中宝链球康对猪型链球菌病的防治效果试验

中宝链球康对猪型链球菌病的防治效果试验 中宝链球康对猪?型链球菌病的防治效果试验 摘要: 猪链球菌病是猪的一种常见传染病。由于链球茵有多个血清型，临床防治带来一定困难。为了探求在临床中的疗效，将中宝链球康分别熬制成浓度为20%，10%和5%三种不同的浓度，将从青岛动检所获赠的猪?型R群链球菌毒株进行复苏，用牛津杯法和二倍稀释法进行药敏试验，初步断定该药效果。为进一步确定该药物疗效，进行动物攻毒保护和攻毒治疗试验。结果表明中宝链球康可有效控制本病发生。 关键词: 链球菌、药敏试验、动物攻毒保护试验、攻毒治疗试验 链球菌的种类繁多，在自然界中分布很广。一部分对人畜有致病性，一部分无致病性。其致病作用一般在多种诱因作用下才能发生作用。如饲养管理不当，环境卫生差，夏季气候炎热、干燥，冬季寒冷潮湿以及遗传因素等使动物抵抗力降低时，都可能引起某种动物发病。链球菌病是由链球菌属中致病性链球菌所致的人类和动物共患的一种多型性传染病。目前，临床上已报导的重要的链球菌病大多是β溶血型，存在于人和动物的皮肤、呼吸道及软组织感染，如肺炎、消化道及泌尿生殖道炎症及关节炎等疾病，是最重要的细菌性传染病。而猪链球菌病是猪链球菌(Streptococcus suis)引起的猪疫病的总称。根据其荚膜抗原的差异，猪链球菌可分为35个血清型(1,34型和1/2型)，其中2型猪链球菌是人畜共患病，目前已有20多个国家和地区报道有该菌存在，1990年我国广东省首次出现，1998年江苏、2005年的四 [1-4]川呈地方性流行，2005年广西有3个县有疑似猪链球菌2型报道，但没有分离到猪2型链球菌。 猪链球菌病的病原是多型链球菌，也是条件性致病菌，圆形或卵圆形，常排列成链状，不形成芽胞，一般无鞭毛、不运动、可形成荚膜，需氧或兼性厌氧，对培养基要求较严格、需添加血清或鲜血等，37?培养才生长良好。链球菌属种类繁多，分布很广，各种分类法均存在一定的局限性，且还有许多问没有得到较好的解决。目前，有如下三种分类方法。第一，按其对鲜血琼脂中红细胞的作用，分为三个群。溶血性链球菌(P群):在菌落周围形成2 4 mm透明的溶血环，为完全溶血，致病性链球菌多属此群。草绿色链球菌(A群):在菌落周围有草绿色溶血环，宽12 mm，为不完全溶血，致病力较弱，常引起局部化脓性炎症。不溶血链球菌(Y群):在菌落周围不溶血，寄生于动物黏膜，一般不致病或致病力不强。第二，按细胞壁多糖成分的群特异性，即根据群特异性抗原(C抗原)的不同，用兰氏(1ancefield)血清学分 [5]类为A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U等19个血清群。在每个群中，因细胞壁的蛋白抗原(表面抗原)具有型特异性，故又可将群内的细菌分为若干 个血清型，如A群有6o个血清型，B群可分4个血清型，C群可分为13个血清型，等等。第三，按照荚膜多糖抗原可将链球菌分成37个荚膜血清型，即1~36和1/2型(同时含有I型和?型抗原 的菌株)。 猪链球菌自然感染部位是猪的上呼吸道(特别是扁桃体和鼻腔)、消化道和生殖道。病 [6]猪和带菌猪是该病的主要传染源，排泄物和分泌物中均有病原菌。病猪和未经无害化处理的死猪、内脏及废弃物，以及污染的饲料、饮水和运输工具等器物是本病传播的重要原因。该病主要经呼吸道和消化道感染，以及损伤的皮肤、黏膜感染。病猪或带菌猪与健康猪接触，病死猪处置不当，或被污染的饲料、饮水和运输工具等均可引起猪只大批发病而造成流行。本病是危害养猪业的多发病和常发病，种类多，发病严重，可在猪群中长期蔓延，给养猪业 [7]带来严重的经济损失。目前，猪链球菌病病是危害养猪业的多发病和常发病，我国几乎不存在没有猪链球菌感染的猪群，给养猪业带来严重的经济损失。临床常于治疗此病的药物由于多年使用，已经逐渐呈现出耐药现象。本研究旨在通过人工诱发猪链球菌病，来观察中宝链球康对猪链球菌病的防治效果。 1. 实验材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 试验动物 由山东省莱阳市某猪场提供，健康的33头30日龄8kg左右仔猪。 1.1.2 试验菌株 猪II型链球菌强毒株(由青岛动检所提供) 1.1.3 疫苗 猪II型链球菌灭活疫苗 1.1.4 试验药物 中宝链球康(由深圳中宝天然生物科技发展有限公司提供) 1.1.5 主要试剂及器材 Mueller—Hinton 肉汤(MHB) 中国检验检疫科学研究院 琼脂 天津市科密欧化学试剂开发中心 新生犊牛血清 北京元享圣马技术研久所 高压锅 上海医用核子仪器厂 微量移液器 上海荣泰生化工程有限公司 双目生物显微镜 CHT—2 Japan 六联电子调温万用电炉 龙口市先科仪器公司 数县电热恒温培养箱 600型 龙口市先科仪器公司 电热鼓风干燥箱 CS101—A型 中华人民共和国重庆试验 设备厂制造 恒温振荡器 哈尔滨市东明医疗仪器厂 超净工作台 万净集团安泰公司制造 革兰氏染色液 1.1.6 实验所用溶液及其配制 1.1.6.1 药液的配置 分别称取中宝链球康50g、100g、200g于3个盛有lOOOmL蒸馏水的陶瓷缸中浸泡1h，然后在电炉上煮沸30min，取下8层纱布过滤，收集滤液于200mL的烧杯中;加入药渣量3,5倍的蒸馏水继续煎煮30min，按上述发法过滤，分别收集滤液;同法将药渣再煎煮一次，过滤。合并三次滤液，水浴浓缩至100mL，即药液浓度分别为0.5g/mL、1g/mL、2g/mL。然后分装于 [8]3个100mL的玻璃瓶中，高压灭菌后于4?冰箱中保存备用。 1.1.6.2 猪II型链球菌灭活疫苗制备 将在4%血清 MH肉汤固体培养基上生长的链球菌无菌条件下接种到盛有200mLMH肉汤培养液的锥形瓶中，170rpm增菌培养8小时。取出菌液用0.4,体积的福尔马林灭活，福尔马林要逐滴加入，并且要一边加入一边振荡，然后放入培养箱中37?恒温培养6小时。为保证灭活效果，期间需要每2小时均匀振荡一次，有条件的最好用振荡培养箱37?恒温培养，制成灭活菌苗。为保证疫苗安全性，取灭活的菌液在4%血清 MH肉汤固体培养基中划线37?恒温培养24小时，观察有无菌落生长。经检验无菌生长后，进行混匀及分装。混合前，分别将每一瓶培养物涂片镜检，看有无其它污染菌，若有，则废弃。然后按需要分装封存，于4? [9]冰箱中可保存。 1.2 实验方法 1.2.1 菌株的复苏 将冻存的猪?型链球菌强毒株接种的配制好的4%血清MH固体培养基上，在37 ?的恒温培养箱中培养24h，观察细菌生长情况。 1.2.2 形态结构及染色特性 将猪II型链球菌，接种到4%血清MH固体培养基上，挑取单菌落进行革兰氏染色。预先取一载玻片，用酒精棉球擦净，在其上滴一滴生理盐水，然后挑取单菌落均匀涂在载玻片上，用酒精灯固定后进行革兰氏染色。结晶紫1 ~3min，蒸馏水洗净后，革兰氏染色液1 ~2min，蒸馏水洗净后，95%的乙醇脱色30s，,蒸馏水洗净后，最后进行沙黄复染30s ~1min，蒸馏水 [10]洗净。完毕后在显微镜下用油镜进行镜检。 1.2.3 菌液的制备 从4%血清MH固体培养基上挑取单菌落接种到4%小牛血清的MH液体培养基中，摇床170rpm培养8h，观察结果。 [11]1.2.4 平板菌落计数 为保证牛津杯试验中活菌数的量，采用平板菌落菌数方法初步估计。将上述摇床培养的菌液进行倍比稀释。取10个灭菌好的1.5mL的 EP管;每支管中加入900μL的4%血清的MH肉汤，编号1—10;第一支EP管中加入100μL菌液，混匀。从中取100μL加入第2管，混匀。从中取100μL加入第3管，按此法依次加至最后第10管。取第6、7、8支EP管备用。取9个已做好的4%血清的MH固体培养基，分三组，每个组设三个重复。分别取100μL(从第6、7、8EP管)加入培养基中，三个重复中可有两个用涂布器涂匀，另一个手摇晃匀(注意涂布器若只有一 8个，可以从10的EP管中开始做，以免影响结果)。然后放到37 ?恒温培养箱中培养24h，观察实验结果，进行菌落计数。 1.2.5 药敏试验 [12]1.2.5.1 牛津杯法 以4%血清MH固体培养基制备双层平板。取摇菌8h的菌液做10倍稀释;用棉签蘸取均匀涂布在MH固体培养基上，注意要涂布均匀，然后做一个用涂布器涂布的对照，上层为含 5有10CFU/ mL细菌的培养基。每个平板均匀放置3个牛津杯，3个剂量组分别做3个重复，按照1号为20%，2号为10%，3号为5%标记于培养基上，用灭菌镊子夹取灭菌好的牛津杯于培养基中。吸取280μL药液注入牛津杯中，小心不要溢出;然后小心平稳放置37?培养箱中培养24h。用游标卡尺测量抑菌圈直径，取3组的平均值。 1.2.5.2 二倍稀释法测定药液的MIC值 5将摇床培养8h后的菌液加4%血清的MH肉汤稀释至每mL含细菌10CFU。取13×100mm 5灭菌试管l5支，编号，依次排列在试管架上。在1号试管加入上述调节至含菌量10CFU的菌液1mL，2,13号试管每管加入1mL菌液。取1mL受试中药液加到1号试管中，混匀。从1号试管中取出1mL加到2号管中，依次倍比稀释直至12号管，从12号管弃取1mL;13号管作为不加药液的对照管，14号管加入受试药液1mL，15号管加入1mL4%血清的MH肉汤作为阴性对照管。混匀置37?温箱中培养12,18h，观察细菌生长情况。结果判定标准:肉汤完全清亮，表示无细菌生长，记为(-);肉汤浑浊表示有细菌生长，记为(+)。以肉眼观察无细菌生长试管中的最低药物浓度为MIC值。 1.2.6 攻毒保护试验 选择30日龄体重8kg左右健康仔猪18头，动物分组及处理见表1。 在攻毒前7天开始，0.1g/kg组、0.2g/kg组、0.4g/kg组分别在饲料中按0.1g/kg体重、0.2g/kg体重、0.4g/kg体重进行中药投喂，每日两次;疫苗组在攻毒前14天注射猪链球菌灭活疫苗、 5阴性对照组不用任何药物。45日龄时，用每mL含细菌10CFU的菌液进行攻毒，中药组在 饲料中继续按0.1g/kg体重、0.2g/kg体重、0.4g/kg体重中药进行投喂，阴性对照和疫苗组不添加任何药物，0.2g/kg+疫苗免疫组在攻毒时停止使用任何药物。每头猪进行试验前后的称重，每日测量体温 (见下页表1) 。 表1 实验动物分组及处理 处动物数 注射灭活苗 用药 攻毒 中药组继续用药 理 用药，观察疗程 (1日) (8,15日) (16日) (16,30日) 组别 0.1g/kg组 3 , ， ， ， >7 0.2g/kg组 3 , ， ， ， >7 0.4g/kg组 3 , ， ， ， >7 0.2g/kg药3 ， ， ， , =7 物+疫苗免 疫组 疫苗组 3 ， , ， , , 阴性对照3 , , ， , , 组 注:以开始试验时间作为第1日 [13]1.2.7 攻毒治疗试验 选择30日龄体重8kg左右健康仔猪15头，分组及处理见表2。 5用每mL含细菌10CFU的菌液进行攻毒，待猪群开始发病后分别灌服中宝链球康，在饲料中按0.1g/kg体重、0.2g/kg体重、0.4g/kg体重中药进行投喂，对照组肌肉注射青霉素80万单位/头，各药物均每日两次投用，连用7d。阴性对照组不添加任何药物，观察疗效。每头猪进行试验前后的称重，每日测量体温。(见下页表2) 表2 药物治疗试验动物分组及处理 处理 动物数 攻毒(1日) 开始出现症状用药疗程 用药 组别 0.1g/kg组 3 ， ， 7 0.2g/kg组 3 ， ， 7 0.4g/kg组 3 ， ， 7 青霉素对照3 ， 肌注青霉素 7 组 80万单位/头 阴性对照组 3 ， , , 注:以开始试验时间作为第1日 2.结果 2.1 形态结构及染色特性 经过涂片、革兰氏染色、显微镜检查为革兰氏阳性，在培养物中多呈单个、双球或短链 状排列。 图,:链球菌染色特性 2.2 平板菌落计数 计数时按下列进行:每毫升菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5 根据实验计算:(每微升) 69 第6号管:285×5×10=1.425×10 79 第7号管:119×5×10=5.95×10 第8号管:无细菌生长(可能是菌液浓度太低) 2.3 药敏试验 2.3.1 牛津杯法 中宝链球康对猪链球菌的抑菌圈大小结果(含照片) 附照片: 图2标注的1、2、3分别是药液浓度为2g/mL、1g/mL、0.5g/mL的牛津杯试验结果 表3牛津杯法抑菌圈大小结果 药液浓度 抑菌圈直径(mm) 20% 1.863 10% 1.640 5% 1.553 2.3.2 二倍稀释法测最小抑菌浓度(MIC) 肉眼观察培养18h后的试管，其中阴性对照液体(15管)澄清透明，说明无菌生长，阳性对照液体(13管)变混浊，说明有菌生长。由于药液带有颜色，致使前面浓度较高的试管无法判断结果，将前面6管进行平板划线分离，结果1、2管无菌生长，后面的管均有菌长，所以 据此判定中宝链球康对猪?型链球菌的最低抑菌浓度为0.5g/mL 。 2.4 攻毒保护试验 表4 “中宝链球康”与其他药物对攻毒保护试验对比效果 结果 发病数 死亡率 有效率 组别 0.1g/kg组 1 0 67 0.2g/kg组 0 0 100 0.4g/kg组 0 0 100 0.2g/kg药物0 0 100 +疫苗免疫 组 疫苗组 2 1 33 对照组 3 3 0 发病数 2.5 攻 毒治疗 试验 表5“中 宝链球 康”与其 他药物 对攻毒 治疗试 验对比 效果 处理 组别 0.1g/kg组 1 0 67 100 0.2g/kg组 0 0 100 100 0.4g/kg组 0 0 100 100 青霉素对照2 1 33 67 组 阴性对照组 3 3 0 0 (疗效判断标准 治愈:用药7d后，猪精神、食欲、粪便正常，体温正常，皮肤颜色正常;显效:用药7d 后，猪精神、食欲好转，体温基本正常，皮肤颜色基本正常;无效:用药7d后，猪精神、食欲未见好转，体温 [15]高，甚至衰竭死亡.) 3. 讨论 3.1 猪链球菌是重要的人兽共患病病原，猪链球菌病作为高集约化猪群的主要传染病之一，受到越来越多的重视。在全国各地均有发生，其流行时间长，范围广，发病率和死亡率高，造成该地区养猪业的重大损失，也引起多个接触病猪的从业人员感染发病，给公共卫生带来严重威胁。80年代初，加拿大由猪链球菌引起的疾病开始增加。那时仅检出9种夹膜血清型，其中2型是最常见的 。病猪和带菌猪是本病的重要传染源。病猪的鼻液、尿液、肌肉、内脏和关节内均带有病原体。 3.2 临床常于治疗此病的药物由于经过了多年的使用，已经逐渐呈现出耐药现象。中宝链球康为新型的可添加与饲料的中草药制剂，为了深入的了解中宝链球康的药效以及该病的发生和流行情况，经接种到4%血清的MH固体培养基细菌复苏后，进行了一系列的药敏实验和动物试验(动物攻毒保护试验、攻毒治疗试验)。 3.3 链球菌病在应用常用的抗生素治疗效果往往不佳，给养猪业带来很大经济损失。经报道，分离菌株己对常用抗菌药物产生了广泛的耐药性。因此，研制一种不易产生耐药性并具有良好效果的药物已成为控制该病的当务之急。而中宝链球康主要成分为中草药，用药后不易产生耐药性。现在中草药开发为全世界研究的焦点。 中宝链球康的出现具有很强的时间性和代表性. 3.4 此次药敏实验用牛津杯法和二倍稀释法，而不采用药敏纸片法。原因在于中宝链球康是 一种中草药，若将其制备成药敏纸片，由于是中草药，药敏纸片上药液分部不均匀，会使抑菌圈不，影响试验准确性。 3.5 在攻毒保护试验中,通过给药的不同浓度效果的比较以及攻毒后是否继续用药效果的比较,确定了给药的最佳浓度和链球康的显著效果;在攻毒治疗试验中,中宝链球康其他药物,如与青霉素的对比效果可以看出,中宝链球康具有其他抗生素无法比拟的优越性,也进一步证明了中宝链球康的实用价值。 3.6 中宝链球康尚处于完善阶段，我们还可以对中宝链球康的最佳浓度做出更确切的研究，通过不同的药物梯度，筛选出更高效的用药浓度。 4. 结论 人工诱发仔猪感染II型链球菌，使用中宝链球康对感染仔猪进行治疗，实验结果表明中宝链球康对其有显著的效果。中宝链球康为新型的饲料添加剂，临床应用较低浓度即可达到该病的防治效果。链球菌易产生抗药性，尤其是对抗生素。而中宝链球康主要成分为中草药，用药后不易产生耐药性，对感染猪有较好疗效。此外中宝链球康在畜猪体内吸收快，血中药物半衰期长，药物组织穿透力强，体内分布容积大，尤其在肺组织，乳中的药物浓度高。由于该药具有良好的抗菌活性及药动学特征，对革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性菌等均有抑制作用。可以说中宝链球康已具备了进入市场和进一步推广的条件。 参考文献 [1] Arends J P，Zanen H C(Meningitis caused by Streptococcus suis in humans[J](Rev Infect Dis，1988，10(1):131—137( [2]Chanter N，P(W (Jones，T(J(L_Alexander(Menin—gitis in pigs caused by Streptococcus suis a specμLative review [J](Vet(Microbio1(1993，36(1-2):39—55( [3]李茂林(严景生(2型猪链球菌病的研究概述[J](江西畜牧兽医杂志，2005(5):6,7( [4]刘军(冯书章(尹铁勇，猪链球菌2型和9型菌株的多重PCR检测[J](中国人兽共患病杂志，2005((6):510 ~514. 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