【word】 NaCl和壳聚糖对离体培养百里香精油的影响

【word】 NaCl和壳聚糖对离体培养百里香精油的影响 NaCl和壳聚糖对离体培养百里香精油的影 响 热带作物2011,32(10):1910—1814 ChineseJournalofTropicalCrops NaCI和壳聚糖对离体培养百里香精油的影响 李建国一,杨莉.,徐世千,李晓东 l中国热带农业科学院分析测试中心.海南海口571101 2深圳职业技术学院应用化学与生物技术学院.广东深圳518055 3海南大学农学院.海南海口570228 4华南农业大学农学院.广东广州510641 摘要采用水蒸气蒸馏法提取普通百里香(ThymusuIgarisL.)组培苗以及添加NaC1,壳聚糖的普通百里香组 培苗的精油.利用气质联用法(GC—MS)结合色谱峰面积归一化法对其化学成分和相对百分含量进行比较研究. 结果明.3种组培苗百里香精油都含有一般百里香精油的主要成分百里香酚,香芹酚,石竹烯等,化学成分 的种类有一定的差异.这为进一步通过离体培养途径生产百里香精油提供了重要的理论依据和数据参考. 关键词组织培养;百里香;NaC1;壳聚糖;精油 中图分类号R284.2Q946.85文献标识码A EffectofNaC1andChitosan0nEssentialoilin ThymusvulgarisL.0fTissueCulture LIJianguo一,YANGLi,XUShiqian,LIXiaodong2 1AnalysisandTestingCenter,CATAs’Haikou,Hainan571101,China 2SchoolofAppliedChemicalandBiologicalEngineering,ShenzhenPolytechnic,Shenzhen,Guangdong518055,China 3CollegeofAgronomy,HainanUniversity,Haikou,Hainan570228,China 4CoofAgriculture,SouthChinaAgricultureUn&e~ity,Guangzhou,Guangdong510642,China AbstractTheessentialoilsfromthetissuecultureseedlingsafteraddingNaC1,chitosaninthemediumof ThymusvulgarisL.wereextractedbysteamdistillation,andthechemicalcomponentsandtherelativecontents fromthethreesampleswereidentifiedbygaschromatography—massspectr ometry(GC/MS)combinedwithpeakarea normalizationmethod.Theresultshowedthatthemainchemicalcomponentsofessentialoilinthesesampleswere thymol,carvacrolandcaryophylleneandtherewasonlyaslightdifferenceinthetypesofchemicMcomponentsof essentialoils.Thisstudyprovidedanimportanttheoreticalfoundationanddatareferenceforfurtherstudyon productionofessentialotisinthymebytissueculturetechnology. KeywordsTissueCulture;ThymusvulgarisL.;NaC1;chitosan;essentialoil doi10.39696.issn.1000—2561.2011.10.024 百里香(ThymusvulgarisL)为唇形科(Lamiaeeae) 百里香属(Thymus)植物,是一种重要的芳香和药 用植物【n.其花茎叶可提取精油.其精油是重要的 天然香料,天然防腐剂以及天然抗氧化剂,具有广 泛的商业价值[2卅.精油中的主要成分百里香酚, 香芹酚,石竹烯等,是由焦磷酸香叶酯经过羟基化 和一系列的配置变化而来[51.具有强烈的抗真菌活 性和高效防腐性f6.百里香精油传统的生产方式 主要是通过人工种植百里香来提取获得.其得油率 低且生长周期长,生长易受地域限制以及环境因素 的影响,因此.通过离体培养技术进行快繁,有望 实现大规模工厂化生产百里香精油 已有研究结果表明.在离体培养条件下,通过 添加适量的刺激物可以提高培养物中次级代谢物的 产量.并可以改善其成分[8_1o/本实验室前期研究 发现.通过百里香无菌苗腋芽诱导的不定芽可以进 行大量增殖.但随着继代次数的增加.不定芽增殖 能力不断下降.为了提高不定芽的增殖能力.笔者 选用2种非生物刺激剂(NaC1和壳聚糖),通过不同 浓度的处理.筛选出NaC1和壳聚糖有利于不定芽 增殖的最佳添加浓度分别为0.5,0.2”],为了进 一 步明确NaCl和壳聚糖对百里香次级代谢产物的 收稿日期:2011-08—13修回日期:2011-09—26 基金项目:深圳市科技项目(No.2109k3070009). 作者简介:李建国(1967年一)男,博士,副研究员.研究方向:农业生物技术,热带农产品质量安全.通讯作者:李晓东,E—mail lxd1819@yahoo.com.ca. 第10期李建国等:NaC1和壳聚糖对离体培养百里香精油的影响一191l一 变化,本研究通过添加NaC1和壳聚糖对离体培养 百里香精油的含量和成分的影响.期望为今后大规 模工厂化生产百里香精油提供理论指导. 1材料与方法 1-1仪器与材料 1.1.1仪器分析仪器HP6890GC/5975MSD气一质 联用分析仪(美国惠普公司).附G1701BA-B_0 1.00ChemStation软件.普通百里香种子.购于农友种 苗(中国)有限公司;挥发油常压水蒸气蒸馏提取器. 1.1.2材料样品I:普通百里香组培苗.以MS为 基本培养基,添加NAA025m扎和6A025mg/L. 附加0.6琼脂和3%的蔗糖,灭菌前调pH为5.8 6.0,常规灭菌处理,培养室温度(25_+1)oC.光照强 度2000lx.光照周期14h/d,继代增殖培养5代 后,生长3个月.此为对照(CK). 样品?:普通百里香组培苗在CK条件下进行 继代增殖5代后添加0.5g/LNaC1,生长3个月 样品?:普通百里香组培苗在CK条件下进行 继代增殖5代后添加0.2g/L壳聚糖.生长3个月. 切取3种样品的全株,于23?下阴干.4?保存. 所用试剂除正己烷为色谱纯外,其余均为分析纯. 1.2方法 1.2.1挥发油的提取取干样20,30g,粉碎.置 于1L圆底烧瓶中.以1:lO(rrdV)的体积比加入蒸 馏水与玻璃珠数粒.采用水蒸气蒸馏法.蒸馏时间 为微沸2.5,3h.挥发油经正己烷萃取后.保存于 2mLAgilent样品瓶中,4?保存备用. 1.2.2色谱条件色谱柱:HP-5MS,5%苯甲基 聚硅氧烷弹性石英毛细管柱(30rex0.25mmX0.25m). 进样口温度:250cI=,柱室温度:70.I=(保持5min), 以8~Chnin升温速率升至150?(保持10min).10? 升至250?(保持8min),载气:高纯氦气,柱前压 8.12Psi.流速lmL/min,分流比37:1. 1.2.3质谱条件接口温度:280?;电离方式: EI;电子能量:70eV;离子源温度250?;四极杆 温度130?;调谐方式:标准调谐;质量扫描方式: SCAN;溶剂延迟:3min;扫描范围:35550amu. 1.2.4分析方法用HP一5MS色谱柱对色谱分离 条件进行优化.确定最佳分离条件后进行GC/MS 分析.获得挥发油的总离子流色谱图(TIC).利用 该仪器标配的Nist2008质谱库进行检索.再对所 得的谱图进行人工核对和补充检索.最后用面积归 一 法测得各组分的百分含量 2结果与分析 采用水蒸气蒸馏法提取了百里香的3种组培苗 的精油.结果表明.添加0.5g/LNaC1和0.2g/L壳 聚糖的百里香组培苗.精油含量分别为0.2%和 0.21%.与CK(0.15%)相比分别提高了33.33%和 40.00%. 用GC/MS对3个样品的挥发油进行分析.经 质谱分析得到各组分的质谱图.与标准图谱库对 照,总共确定了29个组分,结果见表l和图1,3. 表1百里香挥发油化学成分的分析结果 一 1912一热带作物第32卷 说明:”一”表示未检出. l9000oO l8000o0 1700Ooo 16ooOo0 l5o0O00 1400000 *1300000 靛1200000 1100000 1Oo0O0o 900ooO 80oO0o 7o0ooO 60o0oO 50o0o0 400O0o 3ooOo0 20o0o0 lo0O0o 9 I ,. 5 lOIl J 2,20 .?I.1JiI}lIJ上一..LL.LIL. 120o0oO 11ooO0o 10ooooO 越900000 *L 莨800000 霉700o0o 60oOo0 50oO00 40o0oO 30oOo0 20oo()0 looOo0 5.OO1O.0o15.oo20.0o25.o030.0o 保留时间/min 色谱峰上的数字所代表的相关组分见表1.下同. 图1百里香组培苗挥发油总离子流图 28910l21319 4 Il , 6I16 28 3 //..I.上LJL一一..1...II.?_JI1.--_5.oo10.oo 图2 15.o02O.0025.003O.0o 保留时间/min 0.5g/LNaC!处理百里香组培苗挥发油总离子流图 第10期李建国等:NaC1和壳聚糖对离体培养百里香精油的影响一 1913— 1OooOo0 900Ooo . 800000 高 700000 0 600000 趸500000 40oo0o 靛 罂300000 2o0Oo0 10oOoo 10.o0l5.0020.oo25.o0 保留时间 图30.2g/L壳聚糖处理百里香组培苗挥发油总离子流图 其中12个组分为3个样品所共有.3种组培苗百 里香精油都含有一般百里香精油的主要成分百里香 酚,香芹酚,石竹烯等.样品?,样品?分别确定 了23,22个组分,与CK相比分别增加了5,4个 组分. 用面积归一法计算其相对百分含量.分析结果见表 1,其中样品?中含量最多的成分为石竹烯(39.894%), 百里香酚(14.337%)和6一桉叶烯(8.516%):样品? 含量最多的成分为百里香酚(36.063%),8一桉叶烯 (14.600%)和石竹烯(11.155):CK含量最多的成 分为百里香酚(17.582),石竹烯(14.207%)和邻一 伞花烃(13.572%). 3讨论与结论 适量的刺激剂(生物类和非生物类)不仅能够 促进植物的生长.还可以通过刺激植物代谢过程 中的酶来提高作物品质.增加作物产量【l2】.一般 而言.刺激剂对植物次生代谢途径有2种调节方 式.一种是通过诱导新酶合成以及启动新的代谢 支路.从而促进新的次生代谢产物的合成.如离 体培养的曼陀罗(Daturastrcvnontum)经刺激剂处理 后.生物碱的合成受到了抑制.而倍半萜类次生 代谢物得到了快速积累.这说明与生物碱合成有 关的酶受到抑制.而与倍半萜类次生产物合成相 关的酶被启动【n】:刺激剂调节植物次生代谢途径 的另一种方式是通过增加原代谢途径中关键酶的 量.从而提高该次生代谢物的产量.如未加任何刺 激剂的悬浮培养的大阿米mmim)只能形成微 量的伞花内酯(umbellifetone).但是经刺激剂处理 后.细胞合成伞花内酯的能力大大增碳.本实验 结果表明.在0.5LNaC1和0.2L壳聚糖2种刺 激物的作用下百里香组培苗精油含量提高了.分别 比对照提高了33.33%和40.00%.这说明添加 NaC1和壳聚糖后有可能增加百里香精油代谢途径 中某些关键酶的含量.从而促进精油的合成. 另外.本实验结果显示.3种样品精油的主要 成分相同.均含有百里香酚,香芹酚和石竹烯 等.这与大多数关于百里香精油主要成分的报道 相符[15—16].其中CK含量最多的成分为百里香酚 (17.582%),样品?中含量最多的成分为石竹烯 (39.894),样品?含量最多的成分为百里香酚 (36.063%),但是.在NaC1和壳聚糖的作用下百 里香组培苗精油某些组分发生了略微变化.如经过 0.5g/LNaC1处理的百里香不定芽.其精油中石竹 烯含量高达39.894%,这说明在刺激物的作用下. 百里香不定芽生物体内发生了变化.代谢途径中的 一 些代谢酶发生了改变.从而导致精油中某些成分 及含量的变化 综上所述.添加0.5g/LNaC1和0.2g/L壳聚糖 提高了百里香不定芽精油的含量并保持了精油的主 要成分不变.说明添加适量的刺激物.不仅有利于 百里香不定芽的增殖[n】,而且有利于提高其精油的 含量.初步说明通过离体培养繁殖不定芽提取百里 香精油是可行的.也为今后大规模工厂化生产百里 香精油提供了重要的理论依据和数据参考 一 1914一热带作物第32卷 参考文献 【1】张继,田玉汝,刘忠旺,等.百里香属植物研究进展【J】.北方 园艺,2010(1):226—228. 【2]GrossoC,FigueiredoAC,BufilloJ,et01.Compositionand antioxidantactivityofThymusvulgarisvolatiles:Comparison betweensupercritiealfluidextractionandhydrodistillation[J1.J. 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