DiI荧光示踪剂在大鼠脾内肝细胞移植中的研究

DiI荧光示踪剂在大鼠脾内肝细胞移植中的研究 DiI荧光示踪剂在大鼠脾内肝细胞移植中的 研究 338?中华器官移檀盘查芏l1笠【鲞蔓?塑,』强塑!,些些!.!,v(!.1. 新鲜分离的肝细胞以PBS调定细胞浓度为4× 10/ml.受体鼠麻醉后,于中腹左侧作一07Cnl的 斜行切口,轻提脾韧带,将脾脏牵出腹腔.在直视下 用27号针头作脾实质穿刺并注入肝细胞悬液LmI, 注射时暂阻断脾蒂血流,注射后用纱布轻压针孔.以 防渗漏和出血,回置脾脏关腹. 四,取材观察 取经标记的肝细胞悬液于荧光显微镜诺丹明滤 片下进行普通光和荧光观察.在进行肝细胞移植后 第3,7,1O,14,2O,30,4O,50,60d分别处死2只大鼠, 取肝,脾,肺,心,脑,肾,胸腺组织,在4?下分别用4o g/L多聚甲醛固定6,12h,用含50g/L蔗糖的PKq 溶液保存8h,再用含3(30g/L蔗糖的PBS溶液保存8 h,然后冷冻切片将4,8的切片置于荧光显微 镜诺丹明滤片下进行荧光和普通光观察 结果 分离提取的肝细胞产率为1.6×10{{.活率为94.5 %,肝细胞纯度为95%.荧光下肝细胞显示正常形 态,?I在胞浆中均匀分布,荧光强度偏淡,普通光下 亦能显示被着色的肝细胞,胞浆呈淡玫瑰红色. 60d实验期内,不同时间段所取各脏器组织切 片观察,均见到存活的移植细胞,其形态良好;Di1 只染色胞浆,不染胞核;各脏器中均未见到区域梗塞 坏死灶.肝脏内部分Kupffer细胞现为三角形, ,J4f尖状荧光点.从脾脏迁移至肝脏的细胞沿门脉 系统分布,远离小叶中央静脉 讨论 DiI是一种亲脂性碳花青荧光染料,易嵌人生 物质膜内并在膜内作侧向扩散运动.从而标记整个 细胞Humberto等0首先发现其亦可标己肝细胞, 从肝实质中辨别出被移植的细胞.Dil进入肝细胞 后稳定,不向邻近细胞扩散,且对肝细胞无毒性.本 实验通过移植前检测,发现DiI确实能很好地标记 肝细胞,DiI在刚标记好的肝细胞内均匀分布,荧光 强度偏淡体外细胞培养观察到,48h后染料富集 于溶酶体内,从而表现出较强的颗粒状荧光点.本 组实验未用任何免疫抑制剂,实验期内各器官组织 中DiI标记的肝细胞保持了良好的形态,为细胞发 挥生理功能奠定了基础,从而在形态学上汪明脾内 肝细胞移植为一项可行的治疗手段同时,借助这 一 荧光示踪手段,我们发现植入细胞尚能迁移到朐 腺,脑,心,肾等脏器并存活,这对我们深入探讨脾内 肝细胞移植具有更深刻,广泛的提示. 脾内肝细胞移植后,如何从受体肝实质中辨别 那些从门静脉迁移而来的供体肝细胞,并观察其在 肝脏中的生存状况,一直是困扰我们的问题.我们 采取Humberto,用DiI标记肝细胞,在荧光显 微镜下能轻易地发现这些细胞,对未经染色的冷冻 切片,即使在普通光下也能观察到被染成淡玫瑰红 色的肝细胞.部分植入细胞死亡后的碎片被肝内 Kupffer细胞吞噬,呈三角形小针尖状荧光细胞.它 们的表现从另一方面反映了植入细胞的生存状况. 移植细胞在肝内分布和Piazzini等lj一所报道的一 致.基本沿门静脉系统分布至门脉周边区,很少有标 记细胞出现在小叶中央静脉周围. 本实验通过示踪组织观察,未发现有任何器官 组织因梗塞而造成坏死灶,说明移植该剂量的肝细 胞在近期内是安全的.同时我们认为,借助这种手 段能较容易找到并确定是由于植入细胞引起的梗塞 灶至于迁移至脾外其他器官的细胞是否会通过增 殖造成梗塞灶,引起并发症,需更长时间的实验观 察国内张进禄等成功地使用Dil示踪观察骨骼 肌细胞脑内移植12个月,这使我们考虑能否运用 DiI进行更长时间的肝细胞移植示踪观察;期间是 否会因细胞增殖而造成荧光衰减,我们有兴趣进行 深人研究. 通过运用DiI进行脾内肝细胞移植示踪研究, 证明DiI可作为一种新颖,简便的肝细胞标记剂,能 很好地示踪显示植入肝细胞在不同器官中的生存, 迁移和并发症情况作为一种良好的形态学方法, 可在更广泛的肝细胞移植研究领域采用.脾内肝细 胞移植为一种可行的治疗手段,在临床运用前还需 审慎深入研究 参考文葡 lRichardP.HauglandF1u.r瞵c【llpopMictraf.crIn:RichardP. HauglandJr.RichardPedsHandbooko1fl?【口mand …hhenucats.6thedOregon:Eug~Je.I996M4.350 2HllmkI10E.SorianoI’heLLofDi1-rr~ckedhepator’2,’restod? ml0rortholopic.intrahepallcerNraftreent[ollowingheparoc’dlular 【tarsiIlantationTratksplantadon,1992.54:7I7723 3APimzlniAlbani.C~anpanatiLHepat~yteinjectioningum1m1s _f]1uandspleenTranspbmtProe.1994.26:3443.3445 4张进禄.僚群渊鄞少鹏,等体外培养骨骼肌细胞脑内移植存活 的研究解剖学报.1996.277-9 (收稿日期:21/O:14/320)