大熊猫粪样内类固醇激素保存方法及应用研究

大熊猫粪样内类固醇激素保存及应用研究 北京林业大学 硕士学位论文大熊猫粪样内类固醇激素保存方法及应用研究 姓名:崔媛媛 申请学位级别:硕士 专业:野生动植物保护与利用 指导教师:胡德夫 20080601 摘要 摘要 目前利用非损伤性激素测定已可有效监测圈养大熊猫(彳,觑仰,如，，,,肠以,彪“?)的各项类固醇激素水平，并进一步了解其繁殖及应激状态。但对于这一方法在野生大熊猫中的应用，尚须考虑取样延迟、野外保存等多方面的问题。本文着重研究了大熊猫粪样中四种类固醇激素的常温保存时效、保存方法以及粪样的干燥方法，旨在为野生大熊猫各项非损伤性内分泌监测工作奠定一定的理论基础，并以此推动今后野生大熊猫的保护工作。研究结果如下:,(在新鲜粪样排出后，雄性大熊猫粪样中睾酮、皮质醇以及雌性个体粪样中的 睾酮，在室温条件下放置的时间不宜超过,,小时;而雌性粪样中的皮质醇 和雌二醇的保存时间也分别不宜超过,,及,,小时;孕酮则应小于,小时。,(,,,乙醇保存法可在室温条件下稳定保存雄性皮质醇,,天，雌性雌二醇,, 天;烘箱干燥保存法(,,?，,—,小时)可稳定保存雌二醇,,天。考虑野 外工作的需要，依据试验数据的稳定性，大熊猫粪样内睾酮、皮质醇、雌二 醇,种激素在相同的处理和保存条件下，可在,,天内进行相对值的比较研 究，而孕酮则需要另行探索其它保存方式。,(仅冷冻保存的雄性大熊猫粪样中的皮质醇及雌性个体中的雌二醇，以及使用 ,,,乙醇常温保存粪样的孕酮经由烘箱干燥后，与冷冻干燥后的测定值间无 显著性差异。因此对于冷冻保存及乙醇常温保存的粪样，均应尽可能采用冷 冻干燥 ”在的方式进行处理。,(在,,,,年,月一,月，北京动物园雄性大熊猫“大地进入发情期后，粪样 中的睾酮在,月,日达到高峰值(,(,, ,‖,)，并在发情结束后再次下降至基 础水平。而雌性个体“妞妞”在,,,,年未出现任何明显的发情迹象，其粪样 中雌二醇水平也未出现明显的上升，总体呈无规律变化。,(在五一黄金周期间，随着客流量的明显上升，雌雄个体粪样中的皮质醇水平 均出现了明显的升高。其中雄性大熊猫粪样中的皮质醇含量的变化与前一日 的客流量显著性相关，而雌性个体粪样中的皮质醇水平则与前一日客流量存 在极显著的相关性。关键词:大熊猫，非损伤性方法，粪样类固醇激素，保存方法，保存时效 ,,,,;,, ,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,, ,,;,, ,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,, ,,,, ,,,,,,,;, ,, ,,,,,;,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,:,,, ,,,,,,,, (,,,;,,,,, ,, ;,,,,,,,,,,, ,,, ,,,，,,,,,,, ,矗, ,,,,,,(, ,,, ,,,,, ,,,,;,,, ,, ,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,，,,,, ,,珊,,, ,,,,，, ,, ,,, ;,,,,,,舀柚, ,卸,嬲,砌玛口,如砌,，(鳓;曲;柚,, ,,,,;,;?,侬宅,,,,, ,弛,,,—,,,,,,; ,,,,,,,, ,,肛,,,,，锄, ,(伽,,, ,?,,,同,, ,,,,,,,;,,鲫锄, ,仃髓, ,‰,, ,,,锄(,,?,,、，盯，,加, ,,,,;,, ,,,,,, ,; ;,,,,,册甜,, ,,,,,,，唱?燃, ,?血,鹄,,, ,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,，跚;,舔,,呻,?,,,?,,,,,,，,, ,胁,,, ,,,,,, ,,,,，,,;(,,,,, ,,胛 ,,,;?,,, ,,, ,行酏,, ,, ,,,,,嗽,, ,，髑,?,,, ,, ,,,,,,, ,,,奶, ,,,,,,,, ,, ,,,, ,,面咖,,, ,, ,,觚, ,,,,,，,,, ,,，,,,,, ,,, ,仃,;,,,, ,,,,,,缸, ,, ,,,忸,,,,,,,,他,,,盱,,蠡?,,,,, ,,?。,,,,, ,, ,,,,,，,,,,,，,, ;,,,,,, ,掰娟;,, ,,,,,,撕?,, ,,,,,,,嬲,,,?,,;血, ,,,,,,血,氨,,丽,,百锄, ,柚,,(,,, ,,,,, ,闼】,,, ,陀,,,,,,勰,,,,,,,: ,( ,,;,, ,骼,,,,,,;咀, ,,, ;硎,,, ,, ,, ,,,,百,,, ,,,,,，,,, ,,,, ,懿,,,,,,,,, ,, ,(,,,,, ;,,,, ,, ,,,, ,丘酏吐,,,, ,，,, ,, ,,,墙,, ,,,, ,,靴,,,, ,舵, ,,纸,,,?(,,圮;,,,,,,, ,, ,, ,(锄,,, ;,,,, ,, ,,,同,,, ,, ,,,娼，锄, ,,昀,,, ,,, ,, ,,,墙(,,?例,,,,, ,胝,,,, ,,,,,,, ,,，,, ,, ,懿, ,，瑚, ,伽,,,, ,,,,豁,,,,,, ,,,,,, ,, 瞒(,( ,?,, ;硎,,, ,, ,,, ,,,, ;,,,, ,; ,,,同,丘,,,,,,矗?,, ,,, ,,, ,,舰,,,, ,, ，,,,‰,,, ,,, ,, ,,),, ,, ,,,础,?,们,缸,,,,;慨,,懿的,,,, ,, ,,,,‰,,, ;,,,, ,, ,胁,,,,, ,,,同 ,,,, ,,, ,,锄蛳,仃,,,，,?,(,,?，,,, ,,(,, ,, ,,,,),,啪, ,?,,,,,,啪，;,,,,,,,丽,, ,,圮;,,仃,, ,啪,,铭,,,,, ,,,，,, ,,,,,,,娩,,锄,饮仃,;,,, ,,,础,,,,,(, ,, ,,;,,;,,,, ;,,,,,,,,, ,, ,髂,, ,, ,,,, ,,,, ,切,,,,,)，勰、鹏,嬲,,,,,、?,,，,,,, ,,,撕,, ,,,,嚣,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,，;,,,,,,姐, ,,仃,,,,, ;,,,, ,;璐,, ,,唧撕,,船,,,、),,,锄舯,,,勰,,,，,, 雕,,?,, ,, ,, ,锄,洳,,,,，,淄,,讹,衄饥,、?,,沛,, ,,,,(,, ,,,,,, ,,, ,,耐,, ,,,, ,,,,懿,,,,,,，,,,钾,,’,,,,,,, ,缸,,, ,,，,,,铭( ，， ,,,,,,,,,(,,, ;,,,?,,,,,, ,,饥,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,, ,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,印,,,;觚,,,，既;,,, ,,, ,,, ,,,, ;,,,,,,锄, ,(锄,,, ,,把,,,,, ,,?坞舶,?,,,,,铝，锄, ,,, ,(锄,,, ,,,,,,,,,,,; ,,,同谢,,, ,,,,,锄,,(,,饥;,,,,,,?,,,,,她,,,,,,,,,,,,?,,?,,, ,, ,, ,,,旧,,, ,, ,吨, ,,?, ,【,,,, ,, ,,,,,, ,,铭(,( ,, ,,,;,(,,, ,, ,,,,，,,,,矗。;,,,,,,,,,,,,,, ;,,;?,嘶,,, ,, ,,,,百,, ,孤,,”,, ,,,(,, ,,,, ,蜘,，,, ,,, ,，,;，，,舔,, ,,血, ,,,,,,,,,, ,骼,璐，姐, ,勰?,,,,【,, ,,,,,(,(,, ,,儋),, ,,, ,，,,?出口,,,, ,, ,圮,舔,; , ,,,, ,,,,, ,,，,, ,懿仇玛(,,,,,, ,,,,,,,,,,’,,,, ,,,” 印,,,同,, ,,,,叽, ,销缸哪,,,,,,,, ,, ,,,,，锄, ,,,懿砌,,, ,,,,,, ,,, ,,,芦髓锄,,, ,,,,,啪,,,,,, ,,,,,,, ,,,,?锄锄,，,,,，,,,, ;,柚,,(,(,,,, ,,,, ,,,,,哪,,,,,,, ,, ,,,,,,,,，,,, ,托,, ;硎,,, ;,,;饥觚,,,邶,,;,,髂,, ,,鲥,,;蛆,，, ,,,, ,,姗,,孤, ,(锄,,,百锄, ,卸,,缸恤, ,,, ,,, ,,,,饥,,,,(,,,,, ,,,, ,,鲥,,;,,, ;,玳,,,,?,,,、)，，嘲,,,, ;,,,,,, ;,,;饥昀,,,, ,, ,,,,锄, ,,,, ,,,、，,,,,以,, ,,,,,,,, ,啪,, 锄, ,,可,,,,,丘;,,, ;,,,,,,,,,, ,,炯??, ,,,训,,, ;,玳;咖,,,, ,, ,(锄,,, ,,, ,,,访。啪—,,, ,,,—,,, ,,,,,,,,, ,,,,,: 嬲,,, ,,,,,,,,，,,;,, ,,百觚, ,狮,如，,,,,,,? ,,,,,,，,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,， ,丘(,;,,,, ,,,,,,, ,,〕【,,, ? 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下(或我个人……)进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京林业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名: 日 期: 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京林业大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 (保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名: 导师签名: 日 期: ,引言,引言 大熊猫彳,砌研，,如聊,肠加彪“?，属食肉目,,,,,,,,,，大熊猫科,,,,,,,,,,,,,，大熊猫属彳,砌印,出，为我国特有的珍惜濒危物种，在《中华人民共和国野生动物保护法》中，被列为国家一级重点保护野生动物。现今，大熊猫的繁殖生物学特性及生存状态一直备受关注，其中包括对大熊猫发情、排卵、妊娠周期、假孕现象及对自然环境、人为干扰造成的应激性等多个方面(高凤歧等，,,,,;胡锦矗等，,,,,;黄炎等，,,,,,，,,,,,)。传统的行为观察结果常因个体差别及外界环境干扰等存在一定的差异性，仅通过行为学方法判断大熊猫繁殖状况及应激状态的准确率相对较低(张和民和王鹏彦，,,,,)，在野外，行为观察法更是受到多方面的限制;而从生理学途径出发，利用各项类固醇激素的分泌水平可更为准确的反映动物的生殖和应激等生理状况(沈孝宇等，,,,,;王玢等，,,,,)。相对于血液分析法，应用非损伤取样及技术研究掌握大熊猫的繁殖状况及生存健康状态，对大熊猫各项保护活动的开展将具有良好的推动作用。,(,类固醇激素的生理作用 动物的类固醇激素主要包括糖皮质激素、盐皮质激素两项类固醇激素以及雄激素、雌激素、孕激素这三类性激素(沈孝宇等，,,,,)，这类激素的分泌量及变化反映了动物的生殖和应激等生理活动，是动物健康状态的重要生理指标，因此被广泛应用于野生动物的生理学研究。,(,(,雄性激素 雄激素(锄,,,,,,)为睾 酮(,,,,,,,,,,,,，,)、双氢睾酮(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,)等多种雄性激素的总称，其中以睾酮为主。雄激素主要由睾丸的间质细胞合成，另外，肾上腺皮质、卵巢也能分泌少量的雄激素。睾酮的生理作用主要为促进雄性生殖器官的发育和第二性征的出现，促进精子的发生与成熟，刺激并提高雄性性欲等。睾酮还与雄性的交配行为和社会行为密切相关(郑亦辉，,,,,;王玢等，,,,,)。,(,(,雌激素 雌激素(,,仃,,,,,)主要包括雌二醇(,,仃,,,,,，,,)、雌三醇(,,,,,,,，,,)和雌酮化合物(,,们,, ;,,,,,,髋，,,,)。其生物活性以雌二醇为最高，雌酮化合物次之，雌三醇最弱。排卵前的雌激素主要由卵泡内膜分泌，排卵后的雌激素则主要由黄体细胞分泌，另外胎盘也可分泌一定的雌激素。雌激素在促进雌性动物生殖器官的发育方面发挥着重要的作用，比如输卵管、子宫等生殖器官的正常发育以及输卵管节律性的收缩等，都与雌激素有内在的联系;此外雌激素在卵泡发育 , 大熊猫粪样内类同醇激素保存方法及应用研究到成熟卵泡形成的过程中也是不可或缺的，雌激素水平低下常会造成雌性个体无排卵、或有排卵但不能正常受孕的情况(沈孝宇等，,,,,;郑亦辉，,,,,;王玢等，,,,,)。,(,(,孕激素 孕激素(,,,,,,,,,,,,)对动物正常生殖机能的维持具有决定性作用，主要包括孕酮(,,,,,,,,,,,,，,,)、孕二醇,,,,葡糖苷酸(,,,鲈,,,,,,,,,, ,,,,,,酉,;,,,，,,,,’,,,)和,,(羟孕酮(,,一,, ,,,,,,,,,,,,)，其中孕酮是孕激素生理上最重要的代表激素。孕酮在妊娠前期主要由黄体产生，而在妊娠晚期则主要由胎盘组织分泌。孕酮在妊娠期间能抑制丘脑下部中枢发出促进卵泡成熟和排卵的冲动，可抑制妊娠期的再发情(陈玉燕，,,,,);高水平的孕酮浓度作用于子宫，还有利于胚胎的稳固，维持受精卵的着床，减少流产;此外，孕酮还通过对中枢的作用，抑制催产素的释放和子宫肌肉的自发性活动，使子宫保持稳定(沈孝宇等，,,,,;王玢等，,,,,)。在雌性动物体内，雌激素与孕激素协同作用，共同维持者雌性动物生殖内分泌的平衡。,(,(,皮质醇激素 皮质醇(;,,,,,,)，又称氢化可的松，其分泌和生成在促皮质素 (;,,,,;,仃,,,,,，,,,饥,(;,,,;,(仃,,,,,,,肌,,,，,,,,)的作用下，于肾上腺皮质处进行，为糖皮质激素类(西,;,,,,,;,,,)中的主要组成部分。皮质醇生理作用十分广泛，几乎影响到全身各种组织细胞对糖、脂肪及蛋白质的代谢。除此之外，皮质醇水平亦可增强机体的应激能力，因此也经常被作为判断动物机体对于刺激因素，即应激原的应激反应程度的重要因子(沈孝宇等，,,,,;肖向红，,,,,;王玢等，,,,,)。,(,非损伤性内分泌分析方法的发展 监测动物体的各项类固醇激素水平是一种探查其繁殖状况、健康程度、应激水平的有效途径。传统的类固醇激素研究途径是采集动物个体的血液样品进而分析激素水平，并业已形成了完善的内分泌分析测试方法(,,,,,,,,’,,,,;,,,,,，,,,,;,,,;,,,,;,，,,,,;,,百,,甜口，(，,,,,)。施少清等人也曾对受过训练的圈养大熊猫进行血样的采集以测定其中性类固醇激素的含量(施少清等，,,,,;曾国庆等，,,,,)。然而对于野生动物而言，采集血样存在明显的缺点，即血样采集过程必须诱捕、保定乃至麻醉动物，因此会影响动物正常的内分泌水平，干扰动物的正常生理状态， 一些麻醉剂还有可能干扰或阻碍雌性动物排卵或造成物种的应激性，因而导致测定结果出现偏差，且对于一些敏感物种而言，强迫性的采样过程还会造成动物生理和心理的损伤(,,,,,,锄, ,,,曲,,,，,,,,;,,,,,,甜口正， , ,引言,,,,;,嘶。甜以，,,,,)。大熊猫的相关研究也表明多次的麻醉可能影响大熊猫的正常排卵(喻述容等，,,,,)，且麻醉本身也会造成大熊猫应激水平(皮质醇)的上升(李俊，,,,,)，由此可见，通过抽取大熊猫血液进行多方面的内分泌监测，同样会对大熊猫机体造成不必要的伤害，影响正常的内分泌水平，因此非损伤性方法在判定大熊猫的繁殖状况及大熊猫的应激水平方面具有重要的意义。 ( 非损伤性(,,,(,,,,,,,,)的激素测定方法即是在动物不受人为干扰的情况下，采集其粪样、尿样、唾液等物质提取类固醇激素或其代谢产物，进而测定动物的激素水平。非损伤性取样方法克服了机械保定或化学麻醉对动物正常生理活动的影响，同时避免了人为干扰对动物激素分泌与释放的影响，具有极为广阔的应用前景(,,,,,,纠口,(，,,,,;,,,,,,锄,鼬,,,嘶,,，,,,,;李明等，,,,,;刁晓平等，,,,,)。 通过采集尿样并研究和监测野生动物类固醇激素是应用最多的一种非损伤性方法，研究对象饕 歉髦秩ρ 吧 铮ǎ拢铮睿睿澹 鹂谡 保梗福玻唬停铮睿妫铮颍籼鹨裕 保梗福罚唬滩浚保澹 澉 矗幔簦颍椋悖耄 保梗梗保唬龋椋睿洌欤迦幸裕 保梗梗玻唬剩酰颍耄逄鹨裕 玻埃埃埃谎植识鸬龋 玻埃埃常唬模澹瑁桑欤 ,杂谧杂缮 畹囊吧 铮 黾 ü 杉 心蛞欤欤幔颍涮鹂谡 玻埃埃叮 旱难? 测定野化家马励材船?施刀淞(鼬,,,,,,,;,所以，,,,,)和狼,?玎括缸,淞(,;,,,,甜口正，,,,,)的激素含量。显然，对于大多数野生状态下的动物，它们排出的尿液会很快渗入土壤当中，雨天或过于潮湿的天气也都可能冲淡、稀释尿样，若收集植被上残存的尿液，样品量可能达不到测试的需要。这可能是未见这种收集方法的主要原因。唾液也可成为类固醇激素测定的非损伤性样品，,,,吼,,,等(,,,,)曾采集唾液用于监测野生动物的排卵周期。然而，唾液样品采集仅适于圈养条件下且驯化良好的动物个体，显然不适用于野生状态下的动物。 比较而言，动物粪样在野外具有较高的辨识性，且能在排泄之后保持相对较长时间的稳定性(,,,,,,甜口正，,,,,)。同时，相关研究也大多数动物的类固醇激素在血液和粪样中具有很高的相关性(,缸,,,甜口正，,梗福福唬蹋幔螅欤澹 洧 颍耄?,,,,,,,，,,,,;,锄,,,,,甜以，,,,,;，,,,,,,,刃口正，,,,,)。虽然有研究表明，日粮中纤维含量的差异可能会部分地影响肝一肠循环，从而导致肠内类固醇激素的改变，影响粪样中类固醇激素的含量(,,,,,,湖】,,甜以，,,,,;,,,,,甜口,(，,,,,;,,,,,, ,,口,(，,,,,)，但,,,,,,等(,,,,)的研究证明，季节性食源的变化对野生状态下动物粪样中的类固醇激素水平影响较小，这也为通过粪样途径研究野生动物类固醇激素变化提供了理论基础。另外与血样相比，由于胃肠的蠕动时间要更长一些，粪样内的类固醇激素会在分泌后的,(,—,天内排出(,?眩甜以，,,,,;,,,西,, ,,口正，,,,,;,,,,,,,,锄,,口正，,,,,;,,,,,,,, ,,口正，,,,,)， 当要澳, , 大熊猫粪样内类同醇激素保存方法及应用研究定野生动物的排卵时间或者研究激素与行为变化之间的联系，还必须 考虑到时间延迟的问题。,(,粪样内分泌分析法在野生动物研究中的应用,(,(,粪样内分泌分析法在繁殖监测中的应用 在过去的,,年中，非损伤性方法已广泛应用于监测动物园、野生动物园、保护站以及自然保护区野生动物的内分泌生理变化。目前国内的研究主要还集中对圈养动物激素水平的监测方面，主要涉及麋鹿尉印，“,如’，砌刀淞(李春旺等，,,,,)及黄腹角雉死卿,口刀?,,打(张雁云等，,,,,)的繁殖行为与性激素分泌水平的相关性研究，雌雄小熊猫彳,胁,(屈红甩,的繁殖启动、发情监测、妊娠诊断(李春等，,,,,，,,,,,，,,,,,)，以及雌性海南坡鹿,台，(埘(,眦(协加口删,的早期妊娠诊断(刁晓平等，,,,,)等方面。相比较而言，国外针对野生动物的繁殖监测，开展了较多的研究，其中对野生灵长类动物的研究较为广泛。但由于受个体识别困难，采样难以保障因素影响，对自由生活状态下的野生动物内分泌生理监测的研究尚处于初级阶段，所涉及的方面明显少于圈养类野生动物。,(,(,(,灵长类动物 雌性灵长类个体粪样内性类固醇激素水平的监测可推测其排卵周期及受孕情况。野生 ?纽(,,,,,,,,甜口正，,,,,)在排卵前期粪雌性日本猕猴拖;口?触 样中也会出现雌酮化合物的峰值;成功受孕的雌性黑掌蜘蛛猴彳胞协舻咖)，, (,,,,,,,刃以，,,,,)和非洲黄狒狒尸;矽,,册,;印施加(,缸,,,酎口正，,,,,)的粪样中也均可观察到发情期后孕酮含量的明显上升，此外,锄,,,,,等(,,,,)还观察到一只流产黑掌蜘蛛猴粪样中孕酮的含量会在妊娠中期突然下降;而,仃,,,等(,,,,)也通过粪样内性类固醇激素的水平变化成功估计出毵蛛猴曰,口幽,纪胁口,幽疗,以铬的卵巢周期及妊娠期长度。另外,,,,,,,,等(,,,,)还发现野生猕猴粪样中的雌酮化合物峰值要低于圈养情况下的峰值，并且野生雌猴在怀孕早期粪样中孕二醇(,,(葡糖苷酸的水平相当于圈养雌猴黄体期的孕二醇(,,(葡糖苷酸水平，表明自由生活状态下的野生动物内分泌水平与圈养情况下可能存在着差异。 此外，,缸,,,(,,,,)通过检验怀孕的雌狒狒黄体前期粪样中孕酮含量，发现孕酮水平在旱季初期明显高于雨季初期，他认为孕酮水平是雌性狒狒能否成功受孕的影响因子之一，在生存条件较差时，通过孕酮水平的调节，可减少最易受劣质环境影响的雌狒狒的怀孕率，因此内分泌水平有时还可成为生殖调节的因子。 在野生状态下雄性灵长类的研究主要集中在雄性争斗行为与内分泌水平的相关性方面，,,,;,,,,等(,,,,)通过研究粪样中位于不同社群等级的维氏冕 , ,引言狐猴,加,砌,;淞垤朋阳刎粪样中的睾酮的分泌量与雄性的非接触型攻击行为具有显著的相关性，但与接触型攻击行为的相关性不显著;而当有孤独的雄性个体出现时，另一社群内雄猴的睾酮水平也会上升，并伴随有争斗性行为的上升 (,,,,,,,,,—,,,,,,,,甜口正，,,,,)。,(,(,(,非灵长类动物 对自由生活状态下的野生动物生殖内分泌研究也涉及到其他一些非灵长类动物。,,,,,,,,等(,,,,)利用粪样中的孕激素对黑犀牛,,?聊,记,肌厶进行妊娠诊断，发现在妊娠期间怀孕犀牛粪样中孕酮的含量明显高于未怀孕个体的水平。,,,,,,,,;,,等(,,,,)也发现妊娠期中，成功受孕的野生加拿大盘羊们括;口疗口如瑚妇粪样中的孕二醇(,,【(葡糖苷酸和孕二醇(类孕酮代谢物(,,,,，,,,趴锄,,,,,(,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,)水平均显著高于未怀孕个体，表明这两种孕激素代谢产物 可作为加拿大盘羊是否受孕的指示激素。而,枷,,,,等 (,,,,)则对雄性毛鼻袋熊上椰,,砌砌淞肠跏船的生殖内分泌进行了研究，发现在繁殖季节(,一,,月)，其粪样中的雄激素水平明显高于非繁殖季节(,—,月)，并且认为当地的环境因素(主要为干旱程度)以及雌性的排卵时间均决定着雄性的发情行为。,(,(,粪样内分泌分析法在人为干扰评价中的应用 在野生动物的应激性研究中，探查人为干扰、尤其是生态旅游的游客对动物体造成的影响是当前动物保护、动物福利关注的热点之一。通过行为观察并辅以心跳等生理因子的变化是最为传统的判断动物应激程度的方法(,,,,,，,,,,;,,,,甜口正，,,,,;,,,,,,,,,刃口正，,,,,);相对行为观察方法而言，从内分泌水平来监测动物体对各方面“压力”的应激性更为敏感而精准(,,,面,,,甜以，,,,,;,,,,,甜口正，,,,,)。大多相关研究主要是通过血液中皮质醇等皮质激素的变化对人为干扰程度加以评价(,,,,,,刃口,(，,,,,;,,,,,;,甜以，,,,,;,,,,(,,甜以，,,,,)。与血样相比，粪样中的激素变化反映的是一段时间内的平均水平，而不是某一时刻的脉冲值(,,印,, ,,,, ,,,,,,，,,,,)，因此对于人为干扰这种持续性的应激原，粪样内的皮质激素水平可以更准确的反映动物的实际应激性。在两个游客密集程度不同的区域中，三种狐蚴;,加如以，“施觚阮唧淞?聊,,,册,尸,,,阳,,,肠删,粪样中肾上腺皮质激素代谢物的浓度无显著性差异，表明狐蝠已经习惯了游人的活动，但栖息在狐蝠群中心位置个体的粪样的皮质激素浓度低于群外围的个体(,觚,,, ,, ,,口正，,,,,)。,嘶,等(,,,,)也发现同一地区的松貂尬栅忉口鹏粪样中的总糖皮质激素在客流量高的春夏两季明显高于游客量少的秋冬两季;位于核心保护区(未干扰区)的松貂的粪样中总糖皮质激素明显低于有游客干扰的限制区及自由进入区。目前，由于野外研究的多方面的限制性，对于该方面所涉及的内容还相对较少。展望未来，个体追踪及识别技术的进步可 , 大熊猫类样内类同醇激素保存方法及应用研究能会进一步拓展粪样类固醇激素研究的运用，譬如借助分子生物学的识别和无线电跟踪技术，可使野生动物内分泌的非损伤研究方法得到更大的发展空间。,(,粪样内类固醇激素保存法的研究 近年来，通过粪样类固醇激素研究和监测野生动物的生理状态已为许多研究者采用，野生动物粪样在类固醇激素研究上的优势和不足也正在探索之中，其中，最令人关注的问题是如何合理有效地保存和处理野外粪样，进而满足研究工作的需要。 动物的排泄物中含有大量的胃肠细菌，如果新鲜粪样没有及时提取处理或低温保存，粪样内及外界的微生物将会分解粪样所含的类固醇激素的代谢产物 (、;,缸,,, ,,口正，,,,,;,,,,,,,, ,,口正，,,,,;惭, ,,口正，,,,,;,,,锄, ,,口正，,,,,)。,如,,,等(,,,,)的研究得出，黄狒狒的粪样不经任何处理，置于室温下，其雌二醇和孕酮的含量会在,小时左右发生改变，其中雌二醇出现明显的下降，而孕酮则出现明显的上升;,,,,,,,等(,,,,)则发现置于室温下的奶牛的粪样，其中的孕激素会在,日后呈指数型下降。,抽,,;,,等人(,,,,)也发现于,,?保存的梅花鹿,，,，,嚣嘲窄册粪样中孕酮的含量会在,,小时内显著性上升，而加入乙醇、抗生素等可明显消除微生物对粪样内孕酮的降解。,,,,,,,,,,,等(,,,,)等通过研究也指出不做任何保存处理，常温运输,.