碱性磷酸酶米氏常数的测定

碱性磷酸酶米氏常数的测定 [目的与要求] 通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定及意义。学会运用曲线测定酶的活性，加深对酶促反应动力学的理解。 [原理] 在环境的温度、pH和酶的浓度一定时。酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时。酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(V)，如图37所示。 max 底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。 V = V[S]/(K+[S]) maxm 上式中V为最大反应速度，[S]为底物浓度，K为米氏常数(Michaelis constant)，maxm 而其中V则表示反应的起始速度。当V= V/2时，K =[S]。所以米氏常数是反应速度等于maxm 最大反应速度一半时底物的浓度。因此K的单位以摩尔浓度(mol,L)表示。 m K是酶的最重要的特征性常数，测定K值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的mm K值在0.01-100(mmol/L)间。 m 酶促反应的最大速度V实际上不易准确测定，K值也就不易准确测出。林-贝 maxm (1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即: [S]或1/V = K/ V?(1/[S])+1/ V 1/V = (K +[S])/ Vmaxmmaxmaxm 此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ K，由此可以正确求得该酶的Kmm值，如图38所示。 图37 底物浓度对反应速度的影响 图38 Lineweaver-Burk作图法 本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其K值。 m 可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的K值。m本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光度的大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含量，进而算出酶活性的大小。反应式如下: [操作步骤] 1(底物浓度对酶促反应速度的影响 (1)取6支试管，作好标记。按下表操作。 试剂(mL) 管 号 1 2 3 4 5 6 0.04mol/L 基质液 0.10 0.20 0.30 0.40 0.80 0.0 pH10，0.1mol/L碳酸盐缓冲液 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 蒸馏水 1.10 1.00 0.90 0.80 0.40 1.20 37?水浴中保温5分钟 血清 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 最终基质浓度 2.00 4.00 6.00 8.00 16.00 0.00 (2)加入血清后，各管混匀并且立即记录时间，将上述各管置37?水浴中准确保温15 分钟。 (3)保温结束，立即加碱性溶液1.1mL终止反应。 (4)各管分别加入0.3, 4-氨基安替比林1.OmL，0.5, 铁氰化钾2.0mL，充分混匀，放置10分钟，以6号空白管作对照，于510nm波长处比色测定，根据酚标准曲线计算酶活性。 (5)以各管基质浓度的倒数1/[S]为横坐标，以各管吸光度的倒数或者以酶活性单位的倒数1/V作纵坐标，作图求出K值。 m 2. 酚标准曲线的绘制 (1)取洁净干燥试管6支，按下表依次加入试剂。 试剂(mL) 1 2 3 4 5 6 0.1mg/mL 酚标准溶液 0.0 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40 蒸馏水 2.0 1.95 1.90 1.80 1.70 1.60 37?水浴保温5min 碱性溶液 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 0.3% 4-氨基安替比林 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5% 铁氰化钾 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 (2)混匀后室温放置15分钟，于510nm波长处比色。 (3)以酚含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制酚标准曲线。 [结果与计算] 在37?保温15分钟，每生成1mg酚为一个酶活性单位，以标准曲线查出释放酚量 (μg)即可算出酶活性。 100mL血清中酶活性 = 释放的酚量×(1/0.1)×100×(1/1000) [注意事项] 1(血清取量要准确 2(标准曲线必须是过原点的一条直线 [试剂] 1(0.04mol/L 基质液 称取磷酸苯二钠10.16g或无水磷酸苯二钠8.72g，用煮沸冷却的蒸馏水溶解，并定容至1000mL，加入4mL氯仿防腐，置棕色瓶中，冰箱内保存可用一周。 2(0.1mol,L碳酸盐缓冲液pH10(37?) 称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 3(碱性溶液 取0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaHC0各20mL，混合后加蒸馏水到 3 100mL。 4(0.5,铁氰化钾 取铁氰化钾5g和硼酸15g各溶于400mL蒸馏水中，溶解后二液混合，再加蒸馏水至1000mL，置棕色瓶中，暗处保存。 5(0.3, 4-氨基安替比林 4-氨基安替比林0.3g及NaHC0 4.2g用蒸馏水溶解，并3 稀释至100mL，置棕色瓶中，4?保存。 6(酚标准液(0.1mg/mL) a(称取结晶酚1.50g，溶于0.1mol,L HCl，定容至1000mL为贮备液。 b标定:取25mL上述贮备液，加0.1mol,L NaOH 55mL，加热至65?。再加入0.1mol/L 碘液25.0mL，盖好放置30分钟，加浓HCl 5mL，再以0.1,淀粉作指示剂，用0.1mol,L硫代硫酸钠滴定，反应如下: 3I + CHOH CHIOH + 3HI 265623 I +2NaSO 2NaI + NaSO 2223246 根据反应，3分子碘(Mw:254)与一分子酚(Mw:94)起作用，因此每毫升0.1mol/L碘液(含碘12.7mg)相当于酚的毫克数为 12.7×94/(3×254)=1.567 25mL碘液中被硫代硫酸钠滴定者为xmL，则25mL酚溶液中所含酚量为:1.567mg×(25-x)。 c. 应用时，按标定结果用蒸馏水稀释至0.1mg,mL作为标准液。 器材] [ 1(37?水浴 2(可见光分光光度计