【doc】卵巢激素对小鼠围着床期子宫内膜Le^y寡糖表达的调控

【doc】卵巢激素对小鼠围着床期子宫内膜Le^y寡糖达的调控 卵巢激素对小鼠围着床期子宫内膜Le^y寡 糖表达的调控 生物化学与生物物理 ACTABICK'HIMICAelgIOPI-IYSICAS】NICA20t)I.33(5):542546c3I1301)/Q 卵巢激素对小鼠围着床期子宫内膜 Ley寡糖表达的调控 王哈葛常辉孔 (大连医科大学生物化'教研宰 英辛毅朱正美 糖生物学研究所.^连II6027) 摘要研究表明【寡糖介导了胚胎子宫内膜之间的识别与粘附,在胚胎植^中起重要作用.其l,2,n1,3 岩藻糖基的合成分别与a1,2岩藻糖基转移酶(FLrrI],nJ,3岩藻糖基转移酶(FUI"4)的催化作用密切相关.应用 WestmEIj迹,免疫组化和半定量Rrr—PCR方法,观察小鼠妊娠早期去卵巢后雌孕激素处理的子宫内膜Lg寡糖 抗原及其台成柑关的I'1,FUT4基因的表达,卵巢激素对I.ey寡糖表达的嗣控结果显示:妊娠早期, Ft.Vll,FL不'4基用的转录水平随孕激素水平上升而呈下降的趋势,这与【寡糖抗原表逃一致进一班观察发 现.六卵巢后经孕激素处理,FUT1,Fb'l』4基因及L寡糖抗原表达均较对照组降低,雌激素处理组表达则明显 升高.雌孕激素联合作用升于雌激素组和孕激素组之间.结果表明,孕激素能下调FU'I1,FUT4基固的表逃,雌 澈索对奠有上调作用.两种激素之间表现为相互拮抗.提示雌孕激素可能通过Tl,FUT4基因转录水平调控 I寡糖抗原在小鼠子宫内膜上皮的表过. 关键词1七';岩藻糖基转移酶;子宫内膜;激素调节;围着床期 胚泡的着床是胚泡与子宫内膜相互识别,进而 定位,粘着,穿透并完全植人子宫内膜基质中的连续 复杂的牛物学现象,多种因子参与并调节这个生殖 的关键环节.卵巢激素在细胞因子的介导下调节子 宫内膜或胚胎的细胞分化,影响母胎生理状态和胚 胎植入的局部微环境0-,在围植入期发挥重要的 牛理功能lf宫内膜的接受性主要受卵巢激素的调 节3,4:近年来发现,着床期间子宫内膜上皮细胞 表面及胚胎表面均有丰富的岩藻糖化抗原表达,并 在植人期呈现动态变化,,其中包括岩藻糖化乳 糖系列寡糖(Iey,Le和HI).将IeyIFucal,2-Gal 31.4(Fucal,3)一GlcNAc口l一3Ga1]寡糖特异性单克隆 抗体注射到官腔内或加人体外共培养体系中封闭 Le寡糖均屉着抑制小鼠胚胎的着床过程,且此作 用具有明确的寡糖特异性18..同时还发现,在小 鼠妊娠第4天(着床日)有特异性12,16kD的Le 糖蛋白出现l()J.上述研究表明Le寡糖抗原对胚 胎着床过程中母胎之间的相互识别有重要的作用. 目前已知催化岩藻糖化反应的岩藻糖基转移酶存在 多种亚型,其中a1,2岩藻糖基转移酶(FUT1)和 收犒H期:200104412接受口期:20tl10604 国家自然科学基金资助项几.No39570154 ^:l'e1.04l1-4720616;e-mail.zmhu@maildIpttJncn n1,3岩藻糖摹转移酶(FuT4)参与L寡糖末端岩 藻糖基的合成…Ij.本文应用W~stem印迹,免疫组 化和半定量RT—PCR的方法,观察小鼠早孕以及去 卵巢后经雌激素,孕激素处理及雌孕激素联合模拟 接受态子宫内膜l寡糖抗原和相关糖基转移酶 FU丁1,F明'4基因的表达,以探讨子宫内膜上皮 细胞表面Ie寡糖抗原表达的调控机制. 1材料和方法(MaterialsandMethods) 1.1实验动物的处理 6,8周成年雌性昆明小白鼠由大连医科大学 实验动物中心提供 早孕小鼠:成年雌鼠与成年公鼠1:1合笼,次 晨检查有阴栓者确定为受孕第1天,分别取受孕第 1,5天的小鼠,每组4只.于下午1时断头处死. 去卵巢激素处理小鼠:成年雌鼠20只,经 手术切除卵巢后,饲养11天(待其内源性激素消 退),皮下注射3天(每O.1m1荼油中含100ng雌 二醇),停药2天后,分成4组,各组按下述每 天皮下注射给药连续4天.(1)对照组(C):01ml 茶油;(2)雌激素组(E):每0.1ml荼油中含100 ng雌二醇;(3)孕激素组(P):每0.1ml茶油中含 500Fg孕酮;(4)雌孕激素联合组(E+P):前3 Sep,n0王晗等:卵巢激索埘小鼠围着床期子宫内膜1寡糖表达的词控543 天,每01ml荣油中含500职孕酮,第4天,每0. 1m1荼油中含500g孕酮和10ng雌二醇.最后? 次给药后18h断头处死小鼠.取4只未孕小鼠与去 卵巢小鼠同时处死. I.2Western印迹法检测Lev寡糖抗原的表达 取出子宫于4?刮取内膜,同组样品混合后放 人蛋白质提取液(1%NP-40/PBS)中混匀,离心取 上清,用考马斯亮蓝法测蛋白质含量1]常规 sI)S-聚丙烯酰胺凝胶电泳,考马斯亮蓝染色.做 Western印迹时,电泳结束后,经电转移到硝酸纤 维素膜(NC)上.NC膜以HSA封闭,加入AH6(抗 Ley单克隆抗体lgM,由美国华盛顿大学Hakomori 教授惠噌),二抗(碱性磷酸酶AP标记的抗小鼠 IgM),显色结果经Qscan软件扫描定量. 1.3免疫组化法检测I寡糖抗原的定位表达 子宫置于10%福尔马林固定2h,石蜡包埋切 片,常规脱蜡,水化;过氧化氢阻断内源性过氧化 物酶活性;羊血清封闭,加人AH6(抗Ley单抗 lgM),二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠lgM) 【nB显色,苏木素复染细胞核阴性对照以PRS代 替一抗,未见着色 I.4RNA提取 断头处死小鼠,立即取出子宫,迅速刮取子宫 内膜,同组样品混合后置于离心管中,异硫氰酸胍 法_I提取RNA:加入裂解液,震荡,以水饱和酚, 氯仿/异戊醇抽提RNA,异丙醇沉淀后溶于无RNA 酶的水中.检测A2?/A2,o计算RNA含量以及纯 度,置于70?保存. 1.5半定量RT-PCR反应 逆转录体系中含2IRNA,10×逆转录缓冲液 2】,dNTP(【0nm,ol/I),0.5/*1RNase抑制剂,l (A】 NCEPE+P fB1 NCEPE+PM lAMV逆转录酶(5u1),1l随机引物(Oligo dF-Adaptor),以无RNase水补至总体积7{)I上 述混合物按如下条件反应合成eDNA:30?10 rain,50?30rnin,99?5rnin,5?5rnin. 取5I合成产物进行PCR反应.PCR扩增引 物序列见表1,其PCR反应的条件如下:94?预变 7rain,然后94?变性30S,60?退火30s,72 ?延伸90s,进行35个循环,最后72?延伸5 rain内参照GAPDH基因与目的基因在同一反应 管中.所用试剂均购自TaKaRa试剂公司.结果经 Qscan软件扫描定量. 2结果(Results) 2,IWestern印迹法分析去卵巢后激素处理子宫 内膜LeY糖蛋白的表达 SI)S-PAGE分析正常未孕及去卵巢后激素处理 子宫内膜样品,经考马斯亮蓝染色后可见各组蛋白 质上样量摹本一致,主要蛋白质条带亦未见不同 [【璺】【(A)]. Table1Primersusedinthisstudy kD 97 66 43 3I 20 Fig.1Westernblotan~ysisofLeYantigenintheendmnetriumofmicetreatedbyovaryhormon esafterovariectomy A】 Com~a'-sieblue(BjWesternblotanalysisot(C)Quea~titativeattalysisottotalIglyooprotei NsC.controliEl~trogen;P,m郫 …:E+P.estrog~progesterone;N.tlonpregnancy;M, molecularMssstandards A ACIl{I(X'HIMI(dBI(HYSI(S[NI(33.No.5 f?2]mmunohistoehemistryanalysisoflxaantigeninthe endofnetrlumofre[re (A1nonprq~nant:(B)~onWo]tovarlectomi~d) Western印迹结果见图1(B)正常未孕及去卵 ,主 巢后激素处理了宫内膜均含有多种Ley糖蛋白要分布丁大分子量区(约为50--200kT)).L糖蛋 白表达的总量在各组之间差别明显,且以分子量约 为6O,90kD最显着I七y糖蛋白表达的总量在孕 激素处理组降低,低于对照组,雌激素处理组显着 高于对照组,雌孕激素联合模拟接受态子宫内膜 L表达介丁孕激素组和雌激素组之间.本实验重 复3次,结果基本一致 2.2免疫组化法分析子宫内膜Iey寡糖抗原的表 达分布 观察ll常未孕及去卵巢对照组小鼠子宫内膜, 阳性反应均位于内膜腔上皮细胞和腺上皮细胞表 面,去卵巢对照组官腔及腺腔明显缩小,宫腔表面 阳性反应变薄,腺腔表面阳性反应不明显(图2) 23半定量lit.PeR方法分析小鼠子宫内膜 FUT1,FUT4基因的表达 早孕期间子宫内膜中兀』7l,FUT4基因转录 水平的变化趋势基本一致(图3):自早孕第1天 (I)1)到着床日(D4)以及早孕第5天(D5)均呈现逐 渐下降的趋势,歪n5最低卵巢切除后孕激素处 理子宫内膜FUT1,FUT4基因的表达均较对照组 低,雌激素处理较对照组升高,雌孕激素联合组表 达水半介于雌,孕激素组之间本实验重复3次,结 果基本一致 3讨论(Discussion) 早孕子宫内膜仅在一个极短的时期内接受胚胎 着床,此时子宫内膜的容受性达到最高,称为着床 窗口期(implantationwindow).这一时期雌孕激素 在细胞因子,生长因子以及其他激素的介导和调节 下,诱导子宫内膜在形态和生理上为胚泡的粘附和 植人作准备3,4:植人期内膜上皮细胞顶质膜形成 鹿大的羽状突,直接参与胚泡与子宫内膜表面的牯 附反应,牯附分子(CAMs)如整联蛋白也有助于细 胞从非粘附状态转为粘附状态,细胞因子如白血病 抑制因子(LIF),表皮生长因子(EGF)超家族,白细 胞介素(II)还能通过自(旁)分泌的方式在着床过程 中发挥生理功能J.此外,多种糖复合物表达于子 宫内膜上皮细胞表面,并且在卵巢激素的调节下, 在围植人期表现出动态的变化,从而影响着床过 程应用糖特异单克隆抗体进行的免疫组化研究 表明,大鼠子宫的寡糖抗原H2受孕激素的上调作 用,并表达于接受态的子宫内膜,但在去卵巢及植 后消失;H1寡糖抗原亦受孕激素的上调作用l】. 本文重点研究含有两个岩藻糖基的LeY寡糖抗原, 它被认为可能在胚泡的着床过程中作为中介分子始 发胚泡的识别与牯附过程』.小鼠妊娠早期子宫 内膜I.ey寡糖的表达随妊娠后孕激素水平上升而呈 下降趋势【1oj本文观察到Le寡糖抗原表达于小鼠 子宫内膜腔上皮和腺上皮细胞表面,并且其表达与 分布与雌孕激素的作用有关.应用Western印迹分 析可见,孕激素可以抑制去卵巢小鼠子宫内膜I 糖蛋白的表达,而雌激素对其有增强作用,两种激 素之间表现为相互拮抗. 糖复合物生物功能的发挥取决于寡糖链的结 构,但糖链与肽链不同,它的合成没有模板,要依 靠对糖基的供体和受体都有较高专一性的糖基转移 酶的催化作用,因此,不同的糖苷键对应不同的糖 基转移酶.有研究表明,子宫内膜细胞糖基化过程 受卵巢激素的调控l】.近期,White等人[16在末 端含一个岩藻糖基的Hl寡糖抗原的研究中观察 到,在小鼠子宫,催化其末端岩藻糖化的FuTl酶 活性的表达受雌激素上调,孕激素下调.进一步研 究uTl基因的表达发现,其表达也受雌激素上 调,孕激素下调,二者均与雌孕激素对Hl寡糖抗 Sep,200 4 十晗等:卵巢激素刘小鼠围着床期r宫内膜【寡糖表达的涮控545 一 5【H] 250 GAPDH FU7"4 5【H] 250 500 No[.maICOntr0IEPE-P HoFinotletreatmen【 Fig.3Effectsofestrogenandprog~leroneoilF盯 1,FL74geneexpressioninmouseuterineendonmtriumbvsemi?quantative RT-PCRandr~ultsquantifiedbydensitometricanalysis (A)副咖p…pattern:(1{)Densito~tric?』laIm(11Fu1'Iinovan~'tomy;(2)H订,Im? rpregr~ncy;(3)FL4int)varicett~fty;(4) FUninearlypregnancyN,nonpregant;I5daysofpregnancyMmdoc'ularmssstandards;C,ff on[to1;E?tcn;P,progesterone;E+ P,0s[rO~elquprc~oslem'rte 原表达的调节相一致7.本文结果显示,催化【e 寡糖两个岩藻糖基添加的FUTl和FUI'4的基因 表达也均受雌孕激素的调控,其中妊娠后FL丁l和 FUT4基园的表达均随孕激素水平J二升向受到抑 制;去卵巢后孕激素对两者的表达有下调作卅,而 雌激素则上调其表达,两种激素联合使用则其作川 相互拮抗.上述结果进一步提示,卵巢激素可能通 过对FuTl,FuT4基因转录水平的调控来调节 FUT1,FUT4的酶活性,从而影响小鼠围着床期子 宫内膜Ley糖蚩白的表达 References 】ba【k1hS.P*b~kniaAThesignals卸dr】IecuIarpathwaysin j—un1]一lu々一一0一一i—j1}v1Iul,l; ??蚰0 皇『『12云【U0言51)一苟一u ACTABl【xH"ICAelBIOPHYSICASIN】CA i1imp]antalion,as)~nbioticInteractionBetweenblast~yst andendt>nwtri~/in~Mngadh~iortandinvasionHRepzod, 199510:1579一l620 2kcYW,KingAedsHumanfmpIantal~on:(fiiatogyam/ ,…Iumatog.('ambri(】ge:Cmabri(】geUnivvrsityPress.1995. 180224 3t'aiL.1)uanNKProgre~0nmnbyoimpianlationandregula tionofcvtokinesJRcpradMad.20o0.9(4):24}-246 ({l自:生殖匪学杂志) 4BeerAF,HIlinghmRE】mplantadon,tramqplatflatandn- l~helialmcsonchvnMrelationshipsinthemtLllertl5J/7.rpMad l97(),132:72l736 5Feade~)aHAS~ccharidminedInimplantationTndsn Gl3xo.~ffeneeandGls,cotechnolgy.1993S:27l313 6ZhuM.WangXQRolefor睫Usurfaceollgw~acchandeIncell- ccllrec~witiondunngimpl~tationMatHumRepr,d.1998,4 38 c8):735— 7SidhuSSKimberS】H0【叫n【rolofHT(1-21fwac~yl lransferame~gerrlbonucleicacidintheulcDls13i Repr,d,l999,60(1):l47l57 8ZhuzM,Ko}imaN.StmudMR,k?nS【.Fende—BA j1}m!amdx~vdirectedLeol[gosaech~ideinhibiim pLantatkminthettlousoBiatReprod.1995,52(4j:903—9l2 9WangXQ.【?YJ,ZengGQ.ZhuZMTdf.ctofMonc~ clon~anlibMydirectedloLeadg?a}1adeOD~culturesystml ActaZoolngi~aSim~a,1998,44(4):443—449 (0I自:动物) 10ZhangXY.ZhuZM丁hed~micvan&tmnofIglyeopmteir~ in?eendometriumduringthepertimplantationstageCkinese 13iochemistryJournal,l996.12(5):574_I577 (引自:生特化学杂志) I】KleencR.BergerEGemdecularandcdlbld~gyofglyeasyl tr0.nsfera~13i~.him鼬Acta.1993,1154【3,4):28卜 325 l2BradfordMMArapidm1d删nmed~,dtot【hquantitatlon0{ mJcr~gramquantitiesofproteinutil~ingtheprineipleofprotein-dye bindingAmBicc.1tetn.1976,72:248—254 I3Chm~wzynskiP.SacchiNSingle-stepmethodRNAisolationby acidgtmmd?thvamtphend-cMomiormextraetlonAf r.I987.162:156一l59 14KimberSJ,lllii~gworthIM.dExpressionofcarbohydrate ant蝎eDsinthel-Rtu'tc~lsduringear1)'pregrmncyandafterovarlec tomyand~eroldi,edacem?tJRepradFerH1.1995.103I1): 75—87 I5Cars:)nDD,FarrarJD,LaidlawJ,WrightnASelectiveac6va tionoftheN-glyccasylationapparatusinute6byn』m 2955 C.1900.2652947— 16weS.KimberSJChangesin?(1-2)fuc?tmmactivi tyintheroutineendcanetfia/epitheliumduringtheestrouscycle, capregt~ancy,an口aftel-ovanectc~yandhoIT/lODereplac?t. 既ogReprcd.1994.蛐(1):73—81 OvaryHormonalControlofLeyOligosaccharideExpression duringPeri-implantationofMouseEndometrium WANGHan,GEChangHui,KONGYing,XINYin,ZHUZheng-Mei (1)eparDelentofc",InsliluleofG1. wo6~o[oKv,[~MmnMedh~lUniversity.DallanI16027,ina) AbStractIthasbeenreportedthatoligosaccharideLeplaysanessentiaIroleattheinitialstageo fimplanta— tion.Itmayactasamediatormoleculeforrecognitionandadhesionbetweenthesurfaceofblastocystsand即 1thelia1cellsA1pha1,2fucosvltransferase(FUT1)andal,3fumsyltransferase(FU'II4)atere sponsibleforthe synthesisofitsal,2andal,3fuceae,respectively.Jnthisarticle,thetranscriptionofF1andM4g enes wasinvestigatedbysemi—quantitativeRT— PCRaadtheexpre~ionofLeyoligosaccharidewasanalysizedbyWest ernblottingandinmmnohistochemistrywiththeendometriumofearlypregnancymiceandofthemicetreatedby ovaryhormonesafterovariectomy.inordertoinvestigatetheregulationofovaryhomlonesontheLeyoligosac cbarideantigenexpressionTheresultsshowedthatthetranscriptionlevelofFUT1andFUT4genesdecreased duringearlypregnancythroughdays1— 5.whichwasinagreementwiththeincreasinglevelofprogesterone.In theovariectomizedgroup,thetranscriptionLevelofthegenesdecreasedsignificantlyafterprogesteronetreatment andincreasedafterestrogentreatment.and州 sattheintem~ediateIevelinthegrouptreatedwithbothhor— monesI'hebiosynthesisofIeoligosaceharideparalleledwiththetranscriptionofFUTlandFU7,4gene. TheseresultssuggestthattheexpressionofLP'oligosaceharideintheendometrialepitheliumofmiceisregulated altheleveloftranscriptionofFU7,landFU丁 4genesItsuppressedhyprogesteroneandstimulatedbyes— trogen.andtheeffectsofbothhormonesareinantagonism. KeywordsLe;fucosyltransferase;endometritm~;hormonecontrol;pertimplantation Received:April2,20131Accepted:Jutlc4,2001 This,~Y)rkwas.~pportcdbytheNationalNatureScienceFou0dalionofCna(No39870184) Corrc_N~ondirlgauthor:Td,864114720616;email,zmhu@meildlpttIncn