱氢酶 线粒体 三羧酸循环 琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase，简称SDH），黄素酶类，是线粒体内膜的结合酶，属膜结合酶，是连接氧化磷酸化与电子传 递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸 链提供电子，为线粒体的一种标志酶。作为参与三羧酸循环的关键酶， 琥珀酸脱氢酶是反映线粒体功能的标志酶（marker enzyme）之一，其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度的指标[1]，对于评价精子线粒体功能、研究致奶牛酮缺乏症病理过程等具有重要意义[2～3]。 本文从琥珀酸脱氢酶的提取、纯化、性质及其测定方法等几方 面回顾并介绍了琥珀酸脱氢酶的研究进展情况。 1 琥珀酸脱氢酶的提取与生理意义 琥珀酸脱氢酶存在于所有有氧呼吸细胞，和线粒体膜牢固结 合，是三羧酸循环中唯一与内膜结合的酶，是脱氢酶中最重要的酶。迄 今为止，已从多种原核和真核组织中分离纯化出这种酶，为该酶的酶学 研究奠定了基础。作为膜内酶，琥珀酸脱氢酶与具有脂双层结构的线粒 体膜结合得比较紧密，很难溶解下来，而且其一旦离开膜后，暴露在空 气中会很快失活，因此其提纯难度很大。1950年我国著名生物化学家王应睐、邹承鲁、汪静英等开展对膜蛋白琥珀酸脱氢酶的研究，经过反 复实验最后以正丁醇抽提法成功地把琥珀酸脱氢酶从鼠肝组织线粒体膜 上溶解下来，得到了高纯度的水溶性琥珀酸脱氢酶，其活力比同期国外 报道者高出1倍以上，从而奠定了我国在琥珀酸脱氢酶研究领域的领先 地位[4]。其后，Davis等（1971、1977）使用NaClO4从牛心线粒体溶解下此酶[5～6]；Tsukaho Hattori和Tadashi Asahi（1982）选用离子型去垢剂脱氧胆酸钠从番薯根线粒体提取SDH[7]；Suraveratum等（2000）对恶性疟原虫的琥珀酸脱氢酶进行了纯化[8]；夏玉凤等（2000）以玉米黄化苗为生物材料，通过差速离心获得线粒体，使用超 声波将其破碎，用2%Triton X-100溶膜，超速离心，硫酸铵沉淀， DEAE-C32层析纯化琥珀酸脱氢酶[9]；辛明秀等（2004）用常规酶学方法从嗜冷酵母（Y18）中分离纯化出有催化活性的琥珀酸脱氢酶[10]。 琥珀酸脱氢酶是直接连在电子传递链上的，氢受体是FAD而不是NAD＋，它使琥珀酸氧化为延胡索酸过程中所产生的FADH2与酶结合，将来自FADH2的两个电子直接传递给酶的Fe3＋[11～12]。现有研究明，琥珀酸脱氢酶由α、β两个亚基组成，α亚基相对分子质量为 70.0×103，含有FAD和两个铁硫簇；β亚基相对分子质量为27.0×103，含有一个铁硫簇[13～14]。 2 琥珀酸脱氢酶的常用测定方法 琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种。 2.1 硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法[15～16] 琥珀酸脱氢酶能通过 一系列人工电子受体，如与PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐），DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等发生反应催化琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜 色变化，通过分光光度计检测即可加以定量反映，其反应式为：? Succinate＋PMS?Fumarate＋PMSH2；?PMSH2＋DCPIP?PMS＋DCPIPH2。DCPIP呈蓝色，标准的吸收光谱在600nm处，这种色泽可因 其还原而渐次变淡，从而600nm处的光密度的变化与DCPIP含量成正比，测定2.6-DPIP的还原速度可以推算出SDH的活力。一分子DCPIP被还原，即代表一分子琥珀酸被氧化。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化，来计算SDH的活性。SDH活性计算：（标准－测定） /标准=μmol/min/mg。 2.2 铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法 以铁氰化钾[K3Fe（CN）6] 和琥珀酸钠为底物，使琥珀酸脱氢酶催化反应将铁氰化钾还原为亚铁氰 化钾[K4Fe（CN）6]，K4Fe（CN）6再与Fe3＋作用生成普鲁士蓝，在 700nm波长测定吸光值，以检测普鲁士蓝之生成量，作为琥珀酸脱氢酶 的还原力，吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活力愈强。 2.3 TTC（氯化三苯四氮唑）法 无色TTC（2，3，5-氯化三苯基四唑）作为人造受氢体，它在细胞呼吸过程中接受氢，还原成三苯基甲 膳（TF）。后者以红色晶体的形式存在于细胞内，采用有机溶剂（如甲 苯、乙酸乙醋、三氯甲烷、丙酮或乙醇等）进行萃取。萃取液测定 485nm吸光度后，以TTC还原量表示脱氢酶活性，根据标准曲线计算TF生成量，进而求出TTC-脱氢酶活性。 2.4 MTT法 MTT是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱 氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下生成蓝色（或蓝紫 色）不溶于水的甲臜（Formazana），经异丙醇作用颗粒溶解显色。在 通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度570nm处OD值推测出活细胞的数目。 2.5 NBT（氯化硝基四氮唑蓝）法[17] NBT易溶于水，呈淡黄色，以NBT为受氢体，接受由琥珀酸钠盐被酶作用而脱下的氢，进而形 成紫蓝色的沉淀，于反应体系中加入PMS，混匀，37?保温30min，之后加入TCA终止反应。加异丙醇溶解显色，混匀，即可于548nm测OD值。：30min内548nm下OD值为1.0时的酶量为1个活力单位。比活力=活力单位数/毫克蛋白。 【参考文献】 [1] 李勤报，梁厚果．轻度水分胁迫的小麦幼苗中与呼吸有关的几种酶活性变化[J]．植物生理学报，1988，14（3）：217～222． [2] 薛小萍，商学军，傅健，等．精子线粒体琥珀酸脱氢酶的检测及意 义[J]．中华男科学，2003，9（8）：601～603． [3] 柴春彦，刘国艳，石发庆．铜缺乏奶牛琥珀酸脱氢酶的组化特征 [J]．中国兽医杂志，2002，38（2）：5～7． [4] 王应睐同志生平介绍-李伯良同志在王应睐教授遗体告别仪式上的 悼词[R]．生命的化学，2001，21（3）：176～177． [5] Davis K A,Hatefi Y.Succinate dehydrogenase 1 purification,molecular properties and substructure[J]．Biochemistry 1971，10（13）：2509～2516． [6] Davis K A,Hatefi Y,Cravford I P.Purification,molecular properties and amino acid composition of the subunits of Rhodospirillom rubrum succinate dehydrogenase[J]．Archives of Biochemistry and Biophysics,1977，180：459～464． [7] Tsukaho Hattori,Tadashia sahi.The presense ot two torms of succinate dehydrogenase in sweet potato root mitochondria[J]．Plant Cell Physiol,1982，23（3）：515～523． [8] 郑春福．恶性疟原虫琥珀酸脱氢酶的纯化及其生化特征[J]．国外医学寄生虫病分册，2000，27（6）：270～271． [9] 夏玉凤，孙新立，冯小燕，等．琥珀酸脱氢酶的纯化研究[J]．河北师范大学学报，2000，24（4）：519～521． [10] 辛明秀，周培瑾．冷活性琥珀酸脱氢酶的特性[J]．北京师范大学学报，2004，40（1）：108～113． [11] Stryer L.Biochemistry[M]．Beijing:Pekin Univ Press,1992． [12] 母昌考，王春琳，丁爱侠．口虾蛄琥珀酸脱氢酶（SDH）同工酶的组织特异性研究[J]．自然杂志，2003，25（3）：143～145． [13] 王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学[M]．北京：高等教育出版 社，2002，9． [14] 辛明秀，周培瑾．冷活性琥珀酸脱氢酶的特性[J]．北京师范大学学报，2004，40（1）：108～113． [15] J.H.Cherry．植物分子生物学实验指导[J]．科学出版社，1979． [16] 周家声，尤伟，刘义．蜂胶醇提物对大鼠肝脏线粒体氧自由基损 伤的保护作用[J]．锦州医学院学报，2005，26（5）：5～7． [17] Ikuko Ezawa,Etsuro Ogata．Ca2+-Induced activaton of succinate dehydrogenase and the regulation of mitochon-drial oxidative reactions[J].Biochem,197985：64～74． 声明：版权归原作者所有，如果侵犯了你的版权，请第一时间和我联 系，我将立刻做出处理！！！