谷氨酰胺转氨酶对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响（可编辑）

谷氨酰胺转氨酶对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响（可编辑） 谷氨酰胺转氨酶对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的 影响 浙江工商大学 硕士学位论文 谷氨酰胺转氨酶对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响 姓名:徐辉 申请学位级别:硕士 专业:农产品加工及贮藏工程 指导教师:励建荣;熊春华 20070601浙江工商大学硕士研究生学位论文 谷氨酰胺转氨酶对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响 摘要 肉制品的质地在很大程度上依赖于肌原纤维蛋白凝胶的性质。由 于秘鲁鱿鱼 肌肉含有能分解腑球蛋白的高活性的蛋白酶,所以其凝胶形成能 力很弱。本文研 究的目的就是通过添加谷氨酰胺转氨酶提高秘鲁鱿鱼肌原纤维 蛋白的 凝胶特性。 我们研究了‰催化凝胶形成的条件,包括’的浓度、作用温度、 作 用时间和。同时运用聚丙烯酰胺凝胶和环境扫描电子显微镜手段姐改善 凝胶特性的机理进行了探索。最后应用响应面法,将的浓度、作用温度、 作用时间三个因素结合起来从整体上动态揭示各因素之间的相互关系及对凝胶 特性的影响,并确定提高凝胶特性的优化条件。以期为秘鲁鱿鱼鱼糜制品 和重组制品的生产提供理论基础和应用指导。实验结果明: .浓度对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶的硬度和弹性有显著影响 .。酶浓度为%时,凝胶硬度达到最大值。酶浓度为.%时,凝胶弹性达 到最大值。从电泳图谱中看出,随着酶浓度的增加,肌球蛋白重链带 和副肌球蛋白带强度都减小。从环境扫描电镜发现,随着酶浓度的增加, 凝胶形成的三维网络结构更致密、均匀。 ..作用时间对凝胶硬度和弹性有显著影响.。作用时间 小时凝胶硬度达到最大值。 弹性只在最初半个小时显著增加,其余时间无显著 变化。随着作用时间的延长,带和带强度都减小,凝胶形成的三维 网 络结构更致密、均匀。 .作用温度对凝胶硬度和弹性有显著影响.。两者变化规律 一致,?达到最大值,在~?时显著增加,~时显著减小。 带和带强度的变化与凝胶质构特性的变化相一致。微观结构上,?形成 的凝胶结构多孔性和均一性较好,和?形成的凝胶结构粗糙,多孔性差.浙江工商大学硕士研究生学位论文 .对凝胶硬度和弹性有显著影响.。硬度和弹性都在.达 到最大值,升高或降低都使硬度和弹性急剧下降。实验结果进一步论证 带和带强度与凝胶质构特性具有相关性。微观结构上,.和.差异 不明显。.失去了网络结构。 .通过响应面法对酶提高秘鲁鱿鱼凝胶特性的作用条件进行了优化, 对于硬度响应值,各因素的优化条件为:酶浓度为.叮%;作用温度为.?; 作用时间为.。相应的硬度为.。对于弹性响应值,各因素的优化条件为: 酶浓度为.《/%;作用温度为.;作用时间为.。相应的弹性为.。 关键词;秘鲁鱿鱼,肌原纤维,谷氨酰胺转氨酶,凝胶特性,响应面法 ?浙江工商大学硪士研究生学位论文 霸匝, ~?巳】 ?;?..... , ,.,. 讹 .珏 : ... %..%.时 .... .地眦??浙江工商大学硕士研究生学位论文 加 珈 . .把呻翱地 《..~?, ?, ~?. . 扛 ?, 哆 锄如妫呜 .. 嘲 .. .. 日 ..皿 . .. 拄 .. .慨. .% 。? .?、娜. . .%. .. .? 辑? . .? : ,百嬲,,, , 浙江工商大学硕士研究生学位论文 缩略词表 英文缩写 英文全称 中文译名肌动蛋白方差分析 过硫酸铵 册 三磷酸腺苷 牛血清白蛋白 , ,廿 环境扫描电子显微镜 姗 肌球蛋白重链’ 微生物谷氨酰胺转氨酶 聚丙烯酰胺凝胶电泳 佃 副肌球蛋白响应面法 十二烷基磺酸钠 三氯乙酸 暇 四甲基二乙胺 ,,’, 谷氨酰胺转氨酶 ,.? 三羟甲基氨基甲烷 浙江工商大学硕士研究生学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果.尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含本人为获得浙江工商大学或其 它教育机构的学位或证书面使用过的。与我一同工作的同志对本研究所做 的任何贡献均已在论文中作了明确的并表示谢意. 日期:。年占月‖日 签名:鱼:重翌 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文 的规定:浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文,并且本人电子文档的内容和纸质论文的内 容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 日期:可年叻日浙江工商大学硕士研究生学位论文 言 第一章引 第一节秘鲁鱿鱼资源概况 鱿鱼是枪乌贼和柔鱼俗称,属于软体动物门,头足纲 ,广泛分布于大西洋、印度洋及太平洋海域‘】囡。据?渔业年 鉴统计翻,世界鱿鱼等头足类渔获量逐年增加,鱿鱼渔获量占世界总渔获量的比 重也随渔钓业的迅速发展而呈不断上升趋势。除了资源丰富以外,头足类具有成 熟时间短、生长速度快的特点,因此,是当今世界海洋生物种最具有开发潜力的 渔业资源之一 鱿鱼具有较显著的品种特征:个体大、胴体长,肉质、颜色、风味与鲍鱼类 似,被称为“穷人的鲍鱼’’。鱿鱼营养丰富,高蛋白低脂肪,胴体部分约占体重的 %,头足部分约占体重的%,故鱿鱼可食部分达%以上,比一般鱼类高出 %左右,是良好的水产品加工原料。鱿鱼富含蛋白质及人体所需的多种氨基酸, 且必需氨基酸组成接近全蛋蛋白,是一种营养保健型且风味良好的水产品资源, 且含有丰富的钙、磷、铁元素,对骨骼发育和造血十分有益,可预防贫血。鱿鱼 内脏中含油量极高,而且含有大量高度不饱和脂肪酸,可从鱿鱼心脏中提取% 左右的二十碳五烯酸,及二十二碳六烯酸。、有增加大 脑功能,提高记忆力,.防止大脑衰老的功效。研究表明,水产品提取物中鱿鱼提 取物的抗氧化能力最强,同样在人体内则表现为抗衰老作用。经常食用鱿鱼,具 有很好的滋补作用,特别对腰肌劳损、风湿腰痛、产后体弱等有一定的疗效,另 外还有预防心脏病、高血压、脑血管疾病的作用。我国中医同样认为,鱿鱼有滋 阴养胃、补虚润肤的功能。 秘鲁鱿鱼是茎柔鱼 的俗称,又称美洲大鱿鱼、巨鱿鱼。 英文名称为 。属软体动物门、头足纲、二鳃亚纲、枪形目、开 眼亚目、柔鱼科、柔鱼亚科、茎柔鱼属。秘鲁鱿鱼为高度洄游的大洋性浅海种, 体形较大,在秘鲁海域发现胴体长度主要在范围内,不过个别的 胴体可达。该鱿鱼成长迅速,其寿命大都一年左右,分布集中在东部太 平洋,北至加利福尼亚湾,南至智利中部的智利群岛,其中在秘鲁海域分布尤为 集中。秘鲁鱿鱼是迄今为止发现的个体最大资源最丰富的鱿鱼种类之一嗍嘲。茎浙江工商大学硕士研究生学位论文 柔鱼渔业起始于年,但是大规模开发利用始于二十世纪年代中期,主要 由日本和韩围等国家的鱿钓船所捕捞。我国鱿钓船于年开始在秘鲁外海作 , 业,到年在该海域生产的鱿钓船达到余艘,渔获产量超过× 约占我国鱿钓总产量的%以上,已经成为我国鱿钓船的重要捕捞对象嘲。 但我们国家对秘鲁鱿鱼及其加工后的废弃物的利用还只是处于初级阶段,加 工的技术含量较低。目前,我国鱿鱼的加工制品有十余种,产品有鱿鱼千、珍珠 鱿鱼干、鱿鱼丝、鱿鱼卷、鱿鱼丁、鱿鱼条、鱿鱼片、鱿鱼筒、鱿鱼丸子、冷冻 鱿鱼糜、调味煮熟品、鱿鱼罐头、烤鱿鱼等产品。日本的鱿鱼产量约占世界产量 一半,也是吃鱿鱼最多的国家,对鱿鱼的利用方式也及富变化,有生鲜消费生 吃、炒菜、沙拉等和加工品消费鱿鱼丝、调味鱿鱼片、熏制品等。目前对 鱿鱼的研究多集中在副产物的综合利用技术上,如王建中等】利用鱿鱼内脏自身 酶水解内脏及其它废弃物,开发出价廉的鱿鱼油、内脏水解液,并成功地低成本 解决从水解液中去除镉的难题。王海明等嘲以鱿鱼精巢组织中提取的核蛋白为 主要成分制成精核蛋白提取物,利用功能学评价实验方法对提取物进行抗疲芳、 抗氧化以及免疫调节实验。 第二节肌原纤维蛋白凝胶特性的研究进展 肌原纤维蛋白叫瓶嘶是以肌球蛋白和肌动蛋白为主体组成的可支撑肌 肉运动的结构蛋白质,它是一类具有重要生物学功能的结构蛋白质群,占鱼类总 蛋白质的%~%,是水产食品加工中主要的研究利用对象凹。其作用除了参 与肌肉的收缩外,还与肉制品的流变学特性如黏结性、保水性、弹性、质地等有 着密切的关系‘螂。肌原纤维蛋白的热诱导凝胶对肉制品的结构特性起主要作用 】。因此通过对肌原纤维蛋白凝胶特性的研究可以对肉制品的加工特性有更 深层次的理解。 肌原纤维蛋白中的几种重要蛋白质如肌球蛋白、肌动蛋白和肌动球蛋白的凝 胶机理已较清列】【】【司。肌球蛋白是形成凝胶必不可少的因素,单独条件下 可形成好的凝胶。其它的肌原纤维蛋白如肌动蛋白、调节蛋白和细胞骨骼蛋白不 形成凝胶,但是对肌肉蛋白形成的凝胶的粘弹特性具有重要的影 响。 早在年【】指出,蛋白质凝胶的形成机理分两步。第一步是蛋白质 浙江工商大学硕士研究生学位论文 受热而变性展开;第二步是展开的蛋白质基团因聚合作用而形成较 大分子的凝胶体 。蛋白质分子的解聚和伸展,使反应基团暴露出来,特 别是球蛋白的疏水基团,有利于蛋白质之间的相互作用。因此分子量大且琉水氨 基酸含量高的蛋白质容易形成稳定的网络结构。凝胶结构及其物理化学性质取决 于变性和聚集的相对速率,蛋白质聚集速度相对展开的速率慢,这有利于形成更 细致的凝胶网络。当蛋白质聚集的速率高于展开的速率时,就形成粗糙、无序的 凝胶结构或凝结物【司。 对于鱼类肌肉来说,许多学者对其凝胶的形成过程及机理进行过更多的研 究。现在普遍认为鱼类肌原纤维蛋白形成凝胶过程主要经过个阶段,即凝胶化 、凝胶劣化和鱼糕化个阶段。 凝胶化通常指在?以前,肌球蛋白和肌动蛋白分子形成一个较松散的网状 结构,由溶胶变成凝胶,凝胶化程度主要取决于鱼的种类【刎。鱼类肌原纤维蛋白在 左右放置.高温,低于下放置低温可发生 凝胶化而形成,低温下凝胶化称为是由于鱼肉本身所含有的谷氨 酰胺转氨酶催化作用下使分子内产生极强的共价键的结果【”。而高温则 与肌原纤维蛋白流变特性的转变有关阎。肌球蛋自在肌原纤维蛋白形成的三维网 状结构中起主导作用。学者【矧认为肌球蛋白凝胶形成机制:加热使肌球 蛋白失去非共价键稳定的昏螺旋,然后分子间相互结合,从而形成刚性的蛋白网 络结构,该结构由共价二硫键和其它非共价键相互作用稳定。等发现肌球 蛋白形成的凝胶其强度比肌原纤维蛋白形成的凝胶强度高,他还认为凝胶的形成 应首先起自肌球蛋白.部分,也就是先由部分肽链解螺旋,然后不同 肌球蛋白中的部分发生链接形成 ,然后 再由不同肌球蛋白的凝集成大的蛋白质颗粒,并进一步形成网络 结 构。其过程如下图所示。浙江工商大学硕士研究生学位论文 跏 ,??、一 . ?坤 ??州?川” ””‘? ? 洲口? ‘.洲? ? ,口, ?童胡始阶段柏联结 联结成鞭台况琏 鼽肄置办分子 艏包帆球辑妇热凝嗣承意黼 磁时如瑚雌粕缸蜘耐蠡?口瑚嗽?露忡‰村黼”?虹 嘲等则将肌球蛋白的作用归于其超螺旋尾部的变性。将肌 球蛋自按一定速度由?加热到,肌球蛋白中的超螺旋?中尾部肽链 解离发生变性,这种解螺旋是持续进行的。解螺旋后的肌球蛋白按一定顺序排列, 并连接在一起,逐渐扩大成大的三维立体风络结构,随着尾部螺旋解开的程度逐 渐增大,凝胶的弹性也越来越大。如时,肌球蛋白分子中有%的 存在,而在?时仅有%的所以后者形成的凝胶要比前者强的多。但 如果采用恒定的高温如不是由低温到高温的持续加热,则大量解开螺旋的 肌球蛋白会无序结合成大小不等的“蛋白核”,使网络的形成不均匀,从而使凝胶 弹性增大变得困难。在凝胶开始阶段,首先发生球蛋白的变性,这种变性包括蛋 白质构型或构相的改变以及肽链的解离,第二个阶段是发生变性的蛋白质发生相 互连接加这种连接是随意的,则只能形成蛋白质颗粒,只有按一定方式排列并连 接起来的变性蛋白质才能形成有弹性的凝胶体。 口唰研究表明肌动球蛋白和肌球蛋白在?的凝胶过程中,肌球蛋白头 部的二硫键起了重要的作用。等研究认为在冷冻过程中鱼肉的肌球蛋白、 原肌球蛋白、肌动蛋白和肌原蛋白发生凝集变性,这种变性与热变性不同,主要 是由于氧化作用而形成了疏水基团、亲水基团和离子基团,并在蛋白分子、游离 氨基酸、脂肪酸之间形成共价键,特别是活性疏基被氧化成二硫键。台湾学者对 在鱼糜中加入还原剂、氧化剂的作用进行了研究。他们认为疏基有序地氧化成二 硫键对鱼糜胶凝作用巨大,随后他们对经冷冻储藏后鳍鱼和鲐鱼 的蛋白进行了研究,发现二硫键对经冷冻储藏鱼糜凝胶的形成及其强度起着非常 浙江工商大学硬士研究生学位论文 重要的作用。 在鱼糜中存在的肌原纤维蛋白与白蛋白对凝胶也起着一定的作用。但肌原纤 维蛋白、白蛋白与肌球蛋白相比,凝胶温度高,凝胶强度低。肌球蛋白在? 就已发生凝胶化,肌原纤维蛋白必须加热到。,最大凝胶化发生在?以上。 白蛋白初始凝胶的温度要达到?,到?以上达到最大.它们达到最大时,凝 胶强度分别达到肌球蛋白的/~/。如果人为加大肌原纤维蛋白与白蛋白的浓 度,使其与肌球蛋白发生连接,则得到凝胶的强度要大得多网。 总之,肌球蛋白在鱼糜的凝胶化过程中起着关键的作用,此夕硫键、肌球 蛋白与自蛋白、肌球蛋白与纤维蛋白原及其它蛋白的连接也对鱼糜的凝胶化起到 了一定的作用例。 当鱼肉蛋白质凝胶化后,升高温度至‘左右,在‘温度带时,凝胶分 裂形成断裂的网状结构,出现凝胶劣化现象口。凝胶劣化一般是由于内源性组织 蛋白酶类引起肌球蛋白的分解洲。因此,对肌原纤维蛋白凝胶或鱼糜制品进行加 热时应该使其缓慢通过?以下温度区以促进凝胶化,并迅速通过。凝胶 劣化区,以尽量避免凝胶劣化,同时还应当加入酶抑制剂抑制蛋白酶的活性,从 而赋予产品有良好的弹性。 鱼类蛋白酶存在于鱼肉的肌纤维、细胞质及细胞外结缔组织的胞外基质中。 大多数蛋白酶为溶酶体酶和细胞质酶,另有一些存在于肌浆中并与肌纤维或巨噬 细胞外层相连。蛋白水解酶可降解蛋白质,破坏凝胶结构。组织分解后,酶主要 分布在肌浆蛋白中。它们的活性受特定的内源抑制剂、激活剂、及环境温度 的影响。酶活性在鱼种之间差异极大,而且随捕获季节、性成熟、产卵及其他因 素的变化而变化嘲。内源性组织蛋白酶类通常分为两类:组织蛋白酶类 和热稳定碱性蛋白酶。 组织蛋白酶为溶酶体蛋白酶,溶酶体中约有种组织蛋白酶在蛋白质的体 内转化和死后流变特性变化中起主要作用。其中组织蛋白酶、、、、、 已从鱼贝类中纯化并鉴定出来。鱼糜加工过程中,内源组织蛋白酶、、 活性的变化与鱼种有关。鳕鱼肌肉中蛋白酶活性在鱼糜加工过程中逐渐下 降,而在鲭鱼鱼糜中,经漂洗处理,还有%的组织蛋白酶、和活性 刚。在水解肌原纤维蛋白时,组织蛋白酶的活性高于组织蛋白酶。组织蛋 白酶被认为是大马哈鱼肌肉软化或太平洋鳕鱼鱼糜降解的主要蛋白酶。由于组浙江工商大学硕士研究生学位论文 织蛋白酶、、是溶酶体蛋白酶,溶酶体周围的、温度及离子强度会 影响这些蛋白酶向肌浆的释放。因此,鱼死后的状况和鱼糜加工工艺会影响鱼糜 中这些蛋白酶的存留,也会影响到鱼糜制品的凝胶强度。 虽然不同的鱼体内酶的种类、来源及含量差异极大,但大多数鱼中都含有热 稳定蛋白酶。这类酶使肌原纤维蛋白形成的凝胶网络结构解体,形成浆状而非质 地坚实的凝胶。这些酶在~时最活跃。尽管大多热稳定蛋白酶是水溶性蛋 白酶,但是漂洗工艺不能完全消除鱼糜中热稳定蛋白酶活性。这表明酶可能与肌 原纤维蛋白相结合,有时甚至是紧密连接在肌原纤维蛋白上,不易通过漂洗除去。 / 碱性蛋白酶位于肌肉组织的肥大细胞中,易与骨骼蛋白如肌动蛋白和肌球蛋白相 互作用。而且许多碱性蛋白酶对热稳定且在鱼肉的范围内活跃,因而对鱼糜 品质影响更大】。碱性蛋白酶有一些相似特性:最适范围窄...,最适 温度?,?以下?以上观察不到活性,分子量较高等。 若再升高温度凝胶变成有序和非透明状,肌球蛋白和肌动蛋白形成的网络结 ? 构被固定住,把加入的辅料及水分包裹在里面,鱼糜制品的凝胶强度则明显加大, 从而最后完成鱼糕化形成鱼糕。 第三节谷氨酰胺转氨酶的应用研究 一、谷氨酰胺转氨酶概况 ...又称转谷氨酰胺酶, 谷氨酰胺转氨酶,简玎 是一种催化蛋白质或多肽链中赖氨酸上的 .氨基和谷氨酰胺残基上的卜酰胺基之 间的结合反应,通过转酰基作用而形成谷氨酰基赖氨酸共价结合键。从 而改交蛋白质的结构和功能性质,所以在食品、纺织和医药工业显示出广泛的应 用前景,特别是在食品工业中,在改良食品物性和粘合力上有惊人的效果,赋予 食品蛋白质以特有的质构和口感,并可以提高其营养价值。被认为是用于生产新 型蛋白食品的最重要的酶种之一,引起了国为研究者的高度重视和兴趣. 近年来无论在发达国家还是发展中国家对于新型食品的研究开发都非常重 视。人们不但要吃饱,而且更加注重食品的口感、风味和营养。传统食品越来越 难以满足人们的口味和营养需求。新型食品的研制与开发是目前急前言需解决的 浙江工商大学硕士研究生学位论文 问题,利用先进的加工手段,开发出优质的新型食品,是加速我国食品行业发展 的有效途径。谷氨酰胺转氨酶作为一种新型的食品添加剂,在食品加工中的作用 日益显著。 二、谷氨酰胺转氨酶的来源和性质 谷氨酰胺转氨酶广泛存在于于哺乳动物的各种组织器官如肝脏、毛囊、表 皮、前列腺、血液以及鱼、植物和微生物中。在机体多种生化反应及生命代谢 过程中发挥着重婺作用嘲【删。 年,等人首次在动植物组织中发现并通过离子交换、过滤、 层析等分离纯化过程得到了酶活提高了倍的样品,但动物肝来源稀有,分离 纯化工艺复杂,价格昂贵,热稳定性差,未能在实际生产中广泛应用【】。年代 末。等人利用微生物发酵法生产获得成功,并生产出纯化了倍的 .。与动物来源的谷氨酰胺转氨酶相比,微生物法生产的酶其作用、温 度、底物专一性具有较广的范围表.,且生产成本低,产酶周期短,发酵产物 单纯,制得的酶制剂亦价格低廉,从而大大促进了其在食品工业上的应用,可以 说微生物来源的谷氨酰胺转氨酶的发现为其应用打开了一条更为广阔的可行之 路。 到目前为止,以其廉价的成本及独特优势引起了国内研究人员的高度 重视,而且有一些在菌种筛选吴介文等、发酵条件优化删嘲阐郑 美英等及酶的应用四江波等方面的报道,但基本上是处于实验室水平 的研究阶段。江苏泰兴新鑫医药辅料有限公司与无锡轻工大学合作,利用微生物 /,最高达到/,达到国际最高酶活 发酵生产,产酶水平达到, 水平,所生产的己经在国内广泛使用。 不同来源的谷氨酰胺转氨酶的性质也有所不同表。微生物发酵产生的 微生物谷氨酰胺转氨酶较动物来源的谷氨酰胺转氨酶有许多优点,主要 为;适应范围广、不依赖、稳定性强、催化交联程度高,另外微生物谷氨 酰胺转氨酶属于胞外酶,提取时不需要破壁,易于分离纯化。 浙江工商大学硕士研究生学位论文 ? ? ?吖 ? 最适值 髟 钙 奶奶 ?? 最适反应温度? 一四 值稳定范围 一 勰 ?? % 、温度?残存活々% 弱 舄舄 ? 温度残存活力% 删舢 分子量 羹薹 蝴 删糯糯霎 ?删矧嬲 一 蟠蟠 等电点 蛐 蛐蛐 帖 修 姗啪 啪椭 。 残存活力% 啪, 姗, 蚴蚴 硼啪 ” ‘残存活力% , :: 残存活力% 啪, 瑚 啪啪 椭 谷氨酰胺转氨酶的催化机理 谷氨酰胺转氨酶是一种催化酰基转移反应的转移酶,根据酰基受体不同,可 以催化以下三种类型的反应,催化反应如图?所示”; 催化蛋白质以及肽键中谷氨酰胺残基的.羧酰胺基和伯胺之间的酰氨基转移 反应图?,利用该反应可以将一些限制性氨基酸引入蛋白质以提高其营养价 值,以弥补加工过程中流失或损坏的必需氨基酸。 当蛋白质中赖氨酸残基的 .氨基作为酰基受体时,形成蛋白质分子内或分子间 的 奸谷氨酰基.赖氨酸共价键图,使蛋白质分子发生交联,从而改变食品 的质构,改善蛋白质的溶解性、起泡性、乳化性等许多物理性质。利用该反应还 可以将不同蛋白质通立结合成大分子,从而开发新蛋白食品如模拟蟹螯、 模拟虾等。加工中碎肉的处理即是利用此原理。 当不存在伯胺时,水会成为酰基受体,其结果是谷氨酰胺残基脱 去氨基生成 谷氨酸残基图,该反应可用于改变蛋白质的等电点及溶解度。 浙扛工商大学硕士研究生学位论文一眦琏一驯一一玛一??托一强 隅 ?一 一~ 邑一 一 一 强 一墅芷一?地 一???哆一? 一? 一? 珏 皂一妣聃堂. 隅?, 一一 图 酶催化的反应机理 四、谷氨酰胺转氨酶在食品中的应用 年.月日本味之素公司开发了以谷氨酰胺转氨酶为主体的食品用酶制剂 。和’.三个品种,产品投放市场后年在日本销售额即达亿 日元,位于淀粉酶之后,排名第二。目前,谷氨酰胺转氨酶己应用到肉制品、鱼 肉制品、乳制品、植物蛋白制品等多种食品中【】跚。 .在畜肉制品中的应用 肌球蛋白和肌动蛋白是肌肉的重要组成成分,是谷氨酰胺转氨酶 作用的良好 底物。经鹤的催化,肌肉蛋白分子间形成致密的三维网状结构,显著提高了 产品的质构,改善了肉制品的品质,增加了产品的附加值。 等人在年就开始使用谷氨酰胺转氨酶生产重组肉制品,他们 将碎牛肉、碎猪肉和其它原料包括谷氨酰胺转氨酶、面粉、奶粉、品质改良剂等, 混合,成型,放入耐压容器内杀菌。可用此方法生产汉堡包、肉丸、烧卖等。 江波等曾就谷氨酰胺转氨酶对火腿肠凝胶性质的影响进行过研究。通过实 验发现添加谷氨酰胺转氨酶后火腿肠组织的凝胶破坏力比对照组提高了,凝 胶强度比对照组提高了%。经扫描电子显微镜观察,发现形成了致密的三维网 一.浙江工商大学硬士研究生学位论文 状结构。 吕心泉等曾用谷氨酰胺转氨酶对重组牛肉生产牛肉干进行了研究,他采用 碎牛肉为主要原料,配以各种辅料,添加谷氨酰胺转氨酶,经过多次试验,优化 工艺配方,研制出了一种色泽、口感、风味均被人们接受的重组 牛肉干. 用谷氨酰胺转氨酶交联的蛋白质还可以用作脂肪替代物,生产低脂肉制品。 公司使用交联酪蛋白凝胶作为脂肪替代物,应用到色拉米肠中代替了% 的脂肪。用谷氨酰胺转氨酶处理可提高肉制品的颜色。将血红蛋白交联后,可作 , 为抗氧化剂在肉制品中应用嘲。.在乳制品中的应用 谷氨酰胺转氨酶在乳品工业中也有较为广泛的应用。乳制品中的酪蛋白、乳 清蛋白、乳球蛋白等是谷氨酰胺转氨酶作用的良好底物。经过谷氨酰胺转氨酶改 性后的酪蛋白,在功能性质方面得到显著增强,是优良的食品添加剂。 经过谷氨酰胺转氨酶处理后,使乳清蛋白与酪蛋白交联在一起,可以提高奶 酪的产量。乳清蛋白经过谷氨酰胺转氨酶处理后,可作为可食性涂膜、包装材料, 提高产品外观及保质期【】。 在奶粉生产中,加入谷氨酰胺转氨酶可提高酪蛋白的玻璃化温度,有效防止 奶粉的结块。经过谷氨酰胺转氨酶处理过的脱脂乳粉,由于乳蛋白分子间形成了 性质稳定的共价键,在水溶液中形成的凝胶强度比未经处理的乳粉形成的凝胶强 度大,凝胶的持水性、耐热性、耐酸性增强。用这种脱脂乳粉生产酸奶,乳清析 出显著减少,酸奶的稳定性更好【】。 .在植物蛋白制品中的应用 等人在年首先使用谷氨酰胺转氨酶处理焙烤食品,他们发现 在和面过程中添加谷氨酰胺转氨酶可以提高面团稳定性和面块的体积。用谷氨酰 . 胺转氨酶处理弱筋小麦面粉同样可以带得体积大、组织结构好的面包。 谷氨酰胺转氨酶可以减少方便面的吸油率,从而减少了方便面的热量,同时 减少了油的消耗量。在面条的生产中加入谷氨酰胺转氨酶,可明显提高面条的口 感及质地,使其表面粘度下降,蒸煮时不易粘连【】. 在大豆制品加工中,的嘲等研制了一种耐保存的麻婆豆腐。将豆浆与葡萄 糖酸内酷、谷氨酰胺转氨酶混合,?保温一个小时,?杀菌,从而 制成产浙江工商大学硖士研究生学位论文 品。这种麻婆豆腐在?保存六个月后仍保持良好的口感、质地与风味。 .在鱼制品中的应用 在国外,谷氨酰胺转氨酶已广泛应用于鱼糜生产中,能显著提高鱼糜制品的 凝胶强度,增加低值鱼的附加值。 学者嘲报道了‰对阿拉斯加鳕鱼鱼糜凝胶弹性的影响,发现添加 的效果明显优于不添加的鱼糜。 酬等曾将从&,印硼泖,比缸肠如忌舢抛中提取的谷氨酰胺转 、氨酶用于碎鱼肉的重组,结果表明谷氨酰胺转氨酶可催化肌球蛋白重链的交联, 并增加鲭鱼糜的凝胶强度。 等在鱼糜生产中添加谷氨酰胺转氨酶以研究其提高凝胶 强度的状况。结果表明在鱼糜生产中加入谷氨酰胺转氨酶,由于形成了丫谷氨 酰基.赖氨酸的交联结构,使鱼糜的凝胶强度提高。 眦嘲等曾对谷氨酰胺转氨酶、还原剂和蛋白酶抑制剂对带鱼鱼糜品质的 综合影响进行了研究。结果表明微生物谷氨酰胺转氨酶能催化肌动蛋白长链的聚 合并增加带鱼鱼糜的凝胶形成能力。 日本学者唧报道了微生物谷氨酰胺转氨酶对日本鱿鱼肌肉热 凝胶的影响,发现加了后通过二段式加热方式能极大提高凝胶弹性。又研 究了加入和淀粉对鱿鱼肌肉热凝胶的影响,发现凝胶在粘性和肌球蛋白交 联程度都与单一加/时差不多,但在质构特性上比单一加/时脆性大, 弹性低。 浙江工商大学硕士研究生学位论文 第四节立题背景和研究意义 目前,由于海洋渔业资源的衰退,世界各国的渔业生产都存在着经济鱼类逐 年减少,而秘鲁鱿鱼等低值鱼产量逐年增多的问题。因此,低值鱼类深加工与综 合利用新技术的研究与开发,已引起世界各国的重视。 鱼糜加工作为鱼肉蛋白质最典型的加工方法,在我国具有悠久的历史。目前 鱼糜制品已成为国际市场较受欢迎的产品,也是水产加工的主要发展方向。以秘 鲁鱿鱼为原料加工鱼糜制品不失为提高其利用价值一条可行的途径。但是由于秘 鲁鱿鱼肌肉富含多种蛋白酶、水分含量高、低,造成秘鲁鱿鱼肌 肉的凝胶形 成能力弱、凝胶强度低,难以生产出令消费者满意的鱼糜制品和重组制品。如何 提高秘鲁鱿鱼肌肉的凝胶形成能力是目前开发秘鲁鱿鱼鱼糜制品、提高秘鲁鱿鱼 加工深度所需解决的首要问题。 谷氨酰胺转氨酶作为一种天然的、.新型的食品添加剂,可使蛋白质.蛋白质、 蛋白质.氨基酸之间发生交联反应,形成 .丫谷氨酰基一赖氨酸共价结合键,在改 良食品物性和粘合力上有惊人的效果,引起了国内外研究者的高度重视和兴趣。 我们以秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白为研究对象它的性质直接决定了肌肉凝胶的性 质,尝试通过添加改善秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白的凝胶特性。以期为秘鲁 鱿鱼鱼糜制品和重组制品的生产提供理论基础和应用指导。预计该课题研究成果 应用到企业进行产业化生产后,增值潜力巨大。对于促进我国水产加工技术进步, 提升水产加工行业的技术水平,提高产品附加值,提高渔民经济收入,具有重大 , 的现实意义。浙江工商大学硕士研究生学位论文 第五节创新点 、本课题是国内首次以秘鲁鱿鱼为研究对象,研究其肌原纤维的凝胶特性,为 利用和开发秘鲁鱿鱼这一资源提供了一条可行的道路。 、运用聚丙烯酰胺凝胶和环境扫描电子显微镜手段对秘鲁鱿鱼肌原纤维凝胶形 成的机理进行了探索。从实验结果中推断头足类生物特有的副肌球蛋白也参 与了凝胶的形成,补充和完善鱼糜凝胶的形成机理。 浙江工商大学硕士研究生学位论文 第二章谷氨酰胺转氨酶对秘鲁鱿鱼肌原纤维 蛋白凝胶特性的影响 前言 近年来,由于海洋捕捞过度,主要经济鱼类严重枯萎,生产鱼糜及其制品的 传统原料在数量和质量上不断下降,因此各国都在寻找鱼糜加工的新原料。秘鲁 鱿鱼由于其肌肉白度高、脂肪含量少、产量丰富,作为生产鱼糜产品的原材料有 着天生的优势,?但其体内含有一种特殊的金属蛋白酶,会降解肌 球蛋白重链 ,使鱿鱼肌肉形成不了有较高弹性的凝胶。 谷氨酰胺转氨酶融简称鲳...可使蛋白质一蛋白 质、蛋白质一氨基酸之间发生交联反应,形成“卜谷氨酰赖氨酸键【醯】,是一种有 效的鱼糜弹性增强剂。国内中在海水鱼糜中的应用进行了较多的研究 ”,但对勰在鱿鱼肌肉凝胶中的研究则鲜有报道。 本章主要研究了两块内容,一块是催化秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶形 成的条件,包抑?的浓度、作用温度、作用时间和对凝胶特性的影响,为 获得有效的秘鲁鱿鱼蛋白凝胶提供一些参考数据。探讨了改善凝胶质构的 机理,即通过催化凝胶体系中形成交联键,形成致密的三维网络结构来反 映其凝胶特性嗍嗍,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳和环境扫描电子显微镜手段从蛋 白质组成和微观结构上得到证实。另外一块是通过响应面法对酶提高秘鲁鱿 鱼凝胶特性的作用条件进行了优化,用对实验数据进行了回归分析,建立了 。 相应的回归模型,得到优化的作用条件。 第一节材料与设备 一、原料鱼 秘鲁鱿鱼在秘鲁海域捕获,冷冻贮藏三个月,样品重量。 浙江工商大学硕士研究生学位论文 二、实验试剂 . 型谷氨酰胺转氨酶.? 泰州一鸣精细化工有限公司 牛血清白蛋白 生工生物工程上海有限公司 三磷酸腺苷 生工生物工程上海有限公司 聚醇辛基苯基醚 生工生物工程上海有限公司 三羟甲基氨基甲烷憾 十二烷基硫酸钠 、 / 丙烯酰胺 ?,?’.甲叉双丙烯酰胺 过硫酸铵 四甲基二乙胺豇强也 甘氨酸 氯化钾 杭州汇普化工有限公司 氯化钠 杭州汇普化工有限公司 氯化钙 杭州汇普化工有限公司 抗坏血酸 杭州汇普化工有限公司 磷酸二氢钾 杭州汇普化工有限公司 盐酸 浙江永进化工有限公司 三氯乙酸 如皋市金陵试剂厂 三、实验设备 环境扫描电子显微镜 荷兰飞利浦公司电泳系统 美国 质构仪 英国 砌 匀浆机 德国?队 .超纯水机 密理博中国有限公司超低温冰箱 美国 高速冷冻离心机 德国浙江工商大学硕士研究生学位论文 制冰机 美国 匕 计 梅特勒.托利多仪器上海有限公司 上海精科天平 电子天平 紫外分光光度计 浙江省科器公司 真空干燥箱 上海森信仪器有限公司 电热恒温水槽 上海精宏设备有限公司 第二节实验方法 一、肌原纤维蛋白的提取 和珂的方法,略做了改 肌原纤维蛋白的制备参考 动。在半解冻秘鲁鱿鱼胴体背部和腹部取等量的肌肉,混合后用 搅拌机搅碎。称 取鱼肉加入倍的., ..缓冲液液和倍的 %,. , .缓冲液液。用匀浆机匀 浆转速为,每匀浆停,重复次,整个匀浆过程混合液置于冰浴 中。将匀浆液用一层纱布过滤以除去结缔组织,滤液通过冷冻离 心机离心?, ,,去上清。沉淀用倍液悬浮,离心次条件同上。得到的沉 淀于?温度下保存。 实验流程如下图.所示 图提取肌原纤维蛋白的流程浙江工商大学硕士研究生学位论文 二、蛋白质浓度的测定 采用双缩脲法耵司测定蛋白质浓度,牛血清白蛋白作为标准蛋 白。 一双缩脲试剂的配制 称取.克硫酸铜.和.克酒石酸钾钠., 用毫升水溶解,在搅拌下加入毫升%溶液,用水稀释到升, 贮存于塑料瓶中或棕色瓶中。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有 黑色沉淀出 现,则需要重新配制。 二标准曲线的制作 取支干试管分成两组,按下表平行操作: 表蛋白标准曲线的制作 取两组测定的值的平均值,即为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,绘 制标准曲线。 三、肌原纤维蛋白凝胶的制备 肌原纤维蛋白制备同上一章。肌原纤维蛋白蛋白质浓度/从 超低温冰箱取出先放置于?冰箱内小时,待蛋白质解冻完全后称 于 小烧杯内,加入%的氯化钠以及一定量的,置于一定温度的水浴保温,取 出后放置于?冰箱内过夜,测定凝胶硬度、弹性和保水性,同时进行 和环境扫描电子显微镜观察。 四、凝胶硬度和弹性的测定 应用质构仪的琵枷 四测定凝胶硬度和弹性。是模仿 浙江工商大学硕士研究生学位论文 食品质地的感官评价而开发的力学测试方法,由在年定义质构参数 并首先使用,主要作用是作为食品质构的感观评价和仪器分析间的桥梁。 质构测试又被称为两次咀嚼测试 主要是通过模拟人口腔的咀 嚼运动,对样品进行两次压缩,通过微机界面输出质构测试曲线,从中可以分析 质构特性参数嗍?。美国食品质地资深研究者他的论著,质地特 性参数进行了明确定义隅】嘲嘲。本试验采用的参数有: 硬度:对产品实施两次挤压实验时,第一个峰的峰值,定义为 产品的硬度,即序品发生一定程度形变时产生的最大应力,单位为; 弹性:食品两次挤压,第二次挤压所检测到的高度与第一次挤 压所检测高度的比值。 本试验测量参数设定为:探头型号;测前速度/;测试速度./, 测后速度 /;穿刺测试距离为;感应力;用质构仪自带的软件 中的.过程进行分析,计算出凝胶的硬度和弹性。 如图所示,?点纵坐标的数值为样品的硬度。/上.的值为样品 的弹性。 ~ 铂 , : / 国栅? 守, 磐; ; 妇 式//删 : ’唧?。一 ’渤蚋’ ; 魏 图典型的测试曲线浙江工商大学硕士研究生学位论文 五、? 采用.的.甘氨酸缓冲系统【蜘。 电泳标准蛋白质:肌球蛋白重链,钙调素结合蛋白, 兔磷酸化酶.,牛血清白蛋白.,兔肌动蛋白 一贮液和缓冲液配制 .丙烯酰胺单体贮液/%. 。 .丙烯酰贮.甲叉双丙烯酰胺,先用去离子水溶解,搅 拌,直到溶液变成透明,再定容至,过滤。用棕色瓶保存最多可用 ’ 天。 . .浓缩胶缓冲液贮液. , 溶解在去离子水中,用盐酸调节至.,然后定容至 . . 。保存。 . .分离胶缓冲液贮液. .溶解在去离子水中,用盐酸调节至.,然后定容至 。?保存。 . .%/十二烷基硫酸钠 溶解在适量去离子水中,轻轻搅拌,最后定容至。室温保存。 .%过硫酸铵 .过硫酸铵溶解于去离子水中。使用前新鲜配制。 .电极缓冲液. 。.%,. 将., 溶解于去离子水中,不需要调,定容 和 至。保存。使用时稀释倍。 .样品缓冲液 配成含有/./%,.%溴酚 兰,%甘油的溶液饼盯需在临用前加入.浙江工商大学硕士研究生 学位论文 二胶的配制 %分离胶 %浓缩胶 %/ . %/ . 去离子水. 去离子水 . ’ .. . . . % %.% %咀 刨巨 ” 、??;坦乜 ~ ? 三样品处建 %的溶液,用匀浆机 称取肌原纤维蛋白凝胶,加. 水浴中保温小时,使蛋白质充分溶解出来。 ,均质后在 ?然后用离心机离心,除去不溶物。取一定量的上清液:加入 样品缓冲液,煮沸~分钟。样品冷至室温后,立即使用或贮放于.?。冷却 时,从溶液中结晶析出,所以贮存样品用前需在沸水浴中加热,但反复 冻融次数不宜过多。、 四电泳 用微量进样器取的蛋白溶液约鸺蛋白质进行电泳。整个跑胶过程电 流恒定在。待溴酚蓝到达底部白色胶条处,停止电泳,整个过程需时约 。 五染色、脱色 电泳结束后将胶转移至大培养皿,加入适量染色液.%考马斯亮兰, 甲醇:冰醋酸:蒸馏水.::,在摇床上染色小时。回收染色液,加入 脱 色液甲醇: 爝:蒸馏水::,在摇床上脱色过夜,直至凝胶底色脱 尽,蛋白条带清晰可辨。 六、环境扫描电子显微镜观察 .将凝胶样品用刀片切成.的小片,放入.%的戊二醛溶液浙江工商 大学硕士研究生学位论文 在?温度下固定过夜,倒掉固定液,用.,.的磷酸缓冲液漂洗样 品三次,每次。 .用%的锇酸溶液固定样品.,倒掉固定液,用.,.的磷 酸缓冲液漂洗样品三次,每次。 .用梯度浓度包括%,%,%,%和%五个浓度的乙醇 溶液对样品进行脱水处理,每个浓度处理,再用%的乙醇处理两 次,每次。 ..用乙醇与醋酸异戊酯的混合液//处理样品,再用纯 醋酸异戊酯处理样品。 。二氧化碳临界点干燥 .真空离子溅射镀白金膜。 .处理好的样品在荷兰公司的型环境扫描电镜中观察,加速电压 为。 七、浓度对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响 分别添加%、.%、.%、.%、.%、.%和.%的于秘鲁鱿 鱼肌原纤维蛋白,先在?恒温水浴中加热小时,然后热半、时。 八、作用时间对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响 添加.%的于秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白,分别在?恒温水浴中加热 、.、、.、、和小时,然后?加热半小时。 九、作用温度对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响 添加.%的于秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白,分别在、、、和 ?恒温水浴中加热小时,然后加热半小时。 十、对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响 添加.%的于秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白,分别用的和的浙江工商大学硕士研究生学位论文 调节值为.、.、.、.和.,先在恒温水浴中加热小时, 然后加热半小时。 十一、作用秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶的晌应面分析 响应面法 ,是利用合理的试验设计,采用 多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的关系,通过对回归方程的分析来 寻求最优工艺参数,解决多变量问题的一种统计方法【研。因此广泛地应用于农业、 生物、食品、化学等领域‘】网冽。 根据的中心组合设计原理,以相关性最为密切的三个因素酶浓 度、作用时间、作用温度为自变量,以硬度和弹性为响应值。以期研究所选因素 对凝胶质构特性的综合影响。 十二统计分析 利用 .的进行方差分析,并用邓 进行检验在方差分析中有显著差异的 肯多重比较’ 变量之间的差异,差异显著性.。 第三节结果与讨论 一、肌原纤维蛋白的提取 肌原纤维蛋白中的主要功能成分是肌球蛋白,在碎肉、糜类肉制品加工中发 挥粘合、乳化、保水等功能特性,从而影响肉制品的质量。它的等电点为., 在高离子强度条件,主要以单体形式存在,在低离子强度条件下以纤丝状态存在. 我们正是利用肌球蛋白这个性质来提取肌原纤维蛋白的。采用机械匀浆的方式使 鱼肉组织细胞完全破碎,然后通过一层纱布过滤除去结缔组织。接着通过重复悬 浮沉淀的方式除去水溶性蛋自,浓缩盐溶性蛋白肌原纤维蛋白。 二、蛋白质标准曲线的制作 图是以为标准蛋白制作的曲线,曲线方程为..,相浙江工商大学 硕士研究生学位论文 关系数为.,相关性非常好,可以用来测定蛋白质浓度。 / 圈蛋白质标准曲线。 三、浓度对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影晌 一浓度对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶硬度的影响 从图.可知,在酶浓度%以下,随着酶浓度的增加,凝胶硬度显著增加 .。酶浓度为%时,凝胶硬度达到最大值,为.,是未添加 酶对照样的倍。随着酶浓度进一步增加,凝胶硬度减小,但减小程度不是很 大。通过邓肯多重分析我们可以看出,在酶浓度小于%时,各处理间的硬度彼 此都有显著差异.,酶浓度大于%时,相邻处理间的硬度没有显著差 异。 二浓度对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶弹性的影响 从图可知,随着酶浓度的增加,在~.%的范围内,凝胶弹性显著增浙江工商大学硕士研究生学位论文 加.。在.~.%的范围内,凝胶弹性差异不显著。酶浓度为.%时, 凝胶弹性达到最大值,为.,是未添加酶对照样的.倍。增加的程度没 有硬度明显。随着酶浓度迸一步增加,凝胶弹性又显著减小.。值得注 意的是,当酶浓度增加到%的浓度时,弹性值为.,比不添加酶时的弹性还 . 要低%。隐口?% 图 .浓度对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶硬度的影响 不同英文小写字母表示差异显著.,下同 曲.浙江工商大学硕士研究生学位论文/% 圈 浓度对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶弹性的影响 ?舡三浓度对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶图谱的影响 图谱表明图:当没有添加时,秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋 白凝胶清楚的看到有带,带和带强度较高。肌球蛋白重链 带强度随着酶浓度的增加迅速减弱直至消失。添加.%得到的凝胶 带隐约可见,高于此浓度得到的凝胶带消失。副肌球蛋白带强度随 着酶浓度的增加逐渐减弱。肌动蛋白带强度则无明显变化。 是参与鱼糜凝胶网络形成的一种主要蛋白。带强度的减弱或消失 表明在的催化作用下形成了 嘶.谷氨酰赖氨酸键。这与国外一些学 者研究的结果相符,他们对鲤鱼、鲐鱼和鳕鱼鱼糜添加融或嬲可促使 形成交联键,而对肌动蛋白没有什么影响嗍侈。 副肌球蛋白是头足类生物特有的蛋白质,本试验发现其条带强度随 着酶浓度的增加逐渐减弱,推断此蛋白也参与了凝胶的形成。浙征工商大学硕士研究生学位论文 图 浓度对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶图谱的影响 ~:%~.% . : : : 四砌浓度对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶微观结构的影响 图所示,朱添加酶时的凝胶形成比较松散的三维结构,凝胶内孔洞 形状和大小不规则,孔洞直径普遍在以上,表面能看到蛋白凝聚的大颗粒, 直径..。酶浓度为.%时,已经形成交联程度比较高的,表面为颗粒状 的凝胶网络结构。孔洞的大小、形状和分布比较均匀,大小在.左右。酶浓 度为%时形成的网络结构跟酶浓度.%时的结构类似,多孔性和均一性增强。 当酶浓度达到%时,结构更为致密、均匀,表面趋于平滑,没有大的 蛋白颗粒, 孔洞直径进~步缩小。浙江工商大学硕士研究生学位论文 图不同浓度的秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶扫描电镜图片坤 % ?%‘.% ?.% 综上所述,在本实验中,在浓度小于%时。随着酶浓度的增大,秘鲁 鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶的硬度和弹性均显著增大。这是因为促进了肌球蛋 白和副肌球蛋白之间形成更多的交联键,实验发现带和带强 度减弱证实了此观点。交联键的强度是氢键和疏水键的倍,这使凝胶内部的 结合力增大,从而提高了凝胶的硬度和弹性。但酶浓度进一步增大后,凝胶硬度 和弹性均不同程度降低。一方面是由于蛋白质底物浓度没有变化,过量的 不能促进更多的蛋白质分子进行交联。另外一方面,通过研究发现, 蛋白质凝胶强度的降低是由于有过量.似谷氨酰胺基赖氨酸交联的形成,从而浙江工商大学硕士研究生学位论文 破坏了热诱导蛋白网络结构形成的均匀一致性。我们从环境扫描电镜图片也可以 看出,在酶浓度过量的时候,凝胶结构的多孔性和均一性确实比低浓度时要差。 由于价格昂贵,基于对硬度和弹性指标的综合考虑和对生产成本的限制, 酶浓度在.%~%范围内较合适。 四、作用时间对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影晌 一作用时间对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶硬度的影响 从图可铺酶作用时间在~小时范围内,随着作用时间的增加, , 凝胶硬度显著增加.。作用时间小时和小时得到凝胶的硬度相比直 接加热样品酶作用时间为的硬度分别增加.%和.%。作用时间 小时凝胶硬度达到最大值,为.。酶作用时间增加到小时,样品凝胶硬度 曩:显著变化。再继续增加作用时间,凝胶硬度又显著减小.,降低到 最大值的.%。 作用时间对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶弹性的影响 如图所示,虽然酶的作用时间对样品凝胶弹性有显著性影响 .,但通过邓肯多重比较分析可以看出,除了~.小时范围内,随着作用 间的增加,凝胶弹性显著增加.,从.小时以后,相邻两个水平之 间没有显著性差异。 浙江工商大学硕士研究生学位论文 口 ? ? ? 刁 图 作用时间对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶硬度的影响话丘 图 作用时间对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶弹性的影响慨浙江工 商大学硕士研究生学位论文 三作用时间对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶图谱的影晌 如图.所示,总体上,随着作用时间的延长,带和带强度都减 弱直至消失。作用时间时的凝胶带强度较弱,.~.时几乎看不 见,作用时间进一步延长时的凝胶带消失。副肌球蛋白带变化规 律与带有对应关系,跟随着时间的延长逐渐减弱直至消失。肌动 蛋白 带强度略有下降但变化不大。 图 作用时间对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶图谱的影响 ~:~ : : : : 四作用时间对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶微观结构的影响 在?保温一段时间而直接热得到的凝胶图,其三维网络 结构并不明显,表面比较粗糙,有蛋白凝聚的颗粒,直径约.左右。 作用和得到的凝胶没有明显的差异图、,都形成结构细致、均 一的三维结构,孔径大小在.衄左右,并均匀分布在凝胶中。随着作用时间延 长至,凝胶表面失去了颗粒状的网状结构,变得均匀平滑。孔径则变得更小, 在放大,倍的照片下,几乎看不见孔洞。浙江工商大学硕士研究生学位论文 图 酶不同作用时间的秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白凝胶扫描电镜图片诅 回 . 综上所述,延长一定的作用时间有利于对蛋白质底物的充分作用,使 尽可能多的蛋白质形成 丫谷氨酰胺基赖氨酸交联键,对硬度和弹性的提高有 积极的意义。本试验中,在一定范围内随着作用时间的延长,凝胶硬度和弹性逐 渐增加,证实了这一理论。但实验表明,酶促反应的时间并非越长越好,随着作 用时间迸一步延长,凝胶硬度和弹性又会降低。可能由于所用中 含有少量 的蛋白酶水解部分底物,导致交联的程度有所降低踟。另外,作用时间过长会造 浙江工商大学硕士研究生学位论文 成凝胶变脆,这也是造成