【doc】248株念珠菌和新型隐球菌对四种抗真菌药的敏感性

【doc】248株念珠菌和新型隐球菌对四种抗真菌药的敏感性 248株念珠菌和新型隐球菌对四种抗真菌药 的敏感性 中国抗生素杂志2002年5月第"卷第5期?3O5? 空t囊号:1001.8689c20O2}05.0305~04 248株念珠菌和新型隐球菌对四种抗真菌药的敏感性 龙丰张永信李民章强强王家俊 (复旦大学华山医院,上海2ooo4o) 摘要:目的检测248株念球菌和新型隐球菌对四种抗真菌药氯康唑,两性霉索B,5一氟胞嘧啶和酮康 唑的耐药状况收集临床菌株新型隐璋菌6o株和念珠菌188株,采用NCCLSM27?A微量稀释法测定 新型隐球菌和念珠菌临床分离株对四种抗真菌药物的最低抑菌浓度(MIC)结果对l6o株白念珠菌,氟康 唑的MIC为0.06,~64v.g/ml,敏感135株(84.38%),中度敏感10椿(625%),耐药15株(9.37%);5?氟胞嘧 啶的MIC为006,16v.yml,敏感156株(97.5%),中度戢感2株(1.25%),耐药2株<l25%);两性霉素B的 MIC为006,4nd全部敏感;酮康唑的MIC为0.03,32v.g/ml,敏感93.75%,中度敏感6.25%对60株新 型隐球菌,氟康唑的MICl一~64v.g/ml,敏感35椿(58.4%),中度敏感20株(33.3%),耐药5株(8.3%);5-氟 胞嘧啶MIC025,8g/nd,敏感53株(883%),中度敏感7株(11.7%);两性霉素B的MIC为0.06,0.5ml 全部敏感;酮康唑MIC003—4m/ml全部敏感.热带念珠菌和光滑念珠菌对氟康唑耐药率分别为10%和 22.2%结论新型隐球菌和念珠菌对氯康唑的耐药率趋高,临床不容忽视. 美键词:微量稀释法;最低抑菌浓度;念珠菌属;新型隐球菌 中圈分类号:R965文棘标识码:A 真菌感染是免疫缺陷患者的重要台并症和致死原 因,是艾滋病患者常见的感染,由于各种抗肿瘤化疗 药免疫抑制剂皮质激素和广谱抗生素在临床的广泛 应用,真菌感染的发病率有逐步增高的趋势.美国院 内血液感染监测报道念珠菌感染占血液感染的10%, 是美国国内血液感染的第四位病因_lJ.美国国家感染 检测中心的数据明,1990年真菌感染的发病率是 _2].大多数真菌感染由条件致病菌 1980年前的2倍 念珠菌属和新型隐球菌引起.两性霉素B一直是治 疗深部真菌感染的有效药物,然而,其毒副反应较多, 限制了它的广泛使用.近十年来新出现的唑类药物如 氟康唑和伊曲康唑等,虽毒性较低,疗程可酌情延长 但是,长期使用易导致真菌产生耐药性.同时供临床 使用的抗真菌药物品种有限,因而尽早对引起深部真 菌感染的致病原作药物敏感性实验,对临床正确选择 治疗用药和防止耐药性的发生都有重要意义. 本文采用NCCLSM27.A徽毒稀释法对248株临床 分离念珠菌和新型隐球菌进行敏感性实验,以获得真 菌药物敏感性资料供临床用药参考. l材料与方法 1.1材料 收藕日期:2OOl一12.30.I回日期:2002—03?21 基金璃目:国家自然辩学基盎资助项目.编号:39870011. 作毫{一舟:龙丰,男.生于1965年.在读博士生.主治医师. 1.1.1标准品及贮存液制备氟康唑(FCZ),两性霉 素B(AI~1B),5-氟胞嘧啶(5.Fc)和酮康唑(KCZ)的标准 品(standardpowders)分别由上海美国辉瑞制药有限公 司,中国药科大学制药股份有限公司,上海先锋药业公 司和西安杨森制药有限公司提供.FCZ和5.Fc用无 菌蒸馏水配制成32oovg/M的贮存液,AMB和KCZ用 1%的二甲基亚砜(DMSO)配制成3200~g/的贮存 液,分装后置一70~C冰箱贮存备用. 1.1.2试验菌株188株念珠菌(包括白念珠菌160 株,热带念珠菌lO株,平滑念珠菌和光滑念珠菌各9 株)是华山医院2000年3月,2001年2月从本院住院 病人的临床标本分离得到的菌株,均经常规铙捡,芽管 实验和API.20CAUX鉴定.新型隐球菌6o株为真菌 室1999年5月一2001年2月收集的菌株,均来自脑脊 液标本,已经墨汁涂片直接镜检,咖啡酸试验,尿素酶 实验及37?生长鉴定证实. 1.1.3质控菌株质控菌株选用新型隐球菌菌株 CBS6901和3株白念珠菌菌株ATCC76615:Y09, ATCC76615:Y108和ATCC76615:Y19.其中ATCC 76615:Y09对氟康唑敏感,ATCC76615:Y108中度敏感, ATCC76615:Y19耐药. 248株念珠菌和新型隐球菌对四种抗真菌药的敏感性龙丰等 1.1.4液体培养基含RPMI164010.4g/L(美国Life Technologieslne),三氯吗啡啉丙磺酸(MOPs,Fluka) 34.53g/L.rd~NaHC03200mg,以NaOH调节pH至7.O(恒 温25?),用Minipore滤过灭菌(滤膜0.22gin),置4?冰 箱备用. 1.2方法 1.2.1菌液制备将单菌落在沙堡氏培养基上连 续移种2次,以保证其纯度和活力.用0.85%的盐水 制成菌悬液,调整浊度,经血细胞计数板计数菌浓度为 1—5x1o5菌落形成单位(CFU/m1);用RPMI1640液体 培养基稀释1000倍后,加入96孔微量板中,每孔 l0om. 1.2.2微量稀释法药敏试验按照1997年NCCLS M27.A推荐的酵母菌微量稀释法抗真菌药物敏感试验 方法进行一.抗真菌药贮存液用RPMI1640液体培养 基做倍比稀释,加入96孔微量板中,每孔100~,各种 64ptg/II1l, 药物浓度范围分别为:FCZ和5.FC0.06, AMB和KCZ为0.03,32p&/ml;加样后念珠菌置35? 湿盒孵育,新型隐球菌置28?湿盒孵育. 1.2.3结果判定分别于培养24,48,72h观察受试菌 生长情况,念珠菌于48h,隐球菌于72h读取结果.初 步判断用视觉法大致判定终点,最终用记数板读取和 计算结果.AMB以完全生长抑制为最低抑菌浓度, 5.Fc及唑类药物以80%生长抑制为最低抑菌浓度_3J. 对药物的耐药程度判断分界值参照有关文献_3 (表1). 2结果 2.160株新型隐球菌对抗真菌药物的敏感性(表2) 2.2160株白念珠菌对抗真菌药物的敏感r】生(表3) 2.328株非自念珠酋的药物敏感性(表4) 裹3160株白念珠菌对抗真菌药物的敏感性 裹428株非白念珠菌的药物敏感性(%) 2.44种抗真菌药对248株念珠菌和新型隐球菌的 MIC范围(表5) 3讨论 在过去的数十年间,人们已经运用多种实验方法 测定真菌对药物敏感性,得到了一系列的药敏数据. 然而,由于大多数方法产生的实验结果重复性差,各个 实验室问的数据无法作比较,因而,不具备对比研究价 值.随着NCCLSM27.A实验方法的出台,国外许多实 验室问开展了重复对比实验,证实该方法重复性好, 数次重复,其MIC仅波动在一个梯度内;用于临床药 裹1真菌敏感性实验临界点(/T|d)裹54种抗真菌药对248株念珠菌和新型隐球菌 抗真菌药物耐药f%)中敏(%)敏感(% 的Mm(t,g/mr) 中国抗生素杂志2002年5月第27卷第5期?307 敏监测,获得了大量的药物敏感性数据.根据测定的 真菌的药物敏感性,已经能够初步分析耐药的类型并 为一线治疗用药提供线索.然而由于国内研究开展 得较晚,运用它作为临床药物敏感性试验的研究报道 较少.本研究采用NCCLSM27.A实验方法,明确华山 医院lI缶床真菌的药物敏感性. 本文测定的白念珠菌对氟康唑的耐药率为 9.37%,与Adas报道的7.6%和Magaldi报道的 10%耐药率接近.Ma剥di采集白念珠菌来自艾滋病 人群,未经治疗的患者的白念珠菌耐药率为10%,可 能主要是天然的耐药性.经过氟康唑治疗后,从45% 的患者中分离到了对氟康唑的耐药菌株,说明药物的 选择压力对诱导白念珠菌耐药起了非常重要的作用. 本实验中自念珠菌的耐药率不低可能因为患者都有各 种各样的基础性疾病,住院期长,多半采用预防性或经 验性抗真菌化疗,药物同样能诱导产生耐药性,还可能 交叉感染了其他患者所携带耐药真菌.本研究的白念 珠菌耐药率明显高于苏逸丹的报道,事隔两年,该真 菌室的白念珠菌耐药率发生了很大的变化,说明耐药 率正在上升. 本实验的两种非白念珠菌中热带念珠菌和光滑念 珠菌对氟康唑的耐药率均高于白念珠菌和新型隐球 菌,而且平滑念珠菌的中度敏感率达4o%以上,与有 关文献报道接近L9J.热带念珠菌,光滑念珠菌和平滑 念珠菌等非白念珠菌的感染率正在上升,非白念珠菌 苗血症占真菌菌血症的45%[107,其中.光滑念珠菌为 非白念珠菌苗血症的第一位,其次为近平滑念珠菌和 热带念珠菌.Barna9J调查发现,1994年热带念珠菌中 还没有针对氟康唑的耐药株,而1998年热带念珠菌对 氟康唑的耐药率达到了25%;在这两个调查年份中, 光滑念珠苗的耐药率均高居66,7%,但剂量依赖性耐 药比率明显增高;说明热带念珠菌和光滑念珠菌耐药 率上升趋势很快.在lI缶床中对非白念珠菌产生的深部 真菌感染,应尽早傲药敏实验,获得药敏结果后,合理 调整用药. 本研究中的新型隐球菌的对氟康唑的耐药率达 8.3%,与lI缶床部分患者疗效不佳有一定的相关性.本 文测定的新型隐球菌对两性霉素B几乎全部敏感,与 文献报道相同.因此,两性霉素B是新型隐球菌引起 的深部真菌感染的有效的选用药物.但是部分患者的 MIC与临床疗效并不完全一致,这些患者的MIC处于 敏感范围但其新型隐球菌直接镜检和培养或乳凝胶凝 集实验长期阴性,有可能与两性霉索B渗入脑脊液的 浓度极低有关.仅全身给药常难以达到有效药物浓 度,因此,必要时考虑鞘内给药以提高颅内药物浓度, 并减少毒副作用. 本实验采用NCCLSM27.A方法测定两性霉素B 药敏时,判定值临界点明显,这可能与两性霉素B的 作用机制有关.两性霉素B对真菌为杀菌剂,直接作 用于细胞膜上的固醇成分,导致不可逆的膜损害和胞 内物质外蒲,使真菌细胞死亡,因而临界点很明确.唑 类药物为羊毛固醇脱甲基酶的抑制剂,低浓度时对真 菌起抑制作用,高浓度时才呈现出杀菌作用.因此,实 验中的"拖尾现象很常见,直接用肉眼观察药敏结果 时,难以获得明确的lI缶界终点,其结果可能有一个倍比 浓度的上下误差.要精确判定MIC,需要用血液计数 板计数,用80%的抑制率来计算J,方法烦琐,作为常 规检测还难以推广.近年来有文献报道氟康唑琼脂扩 散法'和氧化比色法[简单省时,与M27一A的符合 率达90%以上,值得探讨. 参考文献 [1]PfallerMA.JonesRN,MesSA,a/.Nail0nalsurveillance ofnosocomialbloodstreaminfectionduetoCandldaalbicar:fre— quencyof帖ctlrtenceandantifungslsusceptibilityintheSCOPE Pl'~m【】].DtMicrobiallnf,,ctDis.1998;3I(Ij:327 [2]QthQx.PracticalInternalMedieine(实用内科学)[M]lOth Beijing:People5HealthPress,1997:496 [3]NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards.1997.Ref- ?methodforbrothdilutionanfithnsusceptibilitytestingfor eapprovedstandardM27一A[S].Villanova:Nationcom— miresforclinicallaboratmystandardspressPa.1997 [4]StiUJr.JM.LarEJ,BekeberKE,.Acomparisonof6us. ceplihilitytofiveantifugalagentsoftculturesfromburnpa— tients[J]?,2001;21(3):167 【5]ArikanS,AkovaM,]-layranM,.Correlationof/nt,Ltroflu. eonazolesuBcplibiHwithclinicaloutcomerseverelyillpatients withoropharyagealcandidiasis[】].ClinInfectDis.1998;26(4): 9o3 [6].&riasA,ArevaloMP,?mdreuA.alInt~Zrosusceptibilityof 545isolates0fCand/daspp.tofourantifLmgslagentsJ].M ?,I994;37(7—8):285 [7]uag~adiS,MatsS,HartungC,Invit4"osusceptibilityof 137CandldaspisolatesfromHIVpositivepatientstose,.'eralan一 曲?gdrugs[J]Mycopathotog4,a,2001;149(2):63 l8JSuYD,WangsZ,WengxH,.Inviuosusce#bilities0f 0,帅Dcc腿andCam/MaspiciestofivelIifa? d[J].Chin,蜘f5(中华传染病杂志),20?;18(4):239 [9]BaranJ.KlauberE,BarczakJ,et.Trendsinantifung,d ceptibilltyamongCand/dasp.urinaryisolatesfrom1994and1998 [J].』cfMicrobia1.2O00;38(2):870 308?248株念珠苗和新型隐球菌对四种抗真菌药的敏感性龙丰等 [10]PfallerMA.DiekemaDJ,JonesRN,.International surveillanceofbloodstreaminfectionduetoCanal/dospecies: frequencyof0ccurrenceandin~itrosusceptibilitlestoflucona? zole.ravuconazole.andvodconazoleofisolaleseo~ectedf13~91 1997throu#1999intheSENTRYantimicrobialsurveillance program[J]JClinM&robial,2001;39(9):3254 11]CantonE,PemanJ.Canillo-MA,et.Flueonmmlee. billtiesofbloodstreamCanddasp.isolatesasdeterminedby NCCLsmethodsM27.Aandtwoothermethods[J].J Microbial,1999;37(7):2197 [12]LoperJO,Tortes-RJM.Mendez-VR.a1.Invitrosuseepti? bilityofo,???W.Jmisolatestofiveantifm~aldrugs usingaeolorimetficsv~emandthereferenceii1icrohrothmethod [J]JAntimicrobChemother,2000;45:645 In—vitrosusceptibilityof248isolatesofCand/dasp.and Cryptococcusneoformanst0fourantifungalagents hngFeng,ZhangYong—xin,LiMing, ZhangQiang?qiangandWangJia-j (HuaShanHospital,FudanUniversity,Sh,~e,h,i20OO4O) ABSTRACTToevaluatethesusceptibilityof0Dc嘶 mmandCand/dasp.tofluconazole,amphotericin B,5-flueytosineandketoconazole.TheMICs(minimalofinhibifionconcentrations)of188Cand/dasp.isolatesand60 Crs~tococcusrwisolatestofourantifungalagentsweretestedbymierodilutionbrothmethodaccordingtotheNCCLS M27一 Amierodilutionmethod.TheMICandsusceptiblerateof160Candidaalbicansisolatestofour8ntifungBJagentswereas follows:flueonazole0.125一? 64~,g/ml,84.38%susceptible,6.25%intermediate.9.37%resistant:5-fluevtosine0.125 , 32t~o/ml,97.5%susceptible,1.25%intermediate,1.25%resistant;am.phatericinB0.06— 4~g/ml:ketoconazole0.03 , 32t~o/m1.TheMICandsusceptibilityof60isolatesofCryptococcuswD7'o删础 tofouragentswereasfoUows:fluconazole1 , ? 64S/ml,58.4%Susceptible,33.3%intermediate,8.3%resistant;5-flucytosineMIC0.25, 8Fg/m1.88.3%SUS. eeptible,11.7%intermediate;photeficinB0.03一 lt~s/ml,100%susceptible;ketoconazole0.125一l"S/ml100%8U8. ceptible.TheresistantratesofCand/datropicalisandGmdidaglabratatofluconazolere10%and22.2%respeetivelv. ConclusionCand/dasp.andCryptococcus,?扣 mmisolatesrevealedsonicdegreeofresistancetofluconazole,ketoeonzole, amphotericinBand5-flucytoeine. KEYWORDSMicrodilutionbrothmethod;MICs;Candidaspecies;Cr~ptococcusn?,rw 更正 中国抗生素杂志2001年2月第26卷第1期.38页图4,左纵坐标:G-6.9脱氢酶 tt~;O(u/Illg)相对应的0,5,10,15,20,25,30更 正为speeh'icactivityofG69-DH(u/rag)0.10,20.30,40.50.60.