小鼠骨髓中嗜多染红细胞(PCE)微核实验简介

小鼠骨髓中嗜多染红细胞(PCE)微核实验简介 小鼠骨髓中嗜多染红细胞(PCE)微核实验简介 微核(micronucleus)，与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质中，比主核小，故称微核。故微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。 实验目的 1. 学习和掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核测定方法 2. 了解细胞染色体损伤情况，掌握检测断裂剂和部分非整倍体致突 变剂的测定方法 3. 进一步熟练制片和镜检操作 器材与试剂 1. 器材 手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、载玻片、玻璃染色缸、定时钟、晾片架、显微镜(带油镜)、注射器及针头、干净纱布、乳头吸管、玻璃铅笔、电吹风机 2. 试剂 甲醇、Giemsa储备液、磷酸盐缓冲液(PH6.8)环磷酰胺 操作步骤 1. 试验动物及处理 (1) 动物选择:一般选用大小鼠，小鼠最常用，18-20g，每组10只， 雌雄各半。 (2) 染毒途径:根据研究目的或受试物性质不同，原则上可尽量采 用人类接触受试物的途径:通常采用灌胃法和腹腔注射。 (3) 染毒次数:多次染毒法(每天染毒一次，连续4天，第五天取 样)或两次染毒法(处死前30h+处死前6h) (4) 剂量及对照选择 据受试物的LD，以1/2LD为最高剂量组，5050 下设3-4个剂量组。同时设立阳性(环磷酰胺)和阴性对照(溶 剂组) 2. 骨髓细胞制片和涂片:最后一次染毒后，在确定时间脱颈椎处死 动物，迅速剪取其胸骨，剔去肌肉，用干净纱布擦拭，剪去每节 骨骺端，用小型弯止血钳挤出骨髓液，点在载玻片一端预先滴好 的一滴小牛血清中。混匀后推片。长度为2-3cm。 3. 固定:将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇固定15min,取 出晾干。 4. 染色:Giemsa应用液染色15min.冲洗染色液，晾干。 5. 观察计数:先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分布均匀、疏密 适度、形态完整、染色良好的区域，再在油镜下按一定顺序进行 PCE和微核计数。PCE细胞呈灰蓝色、成熟红细胞呈橘黄色。微 核多数为圆形，边缘整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫 色。PCE细胞中微核多为一个，也可有两个或以上微核，此时仍 按有微核的PCE计算。 计算微核率即1000个细胞中含微核的PCE数。同时考虑200个细胞中PCE与NCE的比值。(可作为细胞毒性指标:0.6-1.2正常;<0.1表明PCE形成收到严重抑制;<0.05受试物剂量过大，结果不可靠) 结果评价 1. 结果指标为微核率 2. 评价:微核实验阳性的两个判断标准为:微核率有明显的剂量反 应关系;至少在某一剂量能显示出可重复的并与对照组比较具有 统计学意义的阳性反应。 注意事项 1. 防止小牛血清污染 2. 胸骨须擦拭干净，以免影响结果。 3. 涂片不要过厚或过薄。 4. 选择分布均匀、疏密适度、形态完整、染色好的区域镜检。由 低倍镜到高倍镜，并按一定顺序镜检。 5. 注意微核与颗粒异物的区分，PCE与其他骨髓细胞不同阶段血 细胞区分。