雌激素对紫外线作用下人永生化角质形成细胞的保护作用

雌激素对紫外线作用下人永生化角质形成细胞的保护作用 作者:仇金鹏 李澄 任明 胡玉琳 佟倜 王艳姝 【摘要】 目的 探讨雌二醇(17βE2)对中波紫外线(UVB)照射下人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)的保护作用。方法 将体外培养的HaCaT细胞随机分为3组:正常组、UVB组、E2组，分别加入不同的处理因素，UVB组在UVB灯下照射6 min后继续培养，E2组照射前预先给予17βE2使其终浓度达107 mol/L，正常组不加处理因素;照射结束后继续培养12 h后收集细胞，测定各组细胞的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平以及细胞内钙离子浓度和细胞线粒体膜电位的变化。结果 与正常组比较，UVB组和E2组细胞线粒体膜电位显著降低(P<0.05)，细胞内钙离子浓度显著升高(P<0.05)，SOD水平显著降低(P<0.05)，MDA水平显著升高(P<0.05);与UVB组相比较，E2组细胞线粒体膜电位显著升高(P<0.05)，细胞内钙离子浓度差别不显著(P>0.05)，SOD水平显著升高(P<0.05)，MDA水平显著降低(P<0.05)。结论 17βE2可通过抗氧化和抗凋亡作用拮抗UVB引起的HaCaT细胞损伤，对UVB照射下的HaCaT细胞具有保护作用。 【关键词】 17βHaCaT细胞;中波紫外线(UVB) 接触过多的紫外线可以使人类的皮肤癌、白内障等疾病的发病率升高。紫外线可以通过损伤皮肤细胞DNA，诱发自由基和细胞因子/炎症趋化因子的产生，产生脂质过氧化损伤对皮肤造成光损伤导致皮肤衰老甚至引发皮肤癌〔1,3〕。雌激素作为一种甾体类激素，可以通过影响皮肤厚度、湿度、弹性、血管供应、色素沉着来阻止皮肤老化，在抗皮肤衰老方面，有其独到之处〔4，5〕，有研究表明雌激素可以抑制氧自由基(ROS)产生，减少氧化应激，具有一定的抗氧化和抗凋亡作用〔6〕，然而对于雌激素对人角质形成细胞(HaCaT细胞)是否具有保护作用，通过什么途径进行保护还知之甚少。因此，本实验预先用雌二醇(17βE2)处理HaCaT细胞来观察其对中波紫外线(UVB)照射导致细胞损伤的影响，探讨雌激素的作用机制，为研究皮肤光老化发生中17βE2的作用提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 RPMI1640培养基、胰蛋白酶(Gibco，美国)、台盼蓝(Amresco，美国)、MDA试剂盒(南京建成)、DMSO(Sigma，北京鼎国分装，美国)、FAC Scan流式细胞仪(Bection Dickinson FACScalibur，美国)、生物显微镜(CH型，OLYMPUS，日本)、UVB灯(15W，上海顾村光电仪器厂)、Fluo3/AM(Biotium，美国)、罗丹明 123(Sigma，美国)。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 HaCaT细胞在37?、5%CO2条件下培养于含10%标准胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中。当细胞融合至85%,90%时传代，弃掉培养液，PBS冲洗2遍，用0.25%胰酶常规消化，用含血清的培养液迅速终止消化，制成单细胞悬液。细胞计数，按1×105接种于100 mm培养皿中备用。 1.2.2 分组及处理 当培养皿内细胞融合达60%左右时，将细胞随机分为正常组、UVB组、17βE2组。弃掉旧培养液，用高压灭菌的PBS冲洗3遍后，正常组和UVB组加入含1%FBS的10 ml RPMI1640培养液，17βE2组加入5 μl 0.2 mmol/L雌激素+含1%FBS的10 ml RPMI1640培养液，放培养箱中继续培养24 h后弃掉旧的培养液，用高压灭菌的PBS冲洗3遍，向每个平皿内加入4 ml PBS，使之能浸没整个平皿底。UVB组和17βE2组打开平皿盖在15 W的UVB灯正下方照射6 min，正常组细胞用锡纸盖住。照射后，立即弃掉平皿内PBS，加入4 ml 4?预冷的PBS冲洗3遍。之后加入RPMI1640培养液于培养箱继续培养12 h后收获各组细胞备用。 1.2.3 细胞内钙离子 ( ,Ca2+, i) 浓度测定 将各组细胞常规消化后制成单细胞悬液，用PBS调整细胞计数至106个/ml。取含有5×105个细胞的悬液至1.5 ml微量离心管中;向微量离心管中加入Fluo3/AM Ester(终浓度5 μmol/L)，混匀;在37?孵箱中避光反应45 min后用PBS洗涤2次(1 500 r/min，5 min);在流式细胞仪(FCM)检测，检测条件为激发波长488 nm、发射波长530 nm。 1.2.4 细胞线粒体膜电位(?Ψm)测定 各组细胞消化后制成单细胞悬液，用PBS调整细胞计数至106个/ml。取含有5×105个细胞的上述细胞悬液至1.5 ml微量离心管中;向微量离心管中加入Rh123(终浓度5 mg/L)，混匀;在37 ?孵箱中避光反应45 min后PBS洗涤细胞 2次(1 500 r/min，5 min);在流式细胞仪(FCM)检测，检测条件为激发波长488 nm、发射波长530 nm。 1.2.5 总超氧化物歧化酶(SOD)测定 细胞中SOD能清除超氧阴离子自由基(O22)，保护细胞免受损伤。受UVB照射后的细胞超氧阴离子自由基增高，细胞中SOD对自由基 进行清除从而含量减少。O22可氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含有SOD 时，则对O2有专一性抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管吸光度，通过公式可以 计算 出被测样品中的SOD活力。 总SOD活力(U/ml)=对照管吸光度-测定管吸光度对照管吸光度?50×反应体系的稀释倍数×样本测试前稀释倍数。