啤酒酵母DNA修复基因RAD24温度敏感突变株的分离及其特性的初步研究

啤酒酵母DNA修复基因RAD24温度敏感突变株的分离及其特性的初步研究 114, 12 第14卷 第2期V o lN o 中 国 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 报 1998年4月 . 1998A p r C h in e se Jo u rn a l o f B io ch em ist ry an d M o lecu la r B io lo gy 啤酒酵母 修复基因 温度敏感突变株的 24D NA RAD 3 分离及其特性的初步研究 朱应葆韩云傅欣 童坦君( ) 北京医科大学三院中心实验室细胞分子生物室, 北京 100083( )北京医科大学生化与分子生物学系, 北京100083 摘要以 系列带 、和 标志基因的载体为骨架构建含野生型和经羟胺处理 YCp lac T rpH is U ra 的突变型的啤酒酵母 基因质粒, 用质粒替换方法分离 基因温度敏感突变株 24 24 RA D RA D 333( ()) 242紫外生存试验发现, 242对紫外线敏感; 同位素 2223. 3, , rad t srad t sH T dR H U R H L eu 参入试验表明, 该突变株 、及蛋白质合成均较野生型明显降低.DN A RN A 关键词: 24, 突变株, 温度敏感, 紫外生存试验RA D Iso la t ion an d Cha ra c ter iza t ion of the Tem pera ture Sen s it ive 24 M utan t of D NA Repa ir Gen e RAD of S a cch a romyces ce revis ia e 2Zh u Y in gB ao H an Y u n F u X in (), , , 100083M ed ica l R esea rch C en terT h e S ch ool of C l in ica l M ed icineB eij ing M ed ica l U n iv ersity B eij ing 2T o n g T an J u n (), , 100083D ep a r tm en t of B ioch em istry and M olecu la r B iology B eij ing M ed ica l U n iv ersity B eij ing 24 A bstra c t T h e RA D gen e o f S a cch a rom y ces ce rev is ia e is in vo lved in n u c leo t ide ex c isio n re2 . 268 . . p a irIt en co de s a p ro te in o f am ino ac id sD e le t io n o f th is gen e in genom e is le th a lT o 24 , 2stu dy th e fu n c t io n o f RA D gen eth e tem p e ra tu resen sit ive m u tan t o f th e gen e w a s iso la ted . , 24 b y p la sm id sh u ff lin gF ir stth e fu ll len g th o f w ild typ e RA D gen e w a s c lo n ed in to th e YC 2 33 363 3 , 1 p lacbo n ed p la sm id pRB w h ich co n ta in s U ragen en am ed p T San d t ran sfo rm ed yea st 684. , 24 684 2H Y N ex tth e R adgen e in genom e o f H Y w a s de le ted b y o n estep gen e d isrup t io n 3 . , 24 in w h ich th e H isgen e m a rk e r w a s u sedT h en th e w ild typ e RA D gen e w a s c lo n ed in to 22 364 1 YCp lacbo n ed p la sm id pRB co n ta in in g T rp gen e an d t rea ted w ith h yd ro x y lam in e to + +684 1 . m u ta te th e gen e o f in te re st an d t ran sfo rm ed H Y co n ta in in g p T Sp la sm idT rp U ra t ran sfo rm an t s w e re te sted fo r tem p e ra tu re sen sit ive g row th p r io r to t ran sfe r to m ed ium co n2 2 225, , 24 ta in in g FOA w h ich w a s se lec ted fo r U race llsw h ich lo st th e no n m u tagen ized RA D 364. 224 . , gen e o n th e pRB T h is p ro cedu re e lim in a ted an y no n rad t s m u ta t io n sF in a llyv iab ility 2+ 52o f th e FOA re sistan t U raT rp ce lls co u ld o n ly b e du e to th e p re sen ce o f th e m u tagen ized 364 2422 3 . pRB p la sm id an d a rad t sm u tan t w a s o b ta in ed b y sc reen in g rep lica t in g p la te sU V , , su rv iva l te st in d ica te s th a t th e m u tan t w a s h igh ly sen sit ive to U V an d it s syn th e sis o f DN A .RN A an d p ro te in w a s m u ch dec rea sed com p a red w ith th e w ild typ e st ra in : 24,, 22, Key word sRA D M u tan tT em p e ra tu resen sit iveU V su rv iva l te st ( )3 国家自然科学基金资助课题 39670235 损伤修复涉及医学诸多领域, 是生命科学的重大命题. 在基因水平研究 损伤 DN A DN A 是重要的遗传物质,修复不仅具有重大的理论意义, 而且具有广阔的应用前景. 一方面, DN A 研究 损伤修复能使人们更好地理解生物在保持和传递遗传信息中维持稳定性的机理, DN A 更深入地了解突变与进化的分子过程, 以揭示生命的奥秘; 另一方面, 修复是肿瘤生物学 DN A 的一个重要基础问题, 理论上的阐明将有助于在改进辐射损伤的防治及提高肿瘤放疗效果等 方面开辟新的途径. () 啤酒酵母 S a cch a rom y ces ce rev is ia e是单细胞真核生物, 它的基因组比较简单, 易于操作,遗传背景相对清楚, 加之其突变株又易于分离, 因而被广泛用来作为研究真核细胞 修复 DN A 1, 2 的理想. 24基因是啤酒酵母细胞切除修复上位显性组的成员, 兼有复制后修复上位显性组的 RA D 3, 4 某些特性. 该基因编码268个氨基酸的蛋白质, 并具有一般认定的核苷酸结合位点 结 GK S 5 构域; 单倍体细胞中该基因缺失则细胞死亡, 说明该基因的功能是细胞存活所必需的. 研究 啤酒酵母细胞基因功能常用的分子遗传学方法是, 首先将细胞中目的基因删除, 然后观察细胞 在缺失目的基因后表型的变化. 但对于细胞存活所必需的基因来说, 该研究方法受到了限制, 因为必需基因删除后, 细胞不能存活, 无从观察其表型. 研究这类基因的方法是采用近年来发 展起来的质粒替换技术, 该技术的基本原理是, 首先将野生型的目的基因克隆到带有可选择记号 的质粒上, 转化酵母细胞, 然后用同源重组的方法使基因组中的目的基因缺失. 由于 3U RA 细胞含有野生型的目的基因备份, 故细胞缺失必需的目的基因后仍能存活. 再在细胞内引进含 突变的目的基因质粒, 最后用选择培养法使野生型的质粒丢失, 细胞内只剩下突变的目的基因. 本文报道用质粒替换技术分离 基因温度敏感突变株, 并对其特性进行了研究. 24 RA D 1 材料与方法 111 材料 1111 1菌 株 和 质 粒: E. col iD H 5 Α 为 本 室 保 存, 酵 母 细 胞 H Y 684 见 文 献〔5 〕, 本 室 保 存. 364 为 的 衍 生 质 粒, 带 标 志 基 因, 363 为 的 衍 生 质 粒, 带 111 1 33 pRB YCp lacT rp pRB YCp lac 6 标志基因, 见文献〔5〕, 由本室保存. 215由 博士提供, 该质粒含117 31U ra p SZR o b e r t Sch ie st 3基因的 I 片段. 2414为 含有312 24基因 , 片段, 本室构 18k b H isB am H pR pU C k b RA D H in d 建和保存. 11112 工具酶及试剂: 所用工具酶如未特殊说明均为 P rom ega 公司产品, 52FOA 系 PCR In 2 () 公司产品, 酵母含氮碱 无氨基酸及硫酸铵系 公司产品, 酵母浸出汁、胰蛋 co rpo ra ted D IFCO 白胨为 公司产品, 酵母细胞营养缺陷型合成培养基所需氨基酸均为 公司产品. O XO ID S igm a 112 方法 11211 质粒构建 () 1将312 的 基因克隆到 载体上, 命名为 243631.k b RA D pRB p T S 57( ) 2分离312 的 基因片段 24用羟胺处理, 再将其克隆到 载体上命名 , 364k b RA D pRB 为 2.p T S ( ) 3分离 中117 的 片段, 将其克隆到 14的 位点, 命名为 215I 24I p SZk b B am H pR B am H () 用适当的内切酶使其线性化后 不需纯化保存备用. 3. p T S 11212 酵母转化 8 酵母细胞转化基本参照 等人报道的方法进行. 先将 转化 在合成培养 1684, Ito p T SH Y () 基 2上筛选阳性克隆再依次转化 及 最后在含有52的培养基上培养使带 23, U ra p T Sp T SFOA 9 有 基因的质粒丢失.3U ra 11213 转化细胞温度敏感表型的分离 随机挑出上述转化平皿内单个菌落分别置于盛有少量 ( 无菌水的96孔板中 每次至少挑出 ) 3 000个菌落, 用印影法分别置于37?和28?培养3 , 观察菌落在两种温度条件下生长情况.d11214 24基因温度敏感突变株 、及蛋白质合成的研究 RA D DN A RN A 333分别用2、2和2掺入法观察 2和 、及蛋白质 243 684H T dRH U R H L eu rad t sH Y DN A RN A ( ) 合成速率 与野生型比较. 实验时取对数生长期细胞用 培养基稀释后加相应同位素至Y PD 20 ƒ后收集细胞, 液体闪烁计算测其 值., 8 ΛC im lh cpm 11215 紫外生存试验 按文献〔10〕的方法进行. 2 结果 质粒构建过程中载体骨架及插入片段见 1. T ab le 1 Table Co n st ruc t io n o f recom b inan t P la sm id s P la sm id In se r t V ec to r p T S1 pRB 363 312 k b H ind , f ragm en t o f RA D 24 gene p T S2 pRB 364 312 , 24 k b H ind f ragm en t o f RA D gene m u ta ted by h yd ro xy lam ine 1424 pR p T S3 117 , 3k b B am H f ragm en t o f H is 1为质粒构建酶切图谱鉴定结果;F ig. . 2为 基因温度敏感突变株的分 24 F igRA D 离结果, 共筛选大约10 000个菌落, 获得三 个温度敏感表型, 第二轮筛选时其中2个克 隆恢复了温度抗性, 剩下的一个为稳定的 温度敏感表型, 命名为 2在37?不 243, rad t s ( )能生长 见 为 2的. 2. . 3 243 F igA F igrad t s 及蛋白 质 合 成 变生物大分子 、 DN A RN A 化直方图, 由图可以看出, 与野生型相比, 该突变株的 、和蛋白 质 的 合 成DN A RN A 分 别 降 低 40% 、38% 和 21%.. 4 为 F igU V 生存试验结果, 由图可以看出 2对 243 rad t s 紫外线高度敏感, 而将野生型 基因 24 RA D E le t rop ho re t ic p ro f ile s o f p la sm id co n st ruc t io n o n F ig. 1 aga ro se ge l 质粒转化 2后, 则又恢复了紫外线243 radt s 11I3 p T Scu t w ith B am H 抗性. 21,2 p T Scu t w ith H ind 31,1 p T Scu t w ith H ind 41,: ƒM a rk e rΚDN A H ind 2. 2 24 F igIso la t io n o f tem p e ra tu resen sit ive m u tan t s o f RA D gene () 37?A T ran sfo rm ed st ra in g row th a t () 28?B T ran sfo rm ed st ra in g row th a t F ig. 3 DN A , RN A and p ro te in syn th e sis in H Y684 and 2423radt s 3( )1 2: 2and DN A syn th e sis H T dR inco rpo ra t io n 3( )3 4: 2and RN A syn th e sis H U R inco rpo ra t io n 3( )5 6: 2and p ro te in syn th e sis H L eu inco rpo ra t io n . 4 2F igU V su rv iva l te st : 684A H Y : 2423 24 Bradt sw ith p la sm id co n ta in ing w ild typ e RA D gene C: rad242t s3 3 讨论 我们继克隆出 基因后, 为研究该基因的必需功能, 即该基因缺失后细胞不能存活 24RA D 的机理, 用质粒替换技术建立了该基因的温度敏感突变株, 该突变株的 、及蛋白质 DN A RN A 的合成均较野生型明显降低, 其中 合成受到抑制说明 基因与复制有关, 结合突 24DN A RA D 变株对 高度敏感这一特性, 提示该基因参与重要的切除修复途径, 在切除修复过程中起 U V () 必不可缺的作用. 到目前为止, 在已克隆的诸多 修复基因 中, 包括 在内,24DN A RA D RA D 11 除参与() 只有3个是细胞存活所必需的基因. 另外两个必需基因 3和 25 又称 2RA D RA D SSL 切除修复外, 其编码的蛋白质尚具有 解旋酶的活性, 且为 聚合酶? 驱动的转录因 DN A RN A 12 子 的亚单位. 242的 合成明显降低提示该基因产物参与 的转录3? T F H rad t sRN A RN A 转录过程的确切机制有待于进一步研究, 但本文获得的突过程. 虽然 基因参与 24 RA D RN A 变株为今后研究 校正基因及用人的野生型基因组文库转化突变株, 从回复突变表型中 24RA D 克隆人的 同源基因提供了重要材料.24RA D Ref eren ce s , 1972, 16: 853, 863 , . . 1 Co x B SGam e J CEp ista t ic in te rac t io n be tw een fo u r rad lo c i in yea stM u ta t R es, . . , 1990, 2: 311, 320H eo ijm ak e r s J Boo t sm a DM o lecu la r gene t ic s o f euk a ryo t ic DN A exc isio n rep a irC ancer cel ls 2 , . . : , , . H ayne s R H Kunz B ADN A rep a ir and m u tagene sis in yea stInS t ra th e rn J Jo ne s E B ro ach J ed sT h e m olecu la r biolo2 3 : . : , gy of th e y east S acch a rom y ces cerev isiael if e cy cle and inh er itanceN ew Yo rkCo ld Sp r ing H a rbo r L abo ra to ryco ld , 1981: 371, 414Sp r ing H a rbo r . 2. : , , .Gam e J CR ad ia t io nsen sit ive m u tan t s and DN A rep a ir in yea stInSp ence r J F T Sp ence r D M Sm ith A R W ed s 4 . : 2, 137, 1983: 109Y east g eneticsN ew Yo rkSp r inge rve r lag ( 朱应葆, , . 修复基因 的分子克隆和序列分析. 生物化学杂志 224, P rak a sh L P rak a sh SDN A RA D Zh u Y ingB ao P rak a sh 5 ) , . 24. , 1995, 11: 541, 550L P rak a sh SM o lecu la r c lo n ing and sequenc ing o f DN A rep a ir gene RA D C h in B ioch em J , , . . : , T e r ry L Szo stak J W T o th ste in R JGene t ic app lica t io n s o f t ran sfo rm a t io n w ith linea r and gapp ed p la sm idInW u R . , . 101. : , 1983: 228, 245G ro ssm an L ed sM eth od s in E nzym ology vo lN ew Yo rkA cadem ic P re ss 6 , . : . : , Ro be r t SBo ek e JI n v itro m u tagene sis and p la sm id sh uff lingf rom c lo ned gene to m u tan t yea stInGu th r ie C F ink G R . , . 194. : , 1991: 281, 301ed sM eth od s in E nzym ology vo lSan D iegoA cad im ic P re ss 7 , , , . . ,Ito H F uk uda YM u ra ta K K im u ra AT ran sfo rm a t io n o f in tac t yea st ce lls t rea ted w ith a lk a li ca t io n sJ B acter iol 1983, 153: 163, 168 8 () P a rk E , C uzde r S, Ko k en M , J a sp e r s2D ek k e r I, W eeda G, P rak a sh S, P rak a sh L. 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