金龙胆草SRAP银染反应体系的建立与优化

金龙胆草SRAP银染反应体系的建立与优化 121 广东农业科学2014年第1期 金龙胆草SRAP银染反应体系的建立与优化 刘 惠1姗1上，高玉莲1，孙 蓉1，唐自钟1，高静雷1，陈 (1。四川农业大学生命科学与理学院，四川雅安625014; J2(攀枝花学院生物与化学工程学院，l匹l JI攀枝花 617000) 摘 要:建立适宜金龙胆草DNA的SRAP—PCR扩增体系，为金龙胆草分子标记打下基础。针对常规银染方法从 是否固定、银染液组成、银染时间、显影液组成等方面优化了金龙胆草SRAP扩增产物的检测方法(同时探索了金 胆草SRAP—PCR反应程序，并对金龙胆草SRAP—PCR反应体系的各影响因子进行优化。结果建立了一个银染龙 步骤40 快速、高效的银染检查方法，筛选的退火温度为51(3?，最佳SRAP—PCR反应体系(15?L)为:DNA ng，引物浓 度 0(7 0(25 U，10xbuffer p(mol,L，dNTPs mmol,L，M矿mmol1(9 ,L，物聚合酶0(6 2斗L，双蒸水补足。该程序和体系能很 好地满足金龙胆草基因组SRAP扩增的要求，SRAP标记应用于金龙胆草遗传研究是可行 关键词:金龙胆草;SRAP;PCR体系优化 的。 中图分类号:$567(23+9 文献标识码:A 文章编号:1004—874X(2014)01—0121—06 Establishment and of SRAP silver-stained optimization reaction of brink Lrvl( Conyza HutlLIU Shanl乞GAO Yu-lianl，SUN Ron91，TANG Zi-zhon91，GAO Jing-leil，CHEN and Science，Sichuan (1(College ofBiology Agricultural University,Yaan 625014,China;and Chemical 2(Department ofBiological 617000,China) Engineering,Panzhihua University,Panzhihua DNA of Abstract:To establish SRAP—PCR blinii Kvl(and the foundation Conyza appropriate amplification system lay for the molecular markers of C blinii Lrvl(four factors of the silver—stained were whether optimized(including fixed(dye and of research also the SRAP-PCR reaction and time staining composition recipe(silver developer(This explored process the of C blinii various factors(The results showed that the of SRAP— amplification system by annealing temperature optimized SRAP—PCR PCR reaction was the as follows:DNA 40 51(3?，and optimum system(15斗L)was 0(7[山molprogram ng，primer 2 o(25 0(6 and were suitable IJ'dNTPs U，10xbuffer , mmol,L,M酽+1(mmol9 ,L,扎叼polymerase program HL’rhe system for silver-stained and were in C blinii L6v1(with SRAP marker( analysis applicable blinii Key words:Conyza Ikvl(;SRAP;PCR system optimization blinii 系统，由美国加州大学蔬菜作物系Li等于2001年金龙胆草为菊科白酒草属植物苦蒿(Conyza L6v1()的干燥地上部分，主要产于四JII攀西地区以及云 出[31，主要是对ORFs进行扩增(提高了扩增结果与提 现 南中、南部，贵州部分地区，具有清热化痰、止咳平喘、 型的相关性，既克服了RAPD重复性差的缺点，又克服 解毒利湿、凉血止血的功效，近年研究发现其具有一定 了AFLP技术复杂、成本昂贵的缺点，具有简便、稳定、 的抗肿瘤活性【11。金龙胆草已收录于中国药典2010年 产率高、便于克隆目标片段的特点141，对于研究基础较 薄弱的作物尤为适用。银染是SRAP标记常用的产版一部[21及《四JlI省药品》。目前该植物的系统研究 时间较短，涉及到种内遗传关系及遗传多样性等方面 检测方法。成本较高，耗时较长。本研究首次对金物 龙胆 的研究还不深入。 草基因组SRAP分析，并进行反应体系建立与优化，以 期建立经济适用的SRAP反应体系，为开展金龙胆草相关序列扩增多态性(sequence—related amplified 分子遗传研究工作提供基础。polymorphism，SRAP)是一种新型的基于PCR的标记 收稿日期:2013—08—05 l与方 法基金项目:四川I省科技创新苗子工程项目(2012ZZ046);攀 枝 花学院校级科研项目(2012YB03) 1(1试验材料 作者简介:刘姗(1980一)，女，在读博士生，讲师，E-mail:chuan 金龙胆草植物18个样品于2011年7月由攀 枝花 万方数据non92010@126(COB 米易县金龙胆草人工种植基地种植农户协助采集(表 通讯作者:陈惠(1962一)，女，博士，教授，E—mail:chenhui@ 122 农业大学生命科学与理学院丁春邦教授鉴定为菊科白 1(2试验方法 blinii 1(2(DNA1 提取利用改良的SDS方法[5_q进行金龙L6v1(1。PCR反应所用的 酒草属金龙胆草(Conyza 草基因组DNA的提取(并以hDNA,HindlII为胆 试剂购自天根生化科技f北京1有限公司(引物由英潍捷 Maker， 基(上海)贸易有限公司合成，Tirs—base、丙烯酰胺、甲 用l,的琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子量，用核酸 白仪(Bio—Rad公司)测定DNA浓度和蛋白质残蛋 叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TMED均为美国Amresco公 司生产，其他生化试剂均为分析纯。 1(2(2引物设计及筛选引物设计参照Han等同提供留。 的 表1供试金龙胆草材料 引物序列，以5个正向引物与6个反向引物随机配 组合成30对引物，如表2所示。SRAP—PCR扩增程对 序号 材料采集地 供试方式 在参考Li等【3】的方法(即94?预变性5 min;94?变性1 序 min，35?复性1 rain，72?延伸90 S，5个循环;94? 性1 变 rain，50?复性l rain，72?延伸90 S，35个循 环， 最后72?延伸10 min，4。C保存)基础上对第2 中的复性温度设置不同的温度进行优化。为确次循环 保试验 的可靠性，以每对引物重复两次检验为最后依 据。 1(2(3退火温度优化退火温度为引物和模板结合时候 的温度参数，是影响PCR特异性的较重要因素。在理想 状态下，退火温度足够低，可以保证引物与目的序列有 效退火;同时还要足够高，才能减少非特异性结合。本 研究在1(2(2所列反应程序基础上，利用PCR仪 (Bio— Rad公司S1000)在40,60?之间进行梯度筛 确定大范围下的最佳温度，再进行最佳温度选，首先 的细化考 察，以确定适宜金龙胆草的SRAP—PCR退火 温度。 1(2(4银染检测体系的优化PCR反应结束后。银染 步 骤参考赵永芳【8】和王晓丽等[91的方法，并配制浓度为 8, 非变性聚丙烯凝胶以供检测。针对金龙胆草样品 对银 表2试验所用SRAP引物的序 列 染过程中是否需要固定脱色(固定液为1,冰醋酸、 个参数优化:每反应含模板DNA量分别为40、50、60、 的10,无水乙醇，固定30 min)、银染液组成(考察0(1, 70、80 ng;每反应引物浓度分别为0(5、0(6、0(7、0(8、0(9 Ixmol,L;每反应dNTPs终浓度分别为0(05、0(1、0(15、 硝酸银溶液中是否需要加入03,甲醛)、银染时间 (10 rain或30 min)、显影液组成(2,Na:CO，，0(3,甲 0(2、0(25 mmol,L;每反应M矿浓度分别为1(5、1(7、 1(9、 000 醛，2 2(1、2(3 mmol,L;每反应彻DNA聚合酶的用量分别mg,LNa2S203?5H20;或1(2,无水NaOH，每1 mL溶液加1 mL甲醛)等110-11]进行试验优化，并用数码 为0(2、0(3、0(4、0(U。扩增产物用5、0(6 1(2(4优化后的 相机对凝胶进行照相，以确定最佳效果的银染条件。 银染检测方法凝胶成像(并观察拍照。 1(2(PCR5 反应体系的优化在15 uL反应体系中包 2结果与分析10 reaction mmol,0(19 含2?L xTaq Buffer，dNTPs mmol,L，引物l U， 2(1基因组DNA的提取 L，Mgz+2 p。mol,L，Taq聚合酶1 模板40 使用改良的SDS法提取基因组DNA，电泳检测ng，ddH:O补足。以此体系为基础，按以下顺序 万方数据逐级优化反应参数，选择优化出的最佳参数进行下一 示DNA条带清晰，没有拖尾现象(图1)，检测所显 得 123 OD—OD2{;0为1(91，表明DNA提取质量较高，可以用 于 SRAP反应体系。 2(2引物筛选 将30对引物组合，每对重复1次试 验进行SRAP— PCR扩增，结果见图2。筛选出12对扩增产物稳定、多 M:Marker:l,5:DNA态性丰富的引物用于后续遗传多样性分析(表3)，其中 图1金龙胆草基因组DNA电泳结 果 M:Marker:l一30:引物组合号(见表3) 图2不同 引物组合的SRAP扩增谱带电泳结果 表3 SRAP引物筛选结果 注:“、,”表示扩增产物稳定、多态性丰富的引物。 M l 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 8 选取组合1和7即mel+eml和me2+eml进行后续体 6 7 8 系优化检验。 2(3退火温度优化结果 40。60?退火温度下的扩增效果见图3。图3左 为 第一轮试验，1,8的退火温度依次为40、41(2、43(9、 47(7、 52(6、56(5、58(8、60?，可以看出47(7,56(5?时条带较清 晰稳定。在此基础上，进一步对退火温度进行优化。图 3右为45,55?下的梯度PCR反应结果，1,8的退火 温 度依次为45、45(6、47、48(9、51(3、53(3、54(4、55?，可以 看出，退火温度为51(3。C时条带最多、最清晰稳定，引 物二聚体也较少。故最终确定金龙胆草SRAP—PCR 应程序的退火温度为51(3。C。 反 2(4银染检测体系优化结果图3退火温度筛查试验结 果rain与未进行该 从图4可见(添加固定液固定30 步骤的最终银染效果没有太大区别。为试验方便与节 约验时只用0(1,硝酸银溶液染色。银染时间的试验结果 成本，银染过程不用固定液固定脱色。考察了两种银 (图6)显示，只需银染10 min即可达到很好的染色效 效染液的染色效果，结果(图5)表明，两种银染液的染色 果，时间长了反而使背景发黑，不利于后续研究;显影 果差别不大，但加入甲醛会使得背景偏深，故后续试 液试验结果(图7)显示，适合金龙胆草SRAP分子标记 万方数据 124 NaOH+IIi醛Na!CO汁甲醛+Na:S:03(5H10 未同定脱色 固定脱色 ’ 1 2 l 2 l 2 图7不同显1:引物组合1扩增结果:2:引物组合7扩增结果 I幻5,俐7同 图4银染过程固定脱色效果影液的染色效果对比 000 mL的最佳显影液组成为1(2,的无水NaOH，每1 溶液加l mL甲醛。末添加甲醛 添加O(3,甲醛 l 2 1 22(5 PCR反应体系优化结果 对15肛L的PCR反应体系中五大要素进行 筛查，结果见图8,图12。试验结果显示，DNA用量 模板用量 为40、60 ng时扩增条带效果较好，随着用量增多，多攥赣誊 羹?熏。 羹器I遴瓣孽遵。:羹蓄? _ 态性反而有所下降，从节约角度出发，最佳模板用量定 羹 j鲞0(羹熏菱( 羹誓基孽爹黼il_ 为40 ng(图8)。在所筛选的引物用量范围中，引物浓 度变化对最终扩增效果影响较小，从条带清晰度的角 度考虑，最佳用量定为0(7 Ixmol,L(图9)。dNTPs是 蠢麓 PCR扩增反应的原料(必须达到一定浓度才能满足 PCR扩增需求，从试验结果(图10)来看，当dNTPs 为 0(25 mmol,L时试验效果最佳。而M92+浓度在1(9、 2(1mmol,L时效果都较好，本着节约的目的最终选取 图5不同银染液组成的染色效果对比 浓度为1(9 mmol,L(图11);砌聚合酶用量少易导致 银染10min 银染30min l l 2 2 M:Mal’ker: 1,5分别表，J:1)NA模板用量为40、60、70、80、 90rig图6不同银染时间的染色效果对比 图8不同DNA模板用量的PCR扩增结果 万方数据 125 M 1 2 3 4 5DNA新链合成效率下降(扩增产物较少。而较高浓度的 砌酶则造成药品浪费，且易导致非特异性扩增，综合 各因素考虑，本研究的最佳酶量定为0(6 U(图 12)。 2(6最佳条件验证试验结果 为检测所确立的金龙胆 草SRAP—PCR银染反应优 化体系的稳定和可靠性，利用该优化体系对本试验室 保存的18份采自不同地区【6】的金龙胆草进行了扩增 (图13)，选用的引物组合1和14进行DNA扩增， 很好的扩增效果，各个泳道上扩增主带清晰，条均有 带数目 多，多态性好，无杂带与拖尾，背景无干扰，由此 可见反 应体系稳定可靠，适用于金龙胆草资源的 标记分析。 SRAP分子 M:Ma J(ker: M 1 2 3 4 1,5分别表示Mg:+的浓度为l，5、1(7、1(9、2(1、2(3mmol,L 图11 不同Mg“浓度下的PCR扩增结 果 M 1 2 3 4 5 M:Marker: 1,5分别表示引物浓度为0(5、0(6、0(7、0(8、0(91虬mol, L 图9不同引物浓度的PCR扩增结果 M:Maiker; 1,5分)J JJ表_;T(q酶的用量为O(2、0(3、0(4、0(5、 0(6U 图12不同Taq酶用量下的PCR扩增结 果 M 1 2 3 4 5 赫 二v w辫 B ^ A:引物组合1在18个居群的扩增结果 B:引物组合 图13优化的SRAP—14在18个居群的扩增结果 不同样品中的检测PCR银染反应体系在金龙胆草 结果 3讨论 金龙胆草具有较高的综合利用价值，其发展潜力 M:Marker;被越来越多的研究者所重视，因此，有必要开展其遗传mmol,L 1,5分别表示dN7rPs的浓度为O(05、0(1、0(15、O(2、0(25 基础研究。以奠定其遗传育种及品质改良工作的基础。 图10不同dNTPs条件下的PCR扩增结果 万方数据 126 物中的用途『P1，中国专利:CNl01933964A，2011一01—由于不同物种基因组DNA的差异，前人研究报道的试 [2]卫生部药典委员会(中华人民共和国药典(一部)【M](北京:中 验方法并非就适应一个新的物种。本试验针对金龙胆 05( 国医药科技出版社。2010:201。草基因组，首次对其SRAP—PCR银染反应体系进行了 C [3]Li G，Quiros F(Sequence-related amplified polymorphism 多方面的研究，包括聚丙烯酰胺银染方法、反应引物的 new marker based on a PCR(SRAP)，a system simple 筛选、反应程序的关键步骤一退火温度、反应体系的5 and reaction:its to in application mapping gene tagging 种组分对扩增效果的影响，以期得到最佳的试验效果。Brassica[J](Theor Appl Genet，2001，103:455—461( 最终筛选了12对引物用于后续研究。银染方法优 [4]谭美莲，姜兴华，严明芳，等(蓖麻DNA的提取及SRAP反应体化为不需要固定脱色，取胶后置于摇床上(用蒸馏水水 系的建立[J](中国油料作物学报，2009，31(4):531—536洗10 min2次;加入适宜0(1,硝酸银染色液，置于摇床 [5]王珍，方宣钧(植物DNA分离[J](分子植物育种，2003，1(2):281— 288(上避光染色10 min，转速设置为40。50 r,min;而后蒸 馏水水洗2次，每次约1 min:加入适宜1(2,的无水 [6]刘姗，胡洪利，陈惠(金龙胆草基因组DNA的提取及均匀设计 000 优化RAPD反应体系[J】(中成药，2013，5(35):1006—1010( mL溶液加1 NaOH显影液(每1 mL甲醛)，在摇 [7】Ji—cheng Han，Guo-jian Liu，Rui-feng Chang(The 床上至Marker显出黄色条带时取出。蒸馏水清洗，拍 sequence—related amplified polymorphism (SRAP)markers 照。整个过程耗时短、试剂用量小、染色效果好，是适合 linked to the color around the of stone(Cs)locus peach 金龙胆草SRAP标记的银染方法，但由于数码相机拍Journal of 1—fruit[J1(African Biotechnology，2012，1 1(42):991 照光线、焦距等因素保存的图片会显得有很大色差。为9914( 了保证试验结果的准确性，最好采取直接记录条带的 [8]赵永芳，生物化学技术原理及应用[M】(第3版(北京，科学出版方法。PCR反应程序的退火温度定为51(3?(最佳 社，2004:358—38240 SRAP-PCR反应体系(15 IxL)为:DNA ng，引物浓 【9]王晓丽，苟琳(生物化学试验教程【M】(成都，四川科技出版社， 0(25 2004:78—84度0(7 p,mol,L，dNTPs mmol,L，M矿1(mmol9 ,L， [10]梁宏伟，王长忠，李忠，等(聚丙烯酰胺凝胶快速、高效银染方 Taq聚合酶0(6 U，10xbuffer 2?L，双蒸H20补足。该 法的建立[J](遗传，2008，30(10):1379—1382( 体系稳定可靠，表明SRAP分子标记适用于与金龙胆 草的遗传 [11】郭大龙，张君玉，石春梅，等(一种简便快速高效的DNA银染 多样性分析，为金龙胆草分子标记及遗传连 方法[J】(河南农业科学，2010(7):74—76(锁图谱构建奠定了基础。 参考文献:(责任编辑崔建勋) [1]苏艳芳，颜世伦，周立军，等(金龙胆草总皂苷在制备抗肿瘤药 逝颦垒避船逝逝船逝坐逝逝逝嵌鞋船逝逝逝鞋逝逝鞋—逝逝逝逝船逝嵌妇窖缸逝逝逝姑逝妇夸皓每窖始逝船妇逝窖每逝 (上接第120页) underwater flexible structures and its to theapplication 【40】Takagi T，Takashi Suzuki，et Shimizu，Katsuya a1(Validityof fishing gear system thesimulation【C](Proceedings and of“NaLA”:a net and layout configuration loading International Conference Offshore on Mechanics andArctic analysis system[J](Fisheries Reseach，2004，66:235—243(Engineering-OMAE，2004，685—690( F(Lader,Arne flexible of a [41】Pa properties Fredheim(Dynamic [46]XinfengZhang，Yuwei a1(Matrixing Li，Liming Song，et net sheet in waves and curren卜一A numerical 01 (approach network and distributed inthe simulation ofcomputing Aquacuhural Engineering，2006(35):228—238(fishing nets[J](Procedia Engineering，2012(37):79—84( T(A static of the R，Hu F，Tokai tension [42]Wan analysis [47]周成(许柳雄(张新峰，等(大型金枪鱼围网沉降性能影响因子Plane and of configuration Submerged net[J](Fisheries 的多元回归分析[J](中国水产科学，2013，20(3):672—681( science，2002(68):815-823(a1(Effects of[48】Xinfeng Zhang，Liuxiong Xu，Liming Song，et 【43】苏炜，詹杰民(水流作用下渔网养殖空间变化的计算方法[J】( inertial mass coemcient on knotless model used in netting 海洋工程，2007，25(1): 93—100(tunaMechanics and Materials purse Vols，seine[J](Applied [44】孙霄峰(尹勇(张秀风(基于物理模型的渔网网衣动态模拟与 2013(2):256—259。 可视化研究叨(大连水产学院学报，2009，24(6):555—559( C W，Lee J H，Cha B of [45】Lee J，et a1(Modeling (责任编辑 白雪娜) 万方数据