铜离子活化海绵状镉微型柱层析法测定血清中一氧化氮

铜离子活化海绵状镉微型柱层析法测定血清中一氧化氮 广西师范大学学报 微型化学实验专辑JOU RN A L O F GU A N GX I N O RM A L U N IV ER S IT Y 2000 年 6 月 铜离子活化海绵状镉微型柱层析法测定 血清中一氧化氮 12 邓樊健华 ( )11 衡阳医学院化学教研室, 湖南 衡阳 421001; 21 中南工学院 () 摘 要: 目的: 建立血清一氧化氮 间接测定方法. 方法: 用铜离子活化海绵镉微型柱层析法将血清中的硝 N O - -- -() () 酸盐 3 还原为亚硝酸盐 , 再通过 反应测定 总量以反应体内水平. 结果: 在 ƒN O N O G r ie ss N O 3 N O 2 N O 2 - 17 时, 活化海绵镉还原 3 能力强、速度快、抗干扰性好, 还原率 9614%, 10010% , 检测范围 0, 9pH N O - 1 - 1 - 400 ?, 检测限为 1185 ?, 相对标准偏差为 2156%, 3146% , 对3 的回收率为 9614%, Λm o lL Λm o lL N O - - - ( ) 10212% , 对2 的回收率为 9512%, 10113% , 对3 95?5 的回收率为 9817%, 10414%. 测定 89 ƒ2 N O N O N O 例正常人、19 例肝硬化病人、22 例糖尿病人和 41 例肺结核病人血清水平, 结果均令人满意. 结论: 该方法 N O 具有简便快速、灵敏准确、样品和试剂用量小等优点, 可在临床推广应用. 关键词: 一氧化氮; 硝酸盐; 镉; 分光光度法; 生物化学检验 () 一氧化氮 作为新的神经递质和血管舒张因子, 近年来倍受医学界的重视. 由于在人体内 N O N O - -1 ( ) 总量, 因此测定ƒ 2 3 3 2 N O N O 更能反映体内水平. 目前间接测定血清中的光度分析方法主要有金属镉还原法, 包括铜离子活 N O N O 2, 3 4 化镉粒还原法和海绵状镉柱层析法两种. 前者由于镉颗粒大, 比表面小, 致使还原时间长, 还原效 率低; 后者虽然镉的比表面大, 还原速度较快, 但存在抗干扰性能较差等缺点. 我们结合两法的优点, 采 -- - 用铜离子活化海绵状镉微型柱层析法将样品中 还原为, 再用 试剂测定 2 2 总量, 从N O 3 N O G r ie ss N O 而间接测定血清中含量, 取得满意结果. 报道如下: N O 1 材料与方法 111 试剂 - 1 - 1 - 1 75 ?硫酸锌溶液; 55 ?氢氧化钠溶液; 012 ?甘氨酸—氢氧化钠缓冲液 mm o lL mm o lL m o lL - 1 - 1 (() ) 9; 17; 5 ?硫酸铜溶液 用 012 ?甘氨酸2氢氧化钠缓冲液配制试剂: 014% pH mm o lL m o lL G r ie ss ( ) 对—氨基苯磺酸溶液 用 20% 盐酸配制, 012% 盐酸萘乙二胺溶液; 标准液: 分别用双蒸水准确配制 - 1 - - 110 ?亚硝酸钠、硝酸钠贮存液, 用时稀释成所需浓度; 混合标准液: 按3 2 = 95?5 的ƒmm o lL N O N O 比例配制成所需浓度. 112 仪器 () ()723 型分光光度计上海第三分析仪器厂, 离心机 上海手术器械厂. 113 方法 ?微型海绵状镉柱的制备: 在 50 20% 硫酸镉溶液中投入足量的锌皮, 反应 2, 3 , 然后用玻棒 mL h 轻轻刮去锌皮表面的金属镉, 使镉沉底, 弃去锌皮及上清液. 采用倾泻法用水多次洗涤, 然后转入组织捣 碎机中, 加适量水, 捣碎 20, 30 , 用水将金属细粒洗至标准筛上, 取 40, 60 目之间的部分. 用水装满 1 s 支 015 ×15 带磨沙漏斗底的微型层析柱, 在轻轻敲击下加入海绵状镉至 5 高, 上面用一薄层 cm cm cm - 1 玻璃棉覆盖. 镉柱装好后, 依次用 1 011 ?盐酸、5 蒸馏水洗涤, 最后用水封盖镉层待用.mL m o lL mL - 1 - 2 ?血清去蛋白质: 取 100 ΛL 血清加 014 mL 75 mm o l?L 硫酸锌溶液、016 mL 55 mm o l?L 氢 氧化钠溶液, 充分混匀, 离心. - 1 ?海绵镉活化: 取 1 5 ?硫酸铜溶液流经镉柱, 再用 3 甘氨酸缓冲液冲洗镉柱. mL mm o lL mL -( ? 的还原: 取 400 去蛋白上清液和 150 甘氨酸缓冲液混匀后, 流经镉柱还原 自然流出 N O 3 ΛL ΛL ) 时约 1 ƒ用蒸馏水洗涤镉柱, 一并收集于刻度试管中, 定容至 2 . , mL m in mL 空白管及标准管分别用蒸馏水, 标准液或混合标准液代替血清, 按?, ?步骤操作, 分别得到镉还 原空白液和镉还原标准液. - 1 实验完毕, 用 1 011 ?盐酸洗涤镉柱, 再用 5 蒸馏水洗去酸液, 最后用水覆盖镉柱.mL m o lL mL 经此法处理的镉柱可反复使用. - 总量测定按表 1 操作.?测定: 2 N O - 表 1 测定操作步骤 NO 2 加入成分()()() 空白 标准 测定 mL mL mL 镉还原空白液210 镉还原标准液 210 镉还原样本液 210 012% 对—氨基苯磺酸 14 0014 014 混匀, 室温放置 5 m in 012 011% 盐酸萘乙二胺 012 012 混匀, 室温放置 15 , 用 1 比色杯在 550 处, 空白管调零, 测定吸光度. 按下式计算血清中 m in cm nm 的含量:N O - 1 () () ?= ?×.N O Λm o lL A 样本A 标准C 标准 2 结果与讨论 ?吸收曲线: 按实验方法用 723 型分光光度计进行光谱扫描测定, 所得标准和样品的吸收曲线十分 4- 1 - 1 吻合, 最大吸收波长为 550 . 最大表观摩尔吸光系数 = 1171 ×10??. 本法选定nmΕ550 nm L m o lcm 550 为测定波长.nm - ?还原率: 分别测定 6 个不同浓度的 标准液, 按上述方法经镉柱还原后, 测定还原率, 并与未N O 3 ( ) () 经铜离子活化的镉柱 以下简称镉柱法进行比较. 活化镉柱法还原率 % 为 10010, 9810, 9617, 9715, () 9618, 9614, 平均 97157?1133; 而镉柱法还原率 % 为 9117, 8510, 8112, 7518, 7417, 8019, 平均 81155 ?6125. ?线性与检测限: 按实验方法测定系列不同浓度的标准混合液的吸光度, 将结果进行回归分析, 得 - 1 - 4 - 4( ) 吸光度 与浓度 ?之间的回归方程为: = 8. 2×10+916×10, 相关系数 = A N O C Λm o lL A C r - 1- - 0. 999 7. 以 3 倍空白值的标准偏差计算方法的检出限为 1185 ?. 3 ƒ2 浓度在 0,Λm o lL N O N O - 1 400 ?线性关系良好. Λm o lL - ?对活化镉柱还原作用的影响: 在 时, 活化镉柱还原 < 8 pH pH N O 的能力较低, 随着 值增 3 pH 大, 还原能力增强, 但当待测液 15 时, 其还原能力又迅速下降, 为 917 时, 还原作用最强. 本 > 10pH pH 法选用 17 的甘氨酸缓冲体系.9pH - 1 θ ?精密度: 取混合血清样品分为两组, 一组平行测定 11 管, x?s= 60. 90?1. 56 Λm o l?L , CV = θ 2. 56% ; 另一组分管冰冻保管, 每日测定 3 管, 取平均值, 连续测定 10 天, 结果为 ??2. 13= 61. 58xs - 1 ?, = 3. 46%.Λm o lL CV - --- 标准液和ƒ ?准确度: 分别将 标准液、 3 2 混合标准液加入待测样品中, 测定回收2 N O N O N O 3 N O 率, 结果分别为 9614%, 10212% , 9512%, 10113% 和 9817%, 10414%. - ?特异性: 测定了维生素 , 溶液对两种镉柱法还原3 的抑制率并与铜包被, C N a2H PO 4 N a2B 4O 7 N O 86 ? 1994-2013 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 5 镉粒法进行比较, 结果表明活化镉柱法抗, 的干扰性比镉柱法及铜包被镉粒法都有 N a2H PO 4 N a2B 4O 7 - 的还原, 试验方法对较大程度的提高; 其他常见阴阳离子的存在不干扰测定; 蛋白质的存在抑制 3 N O 样品先进行去蛋白处理, 可有效地排除蛋白质的干扰. - 1 θ( ?样品测定: 临床应用: 用该法测定 89 例正常人血清含量, 结果为 7912?1916 ?N O Λm o lL x ) ?, 测定 19 例肝硬化患者、22 例糖尿病患者和 41 例肺结核患者血清含量, 结果均显著性高于正 sN O () 常< 0. 001, < 0. 001 和 < 0. 05, 符合其病理过程, 同时也说明该方法能检测体内 代谢水平,P P P N O 可用于一般临床生化检验. ( 该方法结合了海绵镉柱还原法和铜离子活化镉粒还原法的优点, 具有还原速度快 还原时间仅 ()) 2 m in 、还原效率高 最高还原率达 100% 、抗干扰性能强、试剂和标本用量小, 且操作简便、结果准确, 2, 3 4 功效比镉粒法和镉柱法分别提高 30 倍和 5 倍以上. 参 考 文 献 1 M o sh age H , Ko k B , H u izcnga JR , e t a l. N it r ite and n it ra te de te rm ina t io n s in p la sm a: a c r it ica l eva lua t io n. C h in C h em , 1995, 41: 892—895 , . 2Co r ta s N K W ak id N W D e te rm ina t io n o f ino rgan ic n it ra te in se rum and u r ine by a k ine t ic cadm ium reduc t io n 2 . , 1990, 36: 1 440—1 443m e tho dC h in C h em 王成彬, 沈文梅, 田亚平等. 铜离子活化镉还原法测定血清中硝酸盐浓度. 中华医学检验杂志, 1996, 19: 281—2833 () 袁亚莉, 邓 健, 何爱桃等. 微型镉柱还原分光光度法测定血清中一氧化氮. 分析试验室, 1998, 17 5: 54—56 4 () 茅惠明. 血清中硝酸盐的镀铜镉还原测定法. 临床检验杂志, 1995, 13 1: 6—8 5 D E T ERM IN A T IO N O F N IT R IC O X ID E IN SERU M W IT H SPO N GY CA DM IU M B Y A C T IV A T ED CO P P ER IO N O N A M ICRO SCA L E CH ROM A TO GRA PH IC CO L U M N 1 2D ENG J ian FA N Hua (11, , 421001 ;D ep a r tm en t o f C h em ist ryH engyang M ed ica l Co llegeH engyang C h ina )21Zho ngnan U n ive r sity o f T ech no lo gy : : . : A bstra c tO b jec t iveT o e stab lish an a ssay fo r de tec t in g n it r ite o x ide in se rum in d irec t lyM e tho dN i2 t ra te w a s redu ced to n it r ite w ith spo n gy cadm ium b y ac t iva ted copp e r io n o n a m ic ro sca le ch ro 2 , . : m a to g rap h ic co lum n th en th e n it r ite w a s m ea su red b y th e G r ie ss reac t io nR e su lt sT h e cadm ium co l2 , 9. 7. um n h a s goo d v ita lityh igh sp eed an d low in te rfe ren ce fo r th e redu c in g reac t io n a t pH T h e redu c2 - 1 94. 6%, 100. 0%. 0, 400 ?, in g ra te s a re T h e lin ea r ran ge o f th e a ssay is Λm o l L th e lim it - 1 1. 85 ?. 2. 56%, 3. 46% , 96. 4%, 102. 2% , 95. 2%,Λm o lL T h e R SD s a re an d th e reco ve r ie s a re - -- -( ) 3 , 3 2 101. 3% ƒan d , 104. 4%95 ?598. 7%fo r N O N O 2 an d N O N O re sp ec t ive ly. T h e p ropo sed m e tho d h a s b een app lied to de te rm in e n it r ite o x ide in se rum f rom 89 h ea lth y p e r so n s, 19 p a t ien t s w ith , 22 41 . : live r c ir rho sisw ith d iab e te s an d w ith tu b e rcu lo sis w ith sa t isfac to ry re su lt sCo n c lu sio nT h is , , , m e tho d is ea syrap id an d p rec isen eed in g o n ly a sm a ll am o u n t o f sam p le an d reagen t san d can b e u sed .in c lin ica l a ssay : ; ; ; ; Key word sn it r ic o x iden it ra tecadm ium sp ec t rop ho tom e t ryb io ch em ica l a ssay () 责任编辑 李小玲