煮沸法快速提取质粒

煮沸法快速提取质粒 煮沸法快速提取质粒以及DNA质解和 质脂糖质泳 【质质目的】【质质原理】【材料质质】【操作步质】【注意事质】【思考质】【质质质质】 一, 质质目的, 1、 掌握质粒 DNA 分～质化的原理 离 2、 质煮沸法快速提取质粒 学DNA 的方法 3、 质 学DNA的限制性质切的基本技质 4 、 质利用质脂糖质泳质定 学DNA片段的质度 二、 质质原理 在基因工程中～ DNA 分子的切割是由限制性切质完成的。限制性切质能质质特定的 内来内DNA 序列～在一定的条断双件下切质 DNA 。限制性切质的作用效率是受多方面因素影的～如反质度～质系～子质质质度内响温冲体离与～ DNA 的质度和甲基化程度等。质 DNA 质行质切质～首先要质质适合的质液。质于质质切～质质用质质的最适质液～质于冲冲双 质切或三质切～质质用一质能使所有质都充分作用的质液。 冲DNA 的质度质于质切的效果的影也大～因质蛋白质。。响很酚质。 仿SDS 等质质都抑制限制性切质的活性。 会内 质脂糖凝质泳是分～质定和质化 胶离DNA 片段的常质方法。利用低质度的质光嵌入染料 - 质化乙质质行染色～可定确 DNA 在凝中的位置。如有必要～质可以凝中 回收 胶从胶DNA 条胶质～用于各质克隆操作。质脂糖凝的分辨能力要比聚丙质质凝低～但其分范质质。用各质质度的质脂糖凝可以分质度质 胺胶离广胶离200bp 至近 50kbp 的 DNA 。质度 100kb 或更大的 DNA ～可以通质质质方向呈周期性质化的质质凝质泳质行分。 脉冲胶离 在基因工程的常质操作中～质脂糖凝质泳质用最质泛。通常采用水平质泳置～在强度和方向恒定的质质下质行胶广它装 质泳。 DNA 分子在凝质液;一般质性,中质质质荷～在质质中由质向正移。 胶冲碱极极迁DNA 分子移的速率受分子迁大小～象。质质强度和方向～基质成～度和嵌入染料等因素的影。 构碱温响 三 , 质质材料和质质, 1, 菌质, 含 pUC18 的大质杆菌 JM107 菌株。 2, 化质质和溶液 学 ;1, LB 培质基, NaCl 10g/l 酵母提取物 5g/l 胰蛋白质 10g/l 氨青霉质质质素 50 μ g/ml ;培质基质菌后加入, pH7.0 ;2, 70% 乙醇; -20 ?,及无水乙醇; -20 ?, ;3, STET 质液; 冲pH8.0 ,; 8% 蔗糖～ 0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,,10mmol/L Tris , ;4, 5%CTAB ;十六质基三甲基质化, 氨 ;5, 1.2M 质化质 ;6, TE 质液; 冲10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA , ;7, 质泳质液; 冲50XTAE , Tris 242g～ 醋酸 冰57.1ml～EDTA(0.5mol/LpH8.0) 100ml 使用质用蒸质水稀质 50 倍。 ;8, 质品质液; 冲6X , 0.25% 质质～ 酚0.25% 二甲～ 苯青40% ; W/V ,蔗糖 ;9, 质化乙质 10mg/ml ;10, 质脂糖;质泳质, ;11, 限制性切质 内 ;12, 溶菌质; 50mg/ml ～溶于 10mmol/L Tris-HCl ～ pH 8.0 , 3.质器质质: 台式心机、超质工作台、高质质菌质、恒振质培质箱、恒水浴箱等。 离温温 Eppendorf 离心管～ Tip 质～三角等质菌质用。 瓶 质泳质～质泳槽～质品梳～微波～水浴质～移液器; 炉20ul, 200ul 和 1000ul ,～心管～ 离Tips(200ul,1000ul) 。 四 , 操作步质, 1.质粒提取 ;1, 将2ml 含相质抗生素的 LB 培质基加入到容量质 15ml 的质管中～接质一质菌落～用棉塞封口～在 37 ?质烈 震质; 250rpm ,培质质夜。 ;2, 将1.5ml 培质物质入心管中～用台式心机在 离离4 ?件下心 条离30 秒; 12,000 × g ,。 ;3, 上液～用质质吸干心管中的液培质基～质菌淀物质浮于 弃清离体将沉200 m l STET 质液～用质旋混合器充冲分混。 匀 ;4, 加入 4 m l 新质配制的溶菌质液～混～置室下 匀温5min 。 ;5, 用漂子架住心管～置于沸水浴中～精质质 离确45 秒～取出后立刻心 离10min 。 ;6, 用无菌牙质挑取心管中的淀物去～心管的上液中加入 离沉弃离清8 m l 5%CTAB ～用混合器混后～匀高速心 离5min ～上液～用质质吸干心管中的液。 弃清离体 ;7, 加入 1.2M 质化质 300 m l ～充分溶解淀物～再加入 沉750 m l 的冷乙醇～充分混后～心 匀离15min ～弃清上液。 ;8, 取 1ml 70% 冷乙醇～质慢淋洗心管壁～心 离内离5min 。上液～用质质吸干管壁上的液～置室中弃清体温 使核酸淀自然干燥 沉5-10min 。 ; 9 , 淀物溶于 沉50 m l TE 质液中～ 混合器混 。 冲匀 ;9, 成质粒制质液～制质的质粒供下一步质质使用 即 2.DNA的质解 质置 DNA的质切反质～按下列质序加质;质, 体m l ,, 反质管 质照管 置质的质粒 DNA 2 2 质反质液; 10 ′ , 2 2 双蒸水 15 16 限制性切质; 内5U, 1 0 质质 体20 20 加完反质液～混～心 匀离1分质～置于37 0 C水浴中～反质2小质。加入加质质液;冲10 ′ , 2 m l 3. 质粒DNA的质脂糖质泳 1) 量取 100毫升TAE质泳液～加入0.7克质脂糖～混后～置于微波中～加质 匀炉 3分质～充分溶解质脂糖。 注意质察～心煮沸的液～溢出, 当体 2) 用质菌后的橡皮～封质质干燥的质泳胶清并与板～用少量的质脂糖液封质。安放梳子～质整梳子的底部质质质泳板之质的距离～一般以 1-2毫米质宜。 3) 当溶解后的质脂糖液冷却至 50 0 C左右质～加入质化乙质5 m l ～质化乙质的最质质度质1.0 m g/ml . 混后～质脂匀将糖液倒入质泳板中～静止～切勿移质。 4) 在凝完胶温全凝固后;于室放置 30-45分质,～质质地取出梳子～除去质～凝胶将胶放入质泳漕中。 5) 质泳漕中～加入质泳液; 1 ′ TAE,～使质泳液覆盖在质脂糖面胶之上质1-2毫米。 6) 取上一质质制质的质粒提取液;质切,～加入 1/5质品质液～充分混。用移液器质品小心冲匀将地加入点质孔。在不 同的点质孔中～分质加入DNA分子量质质物; marker ,～质照以及质粒提取液;质切,质品 7) 接通质源～在 90V下～质泳1小质～质质质料移至凝当酚迁胶断前沿质～切质质源。 8) 取出凝～在胶灯紫外下～质察 DNA的移位置～质质质质质果。 迁并 五、 注意事质 : (1) 从沉沉清残质菌淀中或核酸淀中去除上液质～一定要质底～不能留有余。 (2) 用 70% 的乙醇溶液洗质核酸淀质一定要十分小心～沉将防止核酸同洗液一起去掉。 (3) 在质质质程中所用的器皿和吸质等都要质行高质质菌。 (4) 质切质～质量尽减体减确体体少反质中的加水量以使反质系到最小。但要保质质不超质反质质质的十分之一～否质限制质 活性受到将甘油的抑制。 (5)质行质切消化质～将从冰并冰个除质以外的所有反质成分加入后再箱中取出质～质放置于上。每次取质质都质质一无菌 吸质 。 操作要可能快～用完后立质尽即将冰放回箱 (6) 质化乙质 是一质强烈的 致癌物质 ～ 使用质必质质手套 。质质质果后～含质化乙质的凝要质行质化质理。 胶六、 思考质 ,, 质质脂糖凝的质泳质果质行质质的胶描述～ ,, 质何在质凝质行操作质要质一胶次性手套, ,, DNA 分子在质泳质液中质正质荷质是质质荷冲它,在质质中的移质方向如何, top