小鼠肠系膜苏丹三染色

小鼠肠系膜苏丹三染色 山东大学实验报告 2011 年11 月 3 日 姓名系 2010 生科组别 同组者 科目 细胞生物学实验 目 学号 【实验目的】 了解原代培养的基本及操作过程。学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制及酸碱度的调节。初步掌握无菌操作方法。学会分辨死活细胞，掌握细胞计数。 【实验原理】 (一) 原代细胞培养 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织(或器官)，经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求:一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 (二) 细胞死活鉴定 死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。 染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括: 死活细胞细胞膜通透性的差异:活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过;而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。 死活细胞在代谢上的差异:是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色;而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。 除此之外，还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红是一种低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色;死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝-中性红混合染色法。 悬液中细胞的精确计数，往往采用血细胞计数器。 【实验材料】 小白鼠,剪刀，棉球，75%酒精，移液枪，无菌操作台，正置光学显微镜，倒置光学显微镜，解剖盘，滴管，离心管，离心机，注射器，离心管，培养皿，酒精灯，塑料培养皿，载玻片，盖玻片，血细胞计数板,试管,吸管,细胞悬液,台盼蓝,伊 1 山东大学实验报告 2011 年11 月 3 日 姓名系年级 2010 生科组别 同组者 科目 细胞生物学实验 题目 学号 红,NaCl溶液。 【实验步骤】 (一) 细胞的原代培养 1. 取材: 取小鼠一只，采用断头法处死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒3min，取出转入超净工作台内的解剖盘中，无菌操作打开腹腔，取出其脾脏，除去其周围的脂肪组织，并用PBS液自上而下淋洗1-2次，转入无菌培养皿中待用。 2. 分离脾细胞: 用滴管向培养皿中注入30滴PBS缓冲液，再用’L’型针头注射器在皿中吸取0.2毫升PBS液注入脾脏，注射时沿长轴注射。然后再用针头在脾脏上扎眼，并用’L’型针头轻轻刮出脾细胞。在均匀吹匀脾脏细胞。 吸取上述分离的单个脾细胞悬液，放入Eppendorf管中，使量至1mL，以1000r/min离心5min。 3. 培养脾细胞: 取塑料培养皿一套，用移液枪吸取培养液2mL加入塑料皿中，并将皿标记待用。取离心后的Eppendorf管，弃去上清液，用移液枪(200ul)吸取塑料皿中的培养液400ul加入弃去上清的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料皿中，混匀后放入37?C，5%CO2的培养箱中培养。 (二) 细胞死活鉴定及计数 1. 试剂配制:用生理盐水配成5%Tyrpen Blue染液，备用。 2. 取细胞: 将培养箱中的培养皿取出;先用肉眼，然后用显微镜观察培养的 细胞。记录细胞悬液的颜色是浅紫色;同时和其它组的培养皿进行对比，观 察培养液的颜色是否正常，同时分析原因;敲打培养皿，使得贴壁细胞释放 出来，旋摇培养皿，使细胞充分悬浮 3. 染色: 取0.5mL细胞悬浊液放入试管中，加入1-2滴染液。混合。 2-5min后将细胞放在血细胞计数板上观察死活情况，注意不 要有气泡产生，放大倍数为10x10。染色后活细胞不着色，死 细胞显示蓝色。注意染色时间不能超过15min，否则染液将细 胞毒杀。 4. 计数: 在10x10倍的显微镜下观察，计算血细胞计数板的4个小 方格的细胞数量。包括细胞总数与死细胞数量。压线者计上不 计下，计左不计右。 :细胞浓度(个/ml)=4个中等方格内的细胞总数?4×10000× 稀释倍数。 5. 计算细胞活力: 公式:细胞活力=(活细胞数/细胞总数)×100? 【结果记录】 试验照片截图 2 山东大学实验报告 2011 年11 月 3 日 姓名系年级 2010 生科组别 同组者 科目 细胞生物学实验 题目 学号 针尖所指处示死细胞 死细胞由于细胞膜的通透性丧失而被台盼 蓝染成蓝色。 针尖所指处示活细胞(海拉细胞) 活细胞未被染上颜色 利用血球计数板计数结果如下: 左上 右上 右下 左下 中方格 总数 活细胞 0 2 2 1 2 7 死细胞 1 3 2 2 4 12 计算得成活率为36.84%。 【结果分析】 本次实验中我们小组所测细胞活力为36.84%，并不算高，而这还是加入海拉细胞后算的的，也就是说我们培养的细胞在培养过程中基本全部死亡,分析得应有以下原因可能影响实验结果(包括误差): 1.当时在刮取胰腺细胞时可能量太少 2.由于刚取出培养皿时观察到其中有白色絮状物，因而我们可能在无菌操作的过程中操作不规范，导致染菌，极大的影响了观察，导致实验失败; 3.在离心分离呈单细胞的过程中离心机转速过快或时间过长很可能会导致 细胞破裂，导致小鼠脾细胞大量死亡; 4.染色时间过长，或观察时间过长都会导致染色试剂将细胞杀死，使细胞活 力骤降，这是导致细胞活力比较低的重要原因; 3 山东大学实验报告 2011 年11 月 3 日 姓名系年级 2010 生科组别 同组者 科目 细胞生物学实验 题目 学号 5.实验中的一些操作不正确或不规范的情况、计算带来的误差等也会直接导致实验误差。 【实验注意事项】 1、当遇到位于大格线上的细胞，一般只计数大方格的上方和右方线上的细胞。 2、轻轻敲打培养皿的侧壁，不要用力过大，以免破坏培养皿; 3、染色过程要混合均匀，以免影响染色效果; 4、在细胞计数板上滴上细胞液时，量要适当，而且位置要适当，不要过多，以免污染镜台和物镜; 5、在显微镜下观察时要轻微调节视野，观察到适宜的视野进行计数统计; 【思考题】 1. 细胞冻存与复苏 细胞的冻存 【用品】 (1) 5%胰蛋白酶 (2) 含10%~20%血清培养液 (3) DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(15磅蒸汽高压消毒) (4) 吸管、离心管、冻存管 【步骤】 (1) 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存， 但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。在冻存前 一天最好换一次培养液。 (2) 用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需 处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。 (3) 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液(含 10%DMSO或甘油)，冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。 用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。 (4) 装完细胞后的冻存管即可直接冻存。以本教研室对L929的冻存程 序作为大家进行细胞冻存的参考:将冻存管放入4?冰箱 2hr;-20?冰 箱2hr;液氮表面过夜。以后取出冻存管移入液氮容器内。在放入液氮时， 要带手套操作以免冻伤。 细胞在液氮中储存时间理论上是无限的，但为妥善起见，特别是很多为 被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次观察细胞对冻存的适 应性。已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存。 细胞的复苏 【用品】培养液，吸管，离心管，培养瓶，37?温水 【步骤】 (1) 从保存冻存管的支架中取出冻存管应直接投入37?温水中，并不 时摇动令其尽快融化。如果冻存管密封不严，在保存过程中液氮进入冻 存管中，从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸，可 4 山东大学实验报告 2011 年11 月 3 日 姓名系年级 2010 生科组别 同组者 科目 细胞生物学实验 题目 学号 能会危及面部等。因此，存取冻存管时都要佩戴眼镜和手套。 (2) 从37?水浴中取出冻存管，用酒精消毒后，拧开冻存管，用吸管 吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心， 除去上清液，在重复用培养液洗一次。 (3) 用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37?温箱静置培养，次 日更换一次培养液，继续培养。如果复苏时细胞密度较高要及时传代。 细胞复苏时细胞数可以做10~20倍稀释，接种密度以5×105/ml为宜。 2.抑制肿瘤细胞增殖药物的筛选方法。 细胞增殖周期调控 因为肿瘤细胞失去了正常细胞的控制机制，在癌组织中的细胞更倾向处于细胞分裂期。根据这一理论，许多抗癌药物作用于处于分裂期的细胞。如抑制DNA合成的抗代谢药物和抑制微小管有丝分裂形成的微小管蛋白结合剂就是根据此概念发展而来的。 细胞分化诱导剂 通过诱导肿瘤细胞凋亡达到肿瘤缩小、消退的目的已成为当今肿瘤治疗的研究热点。促进恶性细胞向成熟分化的抗癌药物称分化诱导剂。维A酸类化合物维甲酸类化合物(Retinoic acids)在调控细胞生长、分化、凋亡等生命活动中起重要作用。其在体内的生理活性代谢产物包括全反式维甲酸(ATRA)、13-顺维甲酸(13-cis-RA)和9-顺维甲酸(9-cis-RA)，它们可通过核维甲酸受体(RAR)结合于DNA应答元件，从而调节靶基因的转录。 以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物 a、蛋白酪氨激酶(PTK)抑制剂，PTK是一组酶系，能催化ATP上的磷酸基转移到许多重要的蛋白质的酪氨酸残基上，使其残基磷酸化，从而激活各种底物酶，通过一系列反应影响细胞的生长、增殖和分化。 b、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，通过扩散进入肿瘤细胞，与 EGFR 的胞内段激酶结合区结合，从而抑制 EGFR 受体的磷酸化，阻断受体下游信号通路的传导，发挥抗肿瘤作用。 C、法尼基转移酶抑制剂，法尼基转移酶是近年来发现的与Ras蛋白异戊二烯化修饰密切相关的一种必需酶。抑制法尼基转移酶活性，阻止Ras蛋白的活化，可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖 基因治疗 正常细胞存在一套完整的DNA修复机制，而肿瘤细胞一些基因的突变使其失去此功能。这给抗癌药物的发展提供了一个新方向:一是可以用基因工程的方法修复这些缺陷;二是可以促进肿瘤细胞的这类突变，使肿瘤细胞对化疗更敏感。 肿瘤的耐药逆转剂 根据肿瘤耐药的特点可分为原药耐药(PDR)和多药耐药(MDR)两大类。前者只对诱导药物产生耐药性而对其它药物不产生交叉耐药性，如抗代谢药甲氨蝶呤(MTX)，5-氟尿嘧啶(5-Fu)等;后者则是指肿瘤细胞一旦对某种化疗药 5 山东大学实验报告 2011 年11 月 3 日 姓名系年级 2010 生科组别 同组者 科目 细胞生物学实验 题目 学号 物产生耐药性，同时对其它结构上无关、作用机制各异的药物也产生交叉耐 药性，这是一种独特的广谱耐药现象。许多天然来源的抗肿瘤药物如秋水仙 碱、紫杉醇等及蒽环类抗癌抗生素如阿霉素、柔红霉素都极易发生MDR。 肿瘤耐药性可能与减少对药物的吸收与摄取、加快药物的降解代谢、加快 药物从细胞内的排出以及特殊蛋白的表达有关。已发现多种与耐药性有关的 基因，抑制这些基因的表达可望达到提高或恢复肿瘤组织对药物的敏感性。 肿瘤新生血管生成抑制药物 原发肿瘤的生长和转移是依赖于新生血管生成的，开发和研究能够破坏 或抑制血管生成、有效地抑制肿瘤生长和转移的药物(称为TA 抑制剂)，是 新型抗肿瘤药物研究的活跃领域之一。 单克隆抗体药物 单克隆抗体(单抗)药物就是通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制 备的抗体。起初用于诊断剂或检测剂，后来用于治疗肿瘤、病毒性感染、心 血管病以及其它疾病。治疗肿瘤的优越性: (1)单抗药物对肿瘤细胞的选择性杀伤作用 (2)单抗药物具有更高的疗效 (3)单抗药物对肿瘤相关靶点的特异性作用 其研究重点主要集中在将抗体与化学药物、酶、放射性核素、毒素和生物 诱导剂等耦联后直接杀伤肿瘤或者利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血 管生成等方面。目前，国际上与肿瘤治疗相关的抗体研究主要集中在将抗体 与耦联物作用后直接杀伤肿瘤细胞，利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤 血管生成等方面。 抗肿瘤药物的筛选和评价 抗肿瘤药的临床前药理研究包括药效学和毒性研究两部分 抗肿瘤药物药效学需研究内容:体外抗肿瘤试验、体内抗肿瘤试验 评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以做出正确的结论。 体外试验常用方法有: 染料排斥法、四氮唑盐还原法、阿拉马蓝法、磺酰罗丹明染色法、集落形成 法、生长曲线测定法。 药物与细胞共培养时间一般为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照。 体外筛选方法的优点:操作简单，用药量少，取材可直接用于人体肿瘤，得出结果快速 体外筛选方法的缺陷: 1、细胞毒性易显阳性，有毒物质也常常显阳性，故假阳性率高 2、非直接对肿瘤细胞作用的药物显示假阴性 3、体外细胞并不能完全代表体内肿瘤的恶性细胞 6 山东大学实验报告 2011 年11 月 3 日 姓名系年级 2010 生科组别 同组者 科目 细胞生物学实验 题目 学号 体内抗肿瘤活性试验 1、自发性肿瘤2、诱发的肿瘤3、移植性肿瘤(a)皮下肿瘤模型 (b)腹水瘤模型 (c)原位接种模型 。 3.诱导肿瘤细胞发生凋亡的药物的筛选方法。 细胞调亡这一过程涉及到细胞内外的一系列信息传递过程。进入这一过程的细胞发生一系列的特征性形态学和生化的变化，以至最终死亡。许多人类疾病据说与细胞凋亡的增加或减少有关。肿瘤细胞可能失去细胞凋亡的功能，恢复这一功能可用于肿瘤治疗。现认为大多数临床使用的抗癌药物可引起特定癌症细胞的细胞调亡。另外，与正常细胞相比，肿瘤细胞对细胞凋亡的诱导更为敏感。这或许可以解释作用于细胞分裂的抗癌药物为何更易杀死肿瘤细胞。现发现某些癌基因的激活及肿瘤抑制基因的丢失可抑制细胞凋亡，因此，如能抑制癌基因或修复肿瘤抑制基因功能或许可以解决某些癌症对现有化疗药物不敏感的问题。研究细胞凋亡是近年来分子生物学领域的一个热点，许多与细胞凋亡有关的信息传递、蛋白酶活性的研究可望为肿瘤治疗提供更新的手段。天然产物诱导肿瘤细胞凋亡的主要作用机制包括下调或上调细胞增殖/凋亡相关基因的表达、调节细胞周期和调节端粒酶基因表达或端粒酶活性等.许多天然产物可经过多种机制诱导肿瘤细胞凋亡.另外 生长抑素及其类似物具有明确的促进肿瘤细胞凋亡的作用 7