[最新精品][经典]千里追风活络油微生物限度检查方法的验证

[最新精品][经典]千里追风活络油微生物限度检查方法的验证 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ [经典]千里追风活络油微生物限度检查方法的验证 千里追风活络油微生物限度检查方法的验证 【摘 要】 目的:建立适合千里追风活络油微生物限度检查的 方法。方法:参照2010年版《中国药典(一部)》，采用薄膜过滤法 对千里追风活络油进行微生物限度检查方法学验证。结果:满足《中 华人民共和国药典》2010版验证试验的基本要求。在3次独立的平 行试验中，常规法对5株试验菌(大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉)的回收率均<70 %，薄膜过滤 法回收率均>70%。结论:薄膜过滤法可作为千里追风活络油的常规微 生物限度检查方法。 【关键词】千里追风活络油;微生物限度;方法验证;薄膜过滤; 回收率 Validation of microbial limit tests for Qianli zhui feng oil HUANGQi-hong, NONG Yun-jun,Su Liu-kun,ZENG Yong-er (China National Analytical Center, Guangzhou, Guangdong Institute of Analysis, Guangdong Guangzhou 510070, China) 【Abstract】 Objective To establish a method for microbial limit test of Qianli zhui feng oil. Methods According to the Chinese Pharmacopoeia (edition 2010, Vol. I), the membrane filtration method was adopted to conduct the microbial limit tests for Qianli zhui feng oil. Results The method can pass the validation test of Chinese Pharmacopoeia (edition 2010, Vol. I). In the parallel experiment of 3 independence, the recoveries of 5 tested strains (Escherichia coli、Staphylococus aureus、Bacillus subtilis、Candida albicans and Aspergillus niger) by routine method were less than70%, while by the 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ membrane filtration method were more than 70%. Conclusion The membrane filtration method can be used in microbial limit test for Qianli zhui feng oil preparation control. 【Key words】 Qianli zhui feng oil; Microbial limit tests; Validation of the method; Membrane filtration; Recovery rate 千里追风活络油为中药外用制剂，它具有驱风、活络、活血、消 肿、止痛等功能。根据《中华人民共和国药典》2010年版微生物限 度检查法有关规定[1]，在建立千里追风活络油微 生物限度检查法并对其验证过程中，发现该产品对细菌、霉菌的 生长有明显的抑制作用，通过对不同的实验方法和实验条件的筛选， 建立了适合千里追风活络油微生物限度检查的方法 1 结果比较满意 1.1 材料与方法 1.1.1 材料 1.1.1.1供试品 千里追风活络油，规格20mL/瓶，由香港星洲药业有限公司提供。 1.1 .1.2仪器 脱卸式薄膜过滤器。微孔滤膜:孔径0.45 μm，尺寸50 mm，使 用前于121 ? 20 min灭菌。 1.1.1.3培养基及稀释剂 营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂，营养肉汤等 pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液。 以上培养基均在有效使用期内的使用，由广东环凯微生物科技有 限公司提供。 1.1.1.4菌种 大肠埃希氏菌CMCC(B)44102 第2代，金黄色葡萄球菌CMCC (B)26003 第4代，枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 第3代，白色 念珠菌CMCC(F)98001 第2代，黑曲霉CMCC(F)98003 第3代， 铜绿假单胞菌CMCC(F)第4代。 1.2 实验方法及菌液制备方法 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 参照2010年《中华人民共和国药典》版一部附录微生物限度检查法方法验证，简述如下。 1.2.1 供试液制备 取供试品10 mL， 加入1 mL无菌聚山梨酯80，加pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL振摇充分混匀，作为1?10供试液。 鉴于常规法对千里追风活络油进行测试，细菌、霉菌和酵母菌回收率均<70 %，故必须建立另一种适合的方法对其进行测试。 1.2.2薄膜过滤法 1.2.2.1 细菌、霉菌和酵母菌计数方法的验证 试验组:分别取1?10的供试液1 mL和1 mL 的50~100 CFU/ mL的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉悬液加45 ? pH 7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100 mL稀释后过滤，用200 mL的pH 7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次50 mL，边冲洗边振摇，过滤后将滤膜菌面朝上分别贴于营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基平板上，分别置30~35 ?培养48 h和23~28 ?培养72 h。 菌液组:分别检测上述用到的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉悬液的菌落总数。 供试品对照组:分别取1?10的供试液1 mL加45 ? pH 7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100 mL稀释后过滤，用200 mL的pH 7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次50 mL，边冲洗边振摇，过滤后将滤膜菌面朝上分别贴于营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基平板上，分别置30~35 ?培养48 h和23~28 ?培养72 h。 稀释剂对照组:依次取pH 7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液10 mL， 加1 mL无菌聚山梨酯80，分别加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉5种菌的菌悬液1 mL(含5000~10000 CFU/ mL)，加pH 7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100mL混匀。分别取1 mL，加入45? pH 7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100 mL稀释后过滤， 用200 mL的pH 7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次50 mL，边冲洗边振摇，过滤后将滤膜菌面朝上分别贴于营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基平板上，分别置30~35 ? 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 培养48 h和23~28 ?培养72 h。 上述同样的方法做3个平行实验。 1.2.2.2 控制菌检查方法的验证 参照细菌、霉菌和酵母菌计数方法薄膜过滤的方法进行验证，程序按2010年《中华人民共和国药典》版一部附录微生物限度检查法方法验证分别对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌检查方法的进行验证试验。 2 结果 2.1 薄膜过滤法回收率测定 用薄膜过滤法测定大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉5个菌株的回收率，结果见表1。由表1可见，用薄膜过滤法的三次平行试验，稀释剂对照组和试验组，5个菌株的三次平行实验回收率均可以达到70,，说明用薄膜过滤法200 mL冲洗液分4次冲洗是可以消除千里追风活络油对细菌、霉菌和酵母菌的抑制作用的。 2.2 控制菌验证结果 对铜绿假单胞菌检查方法的验证中，试验组培养后可见增菌培养基混浊生长，平板菌落呈灰白色，扁平，无定形，周边有扩散现象，表面湿润，菌落周边有蓝绿色素扩散。阴性对照组培养后可见增菌培养基混浊生长，平板无菌落生长。上述实验表明试验组检出铜绿假单胞，阴性对照组未检出大肠埃希菌。 对金黄色葡萄球菌检查方法的验证中，实验组培养后可见增菌培养基混浊生长，平板菌落呈金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，周边有黄色环，菌落直径约0.7~1mm。阴性对照组培养后可见增菌培养基混浊生长，平板无菌落生长。上述实验表明试验组检出金黄色葡萄球菌，阴性对照组未检出大肠埃希菌。 铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌控制菌检查的方法验证结果表明薄膜过滤法后，试验菌都能生长良好。 表1 千里追风活络油细菌、霉菌和酵母菌回收率的测定(薄膜过滤法) 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 菌株 试验次数 试验组 菌液组 稀释剂 对照组 供试品 对照组 稀释剂对照组回收率(,) 试验组回收率(,) 大肠埃希菌 ? 76 80 74 0 92.50 95.00 ? 69 74 60 0 81.08 93.24 ? 73 89 70 0 78.65 82.02 金黄色葡萄球菌 ? 70 76 53 0 69.74 92.11 ? 67 67 67 0 100 100 ? 60 63 63 0 100 95.24 菌株 试验次数 试验组 菌液组 稀释剂 对照组 供试品 对照组 稀释剂对照组 回收率(,) 试验组回收率(,) 枯草芽孢杆菌 ? 72 80 70 0 87.50 90.00 ? 65 74 64 0 86.49 87.84 ? 80 91 60 0 65.93 87.91 白色念珠菌 ? 49 57 54 0 94.74 85.96 ? 47 53 50 0 94.34 88.68 ? 55 60 61 0 100 91.67 黑曲霉 ? 76 80 72 0 90.00 95.00 ? 61 70 56 0 80.00 87.14 ? 61 68 69 0 100 89.71 3 讨论 药品微生物限度检查是非灭菌制剂不可缺少的重要必检项目。检查之前，应对该药品建立细菌、 霉菌及酵母菌计数方法的验证[2]，控制菌检查方法的验证[3]，以确认所采取的方法适合于该药品的微生物限度检查。 本次研究以中国药典2010版微生物限度检查法方法验证作为依据， 将5种阳性对照菌的回收率试验作为评价常规法和薄膜过滤法的客观，确定了千里追风活络油的微生物限度检查的方法。结果 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 显示采用常规法，供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率试验均<70%;采用薄膜过滤法，供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率试验均>70 %。表明千里追风活络油对细菌、真菌都有较强的抑菌作用，需采用薄膜过滤法。由于千里追风活络油中含有挥发油成分，直接加入pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液产生分层，因此加入聚山梨酯80能使供试液分散均匀;同时研究发现聚山梨酯 80的加入量不宜太大，应以能使油剂乳化的最小量为适。笔者曾对不同的加入量进行了验证，其结果是随着聚山梨酯 80加入量的增加，细菌的回收率反而会降低，所以本品只加入了1 mL的无菌聚山梨酯 80来帮助乳化。另外，在供试液的制备和实验操作过程供试液及冲洗液需在45 ?保温，增大其溶解度避免滤膜堵塞，保证供试液顺利通过滤膜。 参考文献 [1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[M]. 北京:中国医药科技出版社，2010:附录??C微生物限度检查法. [2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[M]. 北京:化学出版社，2005:71. [3] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[M]. 北京:化学出版社，2005:73.