烟酸羟基化菌株睾酮丛毛单胞菌JA1抗性质粒的消除

烟酸羟基化菌株睾酮丛毛单胞菌JA1抗性质粒的消除 烟酸羟基化菌株睾酮丛毛单胞菌JA1抗性 质粒的消除 第30卷第2期 2007年6月 南京师大(自然科学版) JOURNALOFNANJINGNORMALUNIVERSITY(NaturalScienceEdition) Vo1.30No.2 Jun,2007 烟酸羟基化菌株睾酮丛毛单胞菌 JA1抗性质粒的消除 杨瑶,袁生,尚广东,戴亦军 (江苏省生物多样性和生物技术重点实验室,南京师范大学生命科学学院微生物重点实验室,江苏南京210097) [摘要]睾酮丛毛单胞菌JA1可羟基化烟酸产生6一羟基烟酸,并且对多种抗生素具有抗性.碱变性法提取 JA1细胞内的质粒,检测到一个约l9kh大小的质粒.用0.0025%SDS进行质粒消除实验,结果明,质粒消除 后菌株对卡那霉素敏感,但仍对氨苄青霉素,安普霉素和链霉素具有抗性,推测质粒携带卡那霉素的抗性基因. 同时,质粒消除后,JA1菌株烟酸脱氢酶酶活性没有变化,推测烟酸脱氢酶的基因并不在质粒上. [关键词]质粒消除,烟酸脱氢酶,ComamonastestosteroniJA1,抗生素抗性 [中图分类号]Q819[文献标识码]A[文章编号]1001-4616(2007)02--0077-04 EliminationoftheResistancePlasmidinNiconic AcidHydroxylationStrainComamonastestosteroniJA1 YangYao,YuanSheng,ShangGuangdong,DaiYijun (JiangsuKeyLaboratoryofBiodiversityandBiotechnology,KeyLabofMicrobialTechnolo gyintheSchoolofLifeScience NanjingNormalUniversity,Nanjing210097,China) Abstract:ComamonastestosteroniJA1,catalyzingthehydroxylationfromnicotinicacidto6 一hydroxynico— tinicacid,wasfoundtoresisttomanyantibiotics.AlkalinelysisextractionoftheJA1culturere vealsa19 kbplasmid.0.0025%SDStreatmentofthestraineliminatedtheextrachromosalplasmid.The mutants lostthekanamycinresistanceabilitywhilekeepingthenicotinicacidhydroxylationactivity. Keywords:plasmidelimination,nicotinicaciddehydrogenase,ComamonastestosteroniJA 1,antibiotic resjstance 0引言 6一羟基烟酸是一种重要的合成农药,医药,染料等化合物的中间体J,由于它广阔 的开发前景,利 用微生物转化生产6一羟基烟酸已成为国内外研究热点J.睾酮丛毛单胞菌JA1 是本实验室保藏的一 株具有很高烟酸生物转化产生6一羟基烟酸能力的菌株,它的发酵催化过程已作 报道. 烟酸经羟基化生成6一羟基烟酸是烟酸微生物代谢反应的第一步,该反应是由烟 酸脱氢酶催化的. 对该酶的基因进行克隆,能够揭示酶的性质和作用机理,也能够通过构建高活性的 转化工程菌,大幅度提 高6一羟基烟酸的生产效率.目前,很多对烟酸脱氢酶的研究都是从酶的分离纯化 开始的,但由于该 酶是个膜结合蛋白,分离工作难度很大.本实验室以睾酮丛毛单胞菌JA1为研究对 象,拟采用构建基因组 文库的手段筛选目的基因.在研究中,发现睾酮丛毛单胞菌JA1具有氨苄青霉素, 卡那霉素,安普霉素和链 霉素抗生素抗性,以上抗生素则不能作为筛选标记,需要通过多步分子生物学手段替换合适的筛选标记, 试验才能进行. 有报道指出很多细菌的抗生素抗性是由内源性质粒引起的_l".因此,本文利用质粒消除的方法,考 收稿日期:2006—10-20.修回日期:2006—11一l2. 基金项目:江苏省高校自然科学重大基础研究(06KJA21016),江苏省"六大人才高峰"(O6一C一014)资助项目. 作者简介:杨瑶(198l一),女,博士研究生,主要从事微生物转化的学习与研究.E—mail:cranny—yang@hotmail.com 通讯联系人:袁生(1956一),教授,博士生导师,主要从事微生物转化的教学与研究.E—mail:yuansheng@njnu.edu.cn 一 77— 南京师大(自然科学版)第30卷第2期(2007年) 察睾酮丛毛单胞菌JA1质粒与抗生素抗性的相关性,目的是获得对抗生素敏感的突变株,解决需要替换抗 性标记的问题. 1材料与方法 1.1菌株来源 本实验室保藏的是睾酮丛毛单胞菌C.testosteroniJA1菌株. 1.2菌株的纯化与活化 冻存管菌种接种于平板30?,48h后,转接人种子培养液中(在100mL锥形瓶中装液20mL),30? 摇瓶培养12h,以0.1%的接种量接人发酵培养基(在100mL锥形瓶中装液20mL),30?,200r/min培养 到对数期. 1.3抗生素抗性检测 选取5种不同的抗生素:氨苄青霉素,卡那霉素,四环素,安普霉素和链霉素,在LB培养基中加入不 同浓度的这5种抗生素,铺成平板,考察菌株在平板上的生长情况,已确定是否对抗生素存在抗性. 1.4质粒抽提及检测 根据文献?按碱裂解法进行质粒抽提.质粒DNA在0.8%的琼脂糖凝胶(含0.5g/mL溴化乙锭) 中电泳,电泳缓冲液为1×TAE,用美国BIO—RAD凝胶成像系统拍照保存. 1.5质粒的消除 取活化的菌种按1%的接种量分别接人含不同浓度SDS的LB液体培养基中,30?振荡培养24h后, 取50L培养液涂平板,30?倒置培养24h,进行菌落计数.取平板上生长的菌落,接种于3mL液体培养 基中,30?振荡培养过夜,按方法1.4进行质粒DNA的抽提和电泳检测,计算消除率. 1.6质粒消除后菌株生长特性的检测 1.6.1菌株对抗生素的抗性检测 按照方法1.3对消除后的菌株进行抗性检测.将质粒消除后的菌株挑单菌落于3mLLB培养基中, 30?摇床培养12h,取50L培养液涂布抗性平板. 1.6.2烟酸脱氢酶酶活的测定 取质粒消除后的菌株接人含1%烟酸的3mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中,30?培养12h,定量吸取 0.5mL菌液离心(5000r/min,10min),菌体用0.02mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)0.5mL洗涤一次,悬浮 于0.5mL此缓冲液中(含1%的烟酸).反应体系置于1.5mL离心管中,于30?振荡(200r/min)反应120 min.随后,反应液加热灭活(100?,5min),离心(5000r/min,10min)取上清供测试.在上述反应的条件 下,1min催化烟酸生成1Ixmol6一羟基烟酸所需的酶量定义为一个活力单位(U).转化产物6一羟基烟酸 的测定参照文献_l进行. 2结果与分析 2.1JA1菌株对抗生素的抗性 对JA1菌株抗生素抗性的实验结果表明,该菌株对氨苄青霉素,卡那霉素,安普霉素和链霉素均有抗 性,而对四环素没有抗性,如表1所示. 表1JA1菌株对抗生素的抗性 TablelTheantibioticsresistanceofJA1 注:++生长良好;一不生长. 2.2质粒消除剂浓度的确定 常用的质粒消除剂十二烷基苯硫酸钠(SDS)对JA1菌株的生长抑制情况见表1.SDS在对质粒进行消 除的同时,会对细菌的生长有抑制作用,按照实验需要,选择0.0025%的SDS对JA1菌株进行质粒消除. 一 78— 50"L菌数/个6.49 X109 3.23 X105 1321510 2.3质粒消除率 采用上述浓度的SDS对JA1菌株进行质粒消除, 在平板上随机选取12个菌落培养后进行质粒抽提, 结果见图1.JA1菌株含一个大小约为19kb的质粒, 在所挑选的12个菌落中,6号和9号菌落检测不到质 粒,可见SDS对JA1菌株的质粒有消除作用,质粒消 除率为16.7%.(为区别起见,将6号和9号菌编号为 JA1—6和JA1—9). 2.4质粒消除后菌株特性的变化 2.4.1菌株对抗生素抗性的改变 JA1—6和JA1—9在LB平板上生长正常,在含 氨苄青霉素,安普霉素和链霉素的LB平板上同样生 长良好,未受影响,而在含卡那霉素的LB平板上没有 生长.这个结果表明,抗生素氨苄青霉素,安普霉素 M:Ec0T14I标准相对分子质量参照物;0:JA1;1,12:菌落1—12 图1JA1菌株SDS消除后菌落质粒DNA的检出 Fig.1PlasmiddetectionofthestrainsgeneratedbySDS treatmentofJA1 和链霉素的抗性与这个质粒没有关系,可能是由染色体编码的,而抗生素卡那霉素的抗性则与这个质粒 有关,可能抗性基因位于质粒上. 2.4.2菌株对烟酸脱氢酶酶活的改变 对JA1—6和JA1—9按方法1.7.2进行了烟酸脱氢酶活的测定,与质粒未消除的菌株JA1羟基化酶 活相比较.结果表3表明,质粒消除后,菌株的烟酸脱氢酶酶活不改变,可见,烟酸脱氢酶活的基因不在质 粒上. 采用2均数差异显着性t检验统计分析,T=1.0874和1.0089(P>0.05)差异不显着. 表3质粒消除前后烟酸脱氢酶活性比较 Table3Thechangeofthenicotinicacidhydroxylationactivityafterplasmidcuring 3讨论 已报道的质粒消除的方法很多,包括物理法,化学试剂法,抗生素法等19].由于结构及生理上的独特 性,不同菌株的质粒消除机制各不相同,目前尚没有普遍适用的质粒消除方法.本文采用的是十二烷基苯 硫酸钠(SDS)法,SDS是一种离子型表面活性剂,在合适浓度下它能溶解膜蛋白,破细胞膜,可改变质粒在 细胞膜上的结合位点,使其不能精确复制,并最终导致质粒不能正确地分配到子细胞中,从而达到消除质 粒的目的[191.相比与吖啶橙,嗅乙啶等可致癌的化学消除剂,SDS是安全可靠的常用的化学消除剂. 本文通过质粒消除的方法得到JA1—6和JA1—9两个稳定的对卡那霉素敏感的突变菌株.在进一步 研究中,可以直接利用JA1—6和JA1—9两菌株作为实验材料,而卡那霉素抗性则可作为筛选标记应用在 高通量的筛选中.JA1—6和JA1—9对卡那霉素敏感,但仍具氨苄青霉素,安普霉素和链霉素抗性,推测卡 那霉素的抗性基因在质粒上,而氨苄青霉素,安普霉素和链霉素的抗性基因可能在细菌的染色体上. 有报道指出很多有机污染物降解菌的污染物降解特性是由菌体细胞内的质粒控制的,或者与质粒有 关.-22].在本实验中,质粒消除后,JA1菌株烟酸脱氢酶酶活性没有变化,推测JA1菌株质粒上并不携带 编码烟酸脱氢酶的基因,因此该基因的筛选还应该从基因组DNA人手. ...—— 79---—— 南京师大(自然科学版)第3O卷第2期(2007年) [参考文献] [1]YoshidaT,NagasawaC.EnzymaticfunctionalizationofaromaticN—heterocycles:hydroxylationandcarboxylation[J].J BiosciBioeng,2000,89(2):111—118. 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