[精品]行为学评估兔脊髓分级缺血再灌注损伤后肢功能的研究

[精品]行为学评估兔脊髓分级缺血再灌注损伤后肢功能的研究 行为学评估兔脊髓分级缺血再灌注损伤后肢功能的研究 【中图分类号】R651.2 【文献标识码】A 【文章编号】1672,3783(2012)03,0044 ,01 【摘要】 目的 建立兔脊髓缺血再灌注损伤模型，观察其行为功能改变，探讨发生脊髓 缺血再灌注损伤的时间窗, 为治疗提供实验数据。方法 40只新西兰大白兔随机分为假手术 组、缺血15min组、缺血30min组、缺血45min组和缺血60min组，每组8只。采用肾下腹 主动脉阻断法,建立脊髓缺血再灌注模型。术后采用Reuters法对后肢感觉和运动反射功能评 分，Jacobs 和Rivlin法对后肢运动功能分级。 结果 术后Reuter评分值总体变化趋势为缺 血60min组>缺血45min组>缺血30min组和缺血15min组。Jacobs和Rivlin评分值总体变 化趋势为缺血15min组和缺血30min组,缺血45min组,缺血60min组。 结论 本模型是一 种较理想的脊髓缺血损伤模型。阻断腹主动脉血流30，45，60min可以模拟出轻、中、重不 同程度局部脊髓缺血再灌注损伤。脊髓缺血时间越长，后肢运动功能损害越明显，脊髓缺血 再灌注损伤的时间窗为30-45min。 【关键词】 脊髓 缺血/再灌注损伤 时间窗 行为医学 Evaluation of the functions of hindlimb in rabbit graded spinal cord ischemia/reperfusion injury by ethology Liu Chong1,Shi Jin-shan1,Zhang jian-ping1,Feng ya-ping1,Zhang fang-xiang1,FANG Hua1,2*,Wang Quan-yun2.(1.Department of Anesthesiology Guizhou Provincial People,s Hospital, Guiyang 550002,China;2.Department of Anesthesiology,West China Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041,China) 【Abstract】 Objective To make a ischemia/reperfusion injury model of spinal cord and investigate the relationship between time window of spinal cord ischemia/reperfusion injury and extent of function changes of behavior in rabbits. Methods 40 rabbits were equally randomized into the sham-operation group、ischemia for 15 min、30min、45min and 60min group. The spinal cord ischemia-reperfusion model was made by clamping the infrarenal aortic in rabbits. The sensory、motor and reflex functions of spinal cord were evaluated after reperfusion by the Reuters method and neurological functions of hind extremities were scored after reperfusion through the Jacobs and Rivlin method. Results The Reuter’s score during reperfusion from the highest to the lowest in the order was generally ischemia for 60 min group、ischemia for 45 min group、ischemia for 30 min group( andischemia for 15 min group ). The Jacobs and Rivlin score during reperfusion from the highest to the lowest in the order was generally ischemia for ischemia for 30 min group( andischemia for 15 min group ) 、 ischemia for 45 min group、60 min group. Conclusions It is a very good model of ischemia-reperfusion injury in spinal cord.Mild , moderate and severe ischemia-reperfusion injury of regional spinal cord ischemia can be simulated by the occlusion of the infrarenal aortic for 30 minutes , 60 minutes and 90 minutes respectively.The motor funtion of rabbit hind limbs was significantly worsened due to prolonging the ischemic time. The time window of spinal cord ischemia-reperfusion injury is limited from 30 to 45 min. 【Key words】 Spinal cord;Ischemia-reperfusion injury;Time window;Behavior 在脊髓损伤动物模型的研究中，建立临床相似性好、可重复、可操作、更客观的动物模型后，对机体的运动、感觉、反射功能的神经行为学评价能够直接反映脊髓的损伤程度及外周行为功能的改善情况,,,1,,。本实验通过建立不同脊髓损伤程度的新西兰大耳白兔脊髓缺血再灌注损伤模型，观察后肢运动及感觉情况并进行神经行为学评分，旨在进一步探讨脊髓缺血再灌注损伤后脊髓功能恢复的水平及其与神经行为学评分之间的关系。 材料与方法 1 实验动物分组及动物模型的建立:4-6月龄健康纯种新西兰大耳白兔40只(四川大学实验动物中心提供)，体重2.0-2.5kg，雌雄不拘，随机分为五组,假手术组(C0)、缺血15min组(C15)、缺血30min组(C30)、缺血45min组(C45)和缺血60min组(C60)，每组8只。采用左肾动脉下方腹主动脉阻断法建立脊髓缺血再灌注损伤模型,,,2,,。证实钳夹点以下腹主动脉搏动完全消失后,各缺血组分别阻断15min、30min、45min和60min后松夹，恢复灌注，逐层关腹，再灌注均为48小时。术中用温盐水纱布敷盖腹腔脏器，肛温维持在36-37?，麻醉维持根据手术过程中动物的反应，追加初始剂量的1/3-l/2。动物麻醉后即耳中动脉穿刺持续监测平均动脉压(MAP)、心电图(ECG)、经皮脉搏氧饱和度(SpO2)及肛门温度。i-STAT血气仪(美国)测定动脉血气。C0只进行手术操作，不阻断腹主动脉，后期手术操作同缺血组。动物清醒后归笼饲养，饲养室保持室温在24?-26?。 2. 观察指标:后肢运动功能评分参照Jacobs分级,,,1,,，采用5分制法测定再灌注6小时、12小时、24小时和48小时动物后肢运动功能。以0,3级为截瘫标准,计算出各组动物的截瘫率。 后肢感觉和运动反射功能评价根据Reuter等评分标准,,,2,,，综合评价再灌注6小时、12小时、24小时和48小时动物后肢感觉、运动反射功能。参考文献,,,3,,略加改进，测定再灌注6小时、12小时、24小时、48小时斜面临界角度均值及再灌注48h斜板障碍率。斜板由两块100cm×40cm矩形的合金板通过铰链于一端相连而成，一块作底板，另一块为移动板，表面铺约6 mm厚的橡胶垫。板从水平位置(00) 起绕轴旋转，斜板基底部放置一测量角度的量角器，斜面角度可以测出。兔俯卧于移动板上，身体纵轴与斜板横轴垂直放置，头侧逐渐抬高以增大移动板与底板间的角度，直至出现动物向下滑行时，记录临界角，每例均测试3次，取其平均值。以评价动物后肢的负重能力。为了排除麻醉及手术等影响，采用斜板功能障碍率来评价，计算公式参照文献如下,,,4,,:斜板障碍率(%)=(麻醉前度数-脊髓损伤后度数),麻醉前度数×100%。 3 统计学方法:数据资料以均数?标准差(x?s)表示，多组间神经行为学评分采用非参数检验(Kruskal-wallis)进行分析，使用 Mann-whitney u检验比较。斜板障碍率的比较采用卡方检验。统计软件为SPSS13.0。 结 果 1. 动物模型生理参数:手术过程中各组肛温、MAP、心率、SpO,2、呼吸频率、血糖和血气分析指标均在正常范围内。 2. 术后动物一般情况观察:动物手术后2h内完全清醒。观察时间内，所有动物手术切 口均愈合良好，无感染，均无意外死亡。根据Jacobs分级标准,,,1,,，假手术组动物后肢均未发生瘫痪。缺血15min组和缺血30min组动物术后自主排便排尿功能逐渐恢复，再灌注48h时后肢均无明显瘫痪，截瘫率均为0(0/8);缺血45min组和缺血60min组动物术后活动减弱, 饮食量减少，伴有腹部胀气、大小便功能障碍及双后肢肌张力明显降低等表现，再灌注48h时两组动物后肢出现为不同程度、不同类型的截瘫，可分为伸肌瘫痪、屈肌瘫痪和混合性瘫痪三种类型，截瘫率分别为87.5%(7/8)和100%(8/8)。 3. 后肢运动功能的评估 :Jacobs分值越高动物后肢功能越接近正常。除假手术组各时间点后肢功能正常外，随着脊髓缺血程度的不同，各缺血组同时间点Jacobs分值显示出不同的差别;缺血15min组与缺血30min组各时间点组内和组间比较差异均无统计学意义(P,0.05);缺血45min组与缺血60min组同时间点Jacobs分值逐渐下降，组间比较差异均有统计学意义(P<0.01)，组内各时点间比较差异均无统计学意义(P,0.05)，两组分别与缺血15min组与缺血30min组组内和组间比较各时间点差异均有统计学意义(P<0.01)。 各缺血组的同时间点Jacobs分值大小总体变化趋势为缺血15min组和缺血30min组,缺血45min 。, 组,缺血60min组。见表1 表1 各时间点各组动物Jacobs评分均值(x?s，n=8) , 组 别 再 灌 注 时 间(h) 6 12 24 48 C0 5.00?0.00 5.00?0.00 5.00?0.00 5.00?0.00 C15 4.82?0.57 4.22?0.69 4.19?1.05 4.50?0.53 C30 4.57?0.66 4.26?0.95 4.13?0.61 4.15?0.83 C45 2.51?0.82,,,? ,2.35?0.65,,,?, 2.16?0.84,,,?, 2.68?0.81,,,?, C60 0.58?0.63,,,?? ,0.67?0.79,,,?? ,0.59?0.85,,,??, 0.55?0.51,,,?? , 注:与同期缺血15min组比较，,#P,0.05，,,,,,P,0.01; 与同期缺血30min组比较， ,?P,0.05，,?P,0.01;与同期缺血45min组比较， ,?P,0.05，,?P,0.01 4. 后肢感觉和运动反射功能评价:参照Reuter评分法,,,2,,，正常家兔后肢感觉和运动反射功能评分值为0分，全瘫时为11分，分值越高，说明后肢感觉和运动反射功能障碍越严重。假手术组各时间点后肢Reuter分值均为0分;再灌注各时间点，各缺血组动物后肢Reuter分值表现为不同程度的改变;缺血15min组与缺血30min组各时间点组内和组间比较差异均无统计学意义(P,0.05);脊髓缺血时间超过30min，各时间点Reuter分值逐渐增加，缺血45min组与缺血60min组间比较差异有显著性(P<0.01)，组内各时点间比较差异 均无统计学意义(P,0.05)。各缺血组同时间点Reuter分值大小总体变化趋势为缺血60min组,缺血45min组,缺血30min组和缺血15min组。见表2。 , 表2 脊髓缺血再灌注损伤后肢感觉和,运动反射功能评分值(x?s，n=8) , 组别 再 灌 注 时 间(h) 6 12 24 48 C0 0 0 0 0 C15 2.42?0.57 2.29?0.43 1.90?0.34 2.32?0.38 C30 3.38?0.61 2.84?0.36 3.12?0.58 2.42?0.76 C45 8.76?0.65,,,,?, 8.51?0.79,,,,?, 7.85?0.51,,,?, 8.26?0.62,,,?, C60 10.84?0.77,,,??, 10.63?0.45,,,??, 10.23?0.67,,,??, 9.63?0.62,,,??, 注:与同期缺血15min组比较，,#P,0.05，,,P,0.01; 与同期缺血30min组比较，,?P,0.05，,?P,0.01;与同期缺血45min组比较， ,?P,0.05，,?P,0.01 5 斜面临界角测定:假手术组平均斜面临界角度为67.82?7.650。再灌注各时间点，各缺血组动物斜面临界角度表现为不同程度的改变;缺血15min组与缺血30min组各时间点组内和组间比较差异均无统计学意义(P,0.05);脊髓缺血时间超过30min，各时间点斜面临界角度逐渐下降，缺血45min组与缺血60min组间比较差异有显著性(P<0.01)，组内各时点间比较差异均无统计学意义(P,0.05)。各缺血组同时间点斜面临界角度大小总体变化趋势为缺血15min组和缺血30min组,缺血45min组,缺血60min组。见表3。 6 再灌注48h斜板障碍率:假手术组48h斜板障碍率为0。各缺血组随着脊髓缺血时间的不同，再灌注48h时动物斜板障碍率逐渐增加。缺血15min组、缺血30min组、缺血45min组和缺血60min组斜板障碍率分别为(5.73?1.47)%、(5.95?1.36)%、(41.56?5.78)%及(59.72?5.47)%。见表3。, 表3 各时间点各组动物斜面临界角度均值,(0，x?s，n=8)及再灌注48h斜板障碍率(%), 组 别 再 灌 注 时 间(h) 再 灌 注48h斜板障碍率 6 12 24 48 C0 67.47?7.28 69.26?9.51 65.84?7.25 64.38?8.93 0 C15 65.73?8.03 67.23?6.62 66.47?6.82 66.48?7.35 5.73?1.47 C30 62.72?6.25 69.85?7.15 64.37?8.43 63.63?6.39 7.95?1.86 C45 42.51?,6.37,,,?, 43.26?,7.37,,,?, 44.57?,7.44,,,?, 41.32?,8.56,,,?, 41.56?,5.78,,,?, C60 36.54?,4.53,,,??, 35.63?,5.63,,,??, 33.28?,6.05,,,??, 34.81?,5.33,,,??, 59.72?,5.47,,,??, 注:与同期缺血15min组比较，,#P,0.05，,,,,,P,0.01; 与同期缺血30min组比较，,?P,0.05，,?P,0.01;与同期缺血45min组比较， ,?P,0.05，,?P,0.01 讨 论 神经行为学评估是判断缺血再灌注损伤脊髓功能变化的重要指标。由于动物对神经行为学检测手段的应答具有一定的局限性，故既往脊髓损伤后的神经功能评估侧重于运动功能的研究方法可能影响其实验结果的可靠性及可比性。经过国内外学者多年的努力，提出了多种 1,,、Reuter评分,,,2,,、Rivlin不同的评定标准和方法，主要包括Jacobs评分,,, 斜板试验,,,3,4,,、改良Tarlov评分,,,5,,、BBB (Basso、Beaffic、Bresnahan)评分,,,6,,、Baffourur评分,,,7,,、Gale联合评分,,,8,,等。这些评分标准从不同的方面对脊髓损伤程度提出了相对客观的标准。本研究结合实际情况，联合采用Rivlin斜板试验、Jacobs和Reuter评分法综合判断包括后肢运动、感觉、反射以及负重能力等几方面的变化。 本研究发现，虽然Jacobs分级法能够比较准确地评定脊髓缺血再灌注损伤平面以下的躯体自主动物功能，但过于笼统，不够精细，对于鼠、兔等较低级的哺乳动物，有些指标难以观察;实验一结果显示，脊髓缺血再灌注模型对脊髓前角运动神经元和后角感觉神经元的影响存在差异。因此，Reuter评分法虽然采分点多，能够综合反映后肢细微的神经功能变化，但不能灵敏辨别后肢瘫痪的程度，且易于主观判断，可能导致实验结果偏差;Rivlin法也有其自身的局限性，它主要从动物双下肢静态力量的角度为研究出发点，对于后肢的动态活动能力未加以考虑。因此，本实验联合运用Rivlin斜板试验、Jacobs和Reuter评分法，将多种观察指标和方法综合起来，从静态及动态角度采用双盲、双人独立观察记录，最后取均值进行脊髓功能综合评分,,,9,,。此外，本实验根据自身重力对抗原理，自制适用于新西兰大耳白兔的合金斜板，利用自身重力将斜板试验用于兔脊髓缺血再灌注后后肢负重能力变化的研究。本研究表明，将这三种实验方法相结合，克服了使用某一评分方法的跨度较大、跳跃分布以及连续性较差的缺点，不仅弥补各自的不足，还可以提高实验评分方法的灵敏度，实验结果更为准确地、可靠地、相对客观地综合评定动物运动、感觉等多方面功能。 本实验显示，假手术组后肢Jacobs和Ruter评分术后均完全正常，且48h斜板障碍率为0。在各缺血组中，缺血15min组和缺血30min组动物术后自主排便排尿功能逐渐恢复，观察时间内斜面临界角度、Jacobs及Ruter分值均无显著改变，且再灌注48h时也无明显排便排尿功能障碍以及后肢均无明显瘫痪，截瘫率均为0(0/8)，说明脊髓本身具有一定的修 复功能，动物后肢功能在再灌注6h时能够恢复正常, 至再灌注48h时也未见明显的行为功能 障碍，提示脊髓的自修复功能可能与脊髓缺血再灌注损伤程度有一定的关系，脊髓缺血短于 30min虽然可能引起轻度脊髓缺血再灌注损伤，但随着脊髓血供恢复，后肢感觉和运动功能 可以完全恢复到损伤前的水平。缺血45min和缺血60min组同时间点 Jacobs和Ruter分值 分别表现为明显降低和升高，而斜面临界角逐渐下降，再灌注48h时斜板障碍率逐渐增加， 表现为不同类型的截瘫、大小便功能障碍及双后肢肌张力明显降低，两组动物截瘫率分别为 87.5%(7/8)和100%(8/8)，与此同时，术后动物活动减弱, 饮食量减少，且伴有腹部胀气 等表现，说明左肾动脉下腹主动脉阻断45min和60min不仅能够直接造成脊髓中、重度的脊 髓缺血再灌注损伤，还可能间接引起腹腔和/或盆腔脏器不同程度的缺血损伤，提示脊髓缺血 45min和60min后即使血流恢复，后肢感觉和运动功能也不能恢复至损伤前的水平。 术后神经行为学变化与脊髓缺血再灌注损伤程度密切相关。脊髓再灌注损伤程度与缺血时间有关, 即缺血时间超过一定限度后再灌注就会引起脊髓组织不可逆性损伤,在此时限内 恢复血供则有治疗意义, 此时限即被称为再灌注损伤治疗时间窗。本研究显示，各缺血组同 时间点后肢神经肌肉功能强弱总体变化趋势为缺血15min组和缺血30min组,缺血45min组 ,缺血60min组，说明阻断腰段脊髓血流15min、30min、45min和60min可以建立不同损伤 程度的脊髓缺血再灌注模型，模拟轻度、中度、重度和/或完全性脊髓运动传导功能障碍，轻 度和中度脊髓缺血再灌注损伤可能造成不完全性脊髓运动和感觉传导功能障碍，而重度以上 的脊髓缺血再灌注损伤可能引起完全性脊髓运动和感觉传导功能损害，造成后肢感觉和运动 功能障碍，提示, 脊髓组织如在一定时限内迅速恢复供血, 神经元可能恢复功能; 如超过一 定的时限(再灌注损伤时间窗),则会发生不可逆损伤，失去治疗意义。“时间窗”这一概念于20世纪90年代提出，与脊髓缺血再灌注损伤的预后密切相关。脊髓缺血时间及程度、脊髓 血运重建与否以及多因素介导的脊髓再灌注损伤是术后发生神经功能障碍的主要原因。本实 验中, 兔脊髓缺血30min内后肢神经行为学变化不明显, 而脊髓缺血时间45min以上将造成 后肢神经功能严重障碍，提示脊髓缺血再灌注损伤时间窗可能局限在30-45min之间，精确的 时间点尚需要进一步的研究证实。 参考文献, ,1, Jacobs TP,Schohami E,Baze W,et al.Deteriorating stroke model:histopathology,edema and eicosanoid changes following spinal cord ischemia in rabbits.Stroke.1987,18:741-750., ,2, Reuter DG,Tacker WA,Badylak SF,et al.Correlation of motor-evoked potential responses to ischemic spinal cord damage.J Thorac Cardiovasc Surg.1992,104:262-272., ,3, Rivlin AS,Tator CH.Objective clinical assessment of motor function after experimental spinal cord injury in the rat.J Neurosurg.1977,47(4) :577-581., ,4, 宋跃明,杨志明,雷骥.山莨菪碱对牵张性脊髓损伤的防治作用.中国脊柱脊髓杂 志.1999,9(4):208-211., ,5, Tarlov AR,Ware JE,Greenfield S,et al.The Medical Outcomes Study.An application of methods for monitoring the results of medical care.JAMA.1989,Aug 18,2(7):925-930., ,6, Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC:Graded histological and locomotive outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transtion.Bperimental Neurolcgy.1996,244-256., ,7, Baffour K,Achanfa K,Kaufmn J.Synergestic effect of basic fibroblast growth factor and methiprednisolone on neurological function after experimental spinal cordinjury.J Neurosurg.1995,83:105-110., ,8, Gale K,Kerasidis H,Wrathall JR.Spinal cord contusion in the rat behavioural 134., analysis of functional neurologic impairment.Exp Neurol.1985,88(1):123- ,9, Thomas AJ,Nockels RP,Pan HQ,et al.Progesterone is neuroprotective after acute experimental spinal cord trauma in rats.Spine.1999,24:2134-2138., 作者单位 550002 贵州省人民医院麻醉科,1 610041 四川大学华西医院麻醉科,2