【doc】白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶的诱导研究

【doc】白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶的诱导研究 白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶的诱导研究 —?—?[MdicalJournaltheChineseP~pie’s?~medPolice?)Vol13No0620O 2—06出版34l defectswiththeAmplatzerccclusiondevice:Prehnfinaryresults. Pediatrcm-dio11998,5(31):1110—1116 4温朝阳,李越,王廉一等.超声心动图在A?a盯封 堵器经导营治疗房间隔缺损中的价值.中华心血管病杂 志,2OOO,28(2):96,98 5张军,李军,张玉顺等.超声心动图指导Am舳r 封堵器在房间隔缺损封堵中的价值.中国超声医学杂 志,2001,l7【6):425,428 6MasuraJ,GavoraP,Fonra.~kAeto1.1’~erdostrmof secundumatrialdefectsI1si”gtheflewself—centering Amplatzerseu【日loeeluder:imtialhumanexperienceCathetCar— diovs~cDiagn,1997,42【4):388—391 (2002一田一收稿,责任编辑李小萍) 白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶的诱导研究 武警医学院微生物教研室王丹敏董小青龚海英刘丽英(天津300162) 摘要目的了解诱导白色念珠菌分泌酸性蛋白酶(SAP)的条件:方法分别用古不同氨源及不同起始pH的培养基 摇瓶培养白色念珠菌WD27菌株,定时取样用分光光度法检测胞外 SAP活性和菌体生长量=结果蛋白质,多肽类太分子氨 源可诱导白色念珠菌分泌SAP.氨基酸,尿素,铵盐等小分子,易代谢氨 源可阻遏SAP分泌=当两太类氮源同时存在时酶分泌 抑制程度取决于阻遏物的浓度.培养基起始pH为3.0,6.0时白色念 珠菌才可被诱导分泌SAP.结论白色念珠菌SAP诱 导分泌主要受环境中氨源分子太小及DH的影响 关键词白色念珠菌酸性蛋白酶诱导 Studieso[ii?ofsecretoryacidpltei?seinmndidaa]bica[1~ WangDtmmln,xi帅 qiI1.Gongnaiyi~,lAuLiyi~.1)el~rU.mtofMicrobiology,.MedicalC姆 0faljenDp-e’s A??dP妇Fex~~.3Xaajin300162.China hhstraztObjcc~teTofindouttheconditionsre.redforimtucfionofsecretoryacidproteitmse(SAP)bycandidaalNcamMethods SAPacfi,fityandgrowth? a58wtt.smonitoredperiodicallyspectrophotmr~tricassaywhencaedidaalbicanswa8incubatedinamediumwith differentnitrogen$oLir(;eaidwithvariedstartingpH.respectively.Rt~ultsProteinsandpeptidessuppliedasnitrogenslmescouldinduce SAP,whereaslowMWnitrogensollrcessuchaSaminoacids.ureaandamam~fiumsalbrepressedSAPproduction.WhenhighMwandlowMw nitrogensupplieswpresentsimultaneouslyinmedia.theinhibitionextentofS APsecretionwasdetem’dne~]byrepre~orCOflCellllllliOlflSAP MM.Cortdttsi inductioncouldbeobservedonlyatimti~pH30—60inBSA—mmInductionlevelofSAPincandidaalbicanswasaffected mainlybvmolecularmassofanitrogensml?eandpHvalueinenvironment KeywordsCandidaalbicansAcidpr~hmseb~uelion 白色念珠菌为医学上最重要的条件致病性酵母 菌,随着广谱抗生素,皮质类激素及免疫抑制剂的广 泛应用由该菌引起的念珠菌病呈逐渐增多趋势.近 年来不少研究表明,分泌型酸性蛋白酶(SAP)为该 菌重要的致病物质,在浅部和深部念珠菌病形成过 程中起着非同小可的作用初步发现该酶不是 组成型酶,而足在一定条件下才合成分泌到菌体外. 为更好地了解SAP在白色念珠菌由皮肤,粘膜侵入 过程中的致病机理,我们对影响白色念珠菌SAP诱 导分泌的因素及诱导动力学进行了研究. 1材料和方法 1.1菌株白色念珠菌WD27,为本实验室保藏菌 种. 12试荆酵母碳基(YCB),酪蛋白氨基酸 (Cas.~a)为美困Difco实验室产品,胰蛋白胨,酵母粉 为O~oid公司产品,牛血清白蛋白(BSA),卵清蛋 白,酸溶角蛋白,组蛋白均为Sigma公司产品,其余 试剂均为国产分析纯试剂 13培养基 131+Yq?D肉汤(斜面)葡萄糖2.0%,蛋白胨 2.O%,酵母粉1,O%(琼脂1.5%),pH6.5. 132诱导培养基(I—MM)酵母碳基1.1%,葡萄 糖06%,氮源0.2%(有机氮源须经0.22um滤膜 过滤除菌后无菌加入),DH55. 14菌体浓度将菌液经适当稀释后测定6.0,由 经血球计数器校准的标准曲线计算出每菌细胞 数. 15酸性蛋白酶活性测定基本参照Kwon等方 法.在1.5ml0.5血红蛋白溶液(pH3.6)中加八 342?圈圜(Mh0fChiPeopl’sArmedPoli?Fore)?.13No06龇一06出版 经适当稀释的培养物上清液(CS)0.1IllJ,37%水浴 振荡反应lh后,加入15rnl5%’FCA终止反应,离 心后取上清液用岛津UV2600分光光度计测A5, 所得产物的1个单位A275对应的酶量定义为1个酶 活力单位. 16酶的诱导试验取一环YPD斜面上的活化菌 接人10IlIJYPD液体培养基中,37?振荡培养16h 后按4%接种量将菌体转人100ml诱导培养基中 (A一0.5),于摇床(180r/rain)37培养每隔一 定时间取样测培养液酶活性和生长量 2结果 21氮源对SAP分泌的影响用各诱导培养基振 荡培养30h时检测蛋白酶分泌水平结果表明(见 表1),蛋白质类氨源可有效诱导白色念珠菌合成, 分泌SAP,诱导强度随蛋白质种类而异.其中以BSA 诱导作用最强,皮肤巾主要蛋白一角蛋白也有较强 的诱导作用;胨类混合物有较弱的诱导作用.而氢 基酸,铵盐,尿等小分子,易利用氮源则阻遏酶的合 成从生长情况看,菌株在含小分子氮化物的培养 基中生长要良好些,但尿素例外困其呈碱性从而在 一 定程度j二抑制白色念珠菌生长 裹1氯蔼对色念珠苗分泌SAP及生长的影响 22铵盐对BSA诱导SAP分泌的影响将硫酸铵 (AS)分别以同浓度添加至BSA—ME中,每隔一 定时间测酶活力,结果见图l当菌接种到对照培 养基2h后即呵检测到蛋白酶活性,随后酶分泌量 接近呈直线t于I,至30h时达最大,此后酶水平缓 慢下降:高浓度(?0.2%)易代谢铵盐存在时培养 过程中始终检测不到蛋白酶活性,SAP诱导分泌被 完全抑制;当铵盐浓度为0.1%,0.05%时,13SA对 SAP分泌的诱导作用滞后15h左右才出现,培养至 30h时酶活力分别为对照的12.2%,43.9%;在更低 浓度的铵盐存在下SAP合成无明显抑制,最大分泌 量略高于对照. 23pFl对sAP诱导分泌的影响用不同起始pH 的BSA—MM培养基摇瓶培养35h时检测胞外酶活 5 蝗 鞋 图1硫酸镀对BSA诱导SAP分泌的影响 0_5 0-’ ;V 墓0-2 髓 ml O l2345678 DH .-. o--舜活力+生长量 5 4 一 2誊 l 0 图2pit对SAP分l泌影响 力和生长量(见图2).起始DH为3.0,6.0时白色 念珠菌才可被诱导分泌,最适值为5.0培养基pH >6.0时虽然白色念珠菌生长仍良好,但SAP分泌 量很低甚至为零,pH?30时由于在强酸性下菌体 生长很慢或停止故SAP活力几乎检测不到将菌 l圜啊 cMJcumaltheChinesePeople’sPoGceFore~}Vol13No.062OO2—06出版 343 接人pH5.0的BSA—lVlM中培养时还发现,培养液 pH先缓慢下降至24h时达最低为3.5,持续12h后 培养液酸碱度又逐渐上升至7.0左右. 3讨论 分泌型酸性蛋白酶又称胞外天冬氨酸蛋白酶 (EPR),其活性一般在酸性范围,大多数致病性念珠 菌能产生此酶由本研究可知该酶分泌水平与培养 基中氮源分子大小及其化学成分关系密切,蛋白质 类等大分子,较难利用氮源可有效诱导白色念珠菌 分泌SAP,此时蛋白质既是酶作用底物又是合成酶 的原料;胨类混合物也有一定的诱导作用,其含有的 少量多肽可能为真正诱导物;小分子,易利用氮源则 对SAP分泌有阻遏作用.由此可见白色念珠菌是 否分泌SAP取决于菌体利用氮源时是否需要蛋白 酶参与,遵循能量消耗经济原则.当小分子类和大 分子类氮源同时存在时,蛋白酶分泌水平主要受到 小分子氮源浓度的影响.当铵盐含量较高足够供菌 体使用时,由于不需要吸收利用大分子多肽为避免 能量浪费SAP合成被完全阻遏;当铵盐含量较低时 酶诱导滞后出现,酶最大诱导量明显低于对照;铵盐 浓度很低时反而还对酶合成有较弱的促进作用.可 见,SAP的诱导分泌与环境中氮供应的关系较复杂, 其合成很可能受氮代谢中某重要成分的调控. Holmes等_5J,过量的氢(铵)等无机氮化物可抑 制酵母菌谷氨酸脱氢酶(GDH)的活性,此酶在氮代 谢中为关键性酶,在蛋白质合成中也起一定的调节 作用.SAP的合成调控是否与GDH密切相关有待 进一步研究证实. 此外,白色念珠菌酸性蛋白酶的诱导合成还与 培养基的起始pH有关.pH在3,6范围时才有 S.42分泌到培养液中,起始pH为5.0时酶分泌量最 大,pH为7,8时虽然菌体生长仍旺盛但几乎未能 检测到酶活性,其原因可能为高州直接抑制SAP 合成或者虽分泌SAP但此酶在中性或碱性下很不 稳定容易失活Homma等_6一采用免疫印迹法检测 在pH>6.0下培养的白色念珠菌胞内SAP和SAP 前体,结果发现此两种成分在菌细胞内含量很低或 者检测不到,因而认为高起始pH很可能直接阻遏 蛋白酶合成.白色念珠菌接人诱导培养基后由于菌 体生长繁殖过程中分解葡萄糖产生有机酸致使培养 液pH先缓慢下降,培养至36h时pH达最低.此后 菌体先后进人稳定期,衰亡期,产酸活动显着减弱甚 至停止,而菌体分解有机氮化物产生的碱性物质不 断积累增多,致使培养液pH又逐渐上升. 根据SAP分泌条件,我们可初步推知白色念珠 菌侵人感染过程:首先菌细胞粘附于皮肤角朊细胞 上,然后表皮中角蛋白诱导其分泌SAP,同时白色念 珠菌能使微环境pH变为弱酸性,使得SAP被大量 分泌;借助该酶的水解作用白色念珠菌可由完整皮 肤侵人,并能以角蛋白,胶原蛋白为供生长用的氮源 从而可在上皮组织中大量繁殖,引起相应病变,SAP 的消化作用还有助于白色念珠菌向皮下更深层组织 扩散. 4参考文献 lOHeftMW,WendeC,CodJehM.InereasoJexpressionofCandi— daalbicat~secretory, proteinase,putativevirulencefactor,in isolatesfromhumaninur,unodeficiencyv1ruspositivepatients.J ClinMicrobio1.1995,33:2543,2549 2I-It,~BRuchelR.Moncd51etFunctionalasp~tsofsecret— edCandidaproteinasesAdvExp?E_dBio1.1998.436:339— 344 3SchallerM.SchackectC,KorlittgHCetollm,asionofCandida albicansconelaleswnhexpressionofsecreted鹧Dncproteinas一 duringDe?”infecti~]]ofhumanepidermis.Jlnve~t Dermatol,2OOO,ll4(4】;7l2,717 4sIlimizuK.KondohY.TmmkaK.Pmteinasepnxluetionand pathegeniclbofCandldaalbicansIlnvas~onintochorloallanto— icmnbIaPbyC.Albicanss~ainsofdifferentprotemaseacfiv— j.Microhialunol,1987,3l:l045一l060 5}0lmesAR.ColimSA,FamdenKJeto1.Ammoniumassimila— tionbyCandidaalhicansandotheryeasts:ederlceforactirilyof utaH1ales. vntha:~e.JGenMicrobial,1989,135:627—633 6Homma51,ChiI~anaH,TatmkaKInductionofextracellularDI teirtasejnCandidaalbicaosDenM~crob,l993,l39:l187— 1190 (200f一收稿,责任编辑郭青)