分析葡萄酒酵母中适应进化及工程菌建立

分析葡萄酒酵母中适应进化及工程菌建立分析葡萄酒酵母中适应进化及工程菌建立;工业酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)可用于许多工业生产,如酒精饮料、焙烤食品、生物燃料、蛋白、维生素和风味物质等生产过程。众所周知它们是在利于某些优良性状进化的条件下,经历长时间的适应进化和筛选获得。其基因组组成复杂,染色体数和倍性多变[1];它们不但可以在各种培养介质上生长,耐受非常的环境条件;而且还获得了某些特定性能,如在高糖果汁中快速生长、高产乙醇和耐受乙醇等优良性能。葡萄酒生产是一个复杂的生理生化过程,包括酵母菌为主发酵菌的发酵,因此葡萄酒酵母(S.cerevisiae)的生长代谢状态对葡萄酒质量起着至关重要的作用。在葡萄酒发酵初始酵母受到高渗透和低pH环境胁迫,随着发酵进行又受到乙醇和某些抑制物如SO2、酵母嗜杀因子等的累积胁迫,最后经历二度生长,耗尽可发酵糖并进行氧化呼吸[2]。;这些条件可促使酵母细胞发生各种生理生化和形态变化,使生长停滞,导致发酵迟缓。所以酵母必需能够在发酵过程中耐受这些胁迫。目前广泛研究方向集中在阐明与应激反应和适应进化有关的分子机理。本文将葡萄酒酵母(S.cerevisiae)的应激反应和工程菌的构建研究进展,提出用适应进化构建工程菌的策略,以利于工业葡萄酒酵母的菌种优化。;1胁迫应激反应;近年来,科研人员致力于研究葡萄酒酵母如何适应葡萄酒发酵的苛刻条件。葡萄酒酵母的基因组达分析发现:在葡萄酒发酵过程中,有2000多个基因的表达受到影响,其中1123个基因一直处于诱导表达状态,直至发酵结束[3-4];223个基因是发酵应激基因(目前28%的基因功能还不了解),其保持高水平诱导表达。这些应激基因分别位于GAC1(包括5个基因)、INO1(8个基因)、YOL047C(11个基因)、HXT6(63个基因)、HAP1(37个基因)和SKN7(100个基因)基因簇上[4]。它们呈高水平表达,且不同生长阶段呈不同调节水平[5]。最近,又发现34个实验室菌株没有的新基因,根据慕尼黑蛋白序列信息中心数据库推断它们大部分在葡萄酒发酵过程中参与葡萄酒主发酵[6]。;已经证明在葡萄酒发酵过程中,葡萄酒酵母的不同应激反应集中在糖吸收、氮代谢、麦角甾醇合成、VB1合成及感官性能表达[3,7]。其中能量产生及与应激反应相关的基因呈现最高表达[5],并且其转录后水平调节起重要作用[8-9]。相反,大部分麦角甾醇合成相关的基因表达水平降低,以适应各种胁迫条件[3,5,10]。大部分与环境适应相关的基因位于酵母染色体着丝粒亚末端区[11],包括上面提到的34个新基因[6]。这些基因多参与酵母的次生代谢,是细胞存活所必需的基因。其中20个基因所编码的蛋白可能参与碳源或氮源的转运及代谢[7]。在葡萄酒发酵条件下,着丝粒亚末端区的适应基因受到显着调节,进行诱导表达[3]。这些结果充分证明:工业葡萄酒酵母的大部分适应进化发生在基因表达水平;而且细胞以高度协同的方式顺序激活或抑制许多基因表达,并通过获得新基因来适应长时间的葡萄酒发酵。;2适应进化机理;微生物通过进化增加其适合度来适应新环境,这一过程为适应进化[12]。酿酒酵母具有复杂的调节网络来感觉、应答及适应环境的改变。但对葡萄酒生产中酵母适应极端条件的机理及代谢途径的调节研究较少[4]。目前已经建立了一些酵母适应工业生产环境的分子机理模式,它们是种间杂交、染色体重排、基因水平转移和染色体更新(近亲交配)。;2.1种间杂交;Saccharomycessensustricto群中不同种可以形成杂交种以适应工业生产环境胁迫,这是最引人注目的适应进化机理[13]。一般认为形成多倍体尤其是异源多倍体是促进酵母遗传多样及适应进化的重要因素。已经证明巴斯德酵母(S.pastorianus)是S.cerevisiae和贝酵母(S.bayanus)杂交形成的部分异源四倍体[14];典型性贝酵母的核基因组来自S.cerevisiae和S.bayanus[15]。最近又发现来自葡萄汁和苹果汁发酵物的酵母是S.cerevisiae与葡萄汁酵母(S.uvarum)或库德里阿兹威酵母(S.kudriavzevii)的二杂交种或三者杂交的三杂交种[16-19]。遗传分析表明杂交种的基因组结构具有很大可变性[19];其在葡萄酒发酵的强选择压力下,易于发生广泛的染色体重排,包括染色体丢失和嵌合[20]。与亲本相比,杂交种对特定环境的适应性差,但其获得的有利性状使它们更易适应多变的环境条件[21];而且杂交种获得了双亲的生理特性,如S.cerevisiae的乙醇或糖耐受性、奇异酵母(S.paradoxus)的低温耐受性及S.bayanus高产芳香化合物的特性[22]。在某些情况下,不同种间的杂交种不仅适合度提高,而且还获得一些独特性能。因此,种间杂交可能在现有种的进化中起重要作用,作为非DNA重组方法在葡萄酒酵母的遗传改进方面具有很大潜力。;2.2染色体重排;葡萄酒酵母染色体的重排能力强,可以迅速适应环境的改变[6,23-24]。染色体重排包括缺失、重复、插入、倒臵、转座和易位。葡萄酒酵母的转座现象非常普遍,常常发生在同源染色体相同位臵的序列间,用以修复染色体断裂。大部分转座由同源Ty的长臂区或着丝粒亚末端的Y'元件重组介导[25-26]。葡萄酒酵母的硫抗性基因SSU1-R是VIII号染色体和XVI染色体之间相互转座形成的[27]。某些位于着丝粒亚末端的基因家族如SUC、MAL、RTM、MEL也起源于着丝粒亚末端重复元件的异位转座,使酵母菌株的生理生化性能得到改进[28]。已经确认FLO11基因的适应进化包括在FLO11基因启动子的抑制区发生缺失突变,在编码区的串联重复中心重排[29]。还证明用于工业燃料乙醇生产的酿酒酵母适应菌株的SNO2/SNZ2和SNO3/SNZ3基因(参与VB1和VB6的生物合成)拷贝数比普通酿酒酵母多,使酵母可以在缺少VB6和高糖的介质中更好的生长[30]。葡萄酒酵母的适应进化还包括整体染色体重排[14,31],大部分整体染色体重排发生在种间杂交之后的非整倍体间[32]。在酵母的进化过程中染色体重排可能是高频发生事件[11],转座和大片段重复是酵母基因组进化的主要推动力[33]。;2.3基因水平转移;自然界中,不同微生物间基因水平转移非常普遍,是物种进化的推动力。如某些不同地域的葡萄酒酵母基因组携带S.kudriavzevii的DNA片段、S.cerevisiae的DNA片段渗入S.paradoxus基因组[6,34]。这些现象表明酵母属Saccharomycessensustricto的种间杂交可能也导基因水平转移[19]。葡萄酒酵母的某些基因不仅来自Saccharomycessensustricto群的不同种,而且还来自某些细菌。葡萄酒酵母S.cerevisiae的URA1(编码乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶)和BDS1(编码芳基硫酸酯酶)基因是细菌起源[35-36],可能分别来自乳酸菌和慢生根瘤菌家族的α-变形菌[36]。最近Novo等[6]发现了葡萄酒酵母和葡萄酒发酵的主要污染菌-拜耳接合酵母Zygosaccharomycesbaili(i其在葡萄酒发酵过程中生命力非常强)间的基因转移。所以基因转移是酵母多样性的一个重要原因,可能在酵母适应葡萄酒发酵生态环境中起重要作用。;2.4染色体更新(近亲交配);染色体更新的假说由Mortimer等[37]首次用于解释葡萄酒酵母的遗传改变。他们认为野生葡萄酒酵母可能经历基因组改变,导致大量杂合二倍体变为纯合二倍体,并取代原来的杂合二倍体。已经发现某些工业酵母菌株是纯合子[17]。在葡萄酒发酵过程中,大量杂合二倍体菌株经历染色体更新并被高适合度的纯合二倍体菌株取代[17]。可以认为具有优良葡萄酒发酵性能的纯合酵母菌株是新菌株育种中具有很高价值的菌种。;3适应酵母构建;3.1适应进化工程;许多技术可用于构建具有期望性状的酵母菌株,包括克隆选择、杂交、诱变和代谢工程策略,它们各有优缺点;基于自然变异和选择来获得期望表型的适应进化方法也可用于改进酵母的多胁迫耐受性能。工业用葡萄酒酵母的两个性状是通过适应和自然选择获得,一是高浓度SO2耐受[27],另一个是高浓度铜离子耐受[14]。目前已用群体交配、适应进化、富集筛选成功构建一些酵母菌株(表1)。获得的优良性状集中表现在乙醇耐受的优化,木糖利用能力的获得,甘油过表达和麦芽糖利用的促进。而且,酵母基因工程菌进一步在选择条件下进行恒化培养或一系列分批培养经历长期进化,使菌株发酵性能进一步优化(表1)。我们也对利用淀粉的酿酒酵母基因工程菌进行紫外诱变和麦芽三糖培养介质的适应进化筛选,获得利用淀粉和麦芽三糖的适应菌株[38]。这充分证明进化工程策略可以与基因工程策略互补,获得性能更优良的菌株。当微生物连续处于营养缺乏的环境中,自然选择利于细胞获得更有效利用限制性底物的遗传变化。如在葡萄糖受限的条件下,获得的适应突变子的突变基因都参与葡萄糖信号途径—葡萄糖转导途径或蛋白激酶A信号途径[39]。而且,已经证明在氮源受限制的条件下连续培养可以获得低氮条件下发酵能力高的菌株。因此,可以认为适应进化技术是构建葡萄酒酵母新菌株的有效工具,可以使其酿酒性能及风味物质分布更适合特定的葡萄酒生产的需要。;3.2菌株构建策略;已经证明在葡萄酒发酵体系中,早期应激诱导获得的基因可被后面的应激反应所用,利于后面的胁迫应激[2];功能基因组技术揭示了酵母细胞对各种胁迫条件的适应机理;进化研究已经证明大规模群体培养可以使细胞快速适应环境条件;而且,进化突变子筛选技术的进步和小样品无菌处理的自动化提高了传统适应进化方法(如连续稀释富集和恒化培养)的处理量;进化群体可以冷冻保存,便于对比分析。这些条件促进新型葡萄酒酵母的构建研究。酵母进化工程策略依赖不同种群体交配或诱变使其产生不同遗传背景的群体,并在选择压下经发酵罐恒化培养或系列分批培养富集培养物,细胞繁殖成百上千代。最后用生长速度或与参考基因型(如实验群体原种)的竞争能力作为适应筛选指标选择目的菌株[40](图1)。我们用工业葡萄酒酵母经诱变处理,以高葡萄糖、高盐浓度作为选择压进行富集培养,成功的构建低产乙醇的葡萄酒酵母。构建新菌株的关键点是亲本菌株筛选、适应推动力选择和新菌株发酵性能确定。为了获得足够的遗传突变株并获得期望性状,需要施加一定的选择压。许多类型选择压已成功引发酿酒酵母的适应进化,并获得期望性状。选择压力可以采用特定胁迫因子,如高渗透、特定糖的培养介质、温度或限定性营养物如葡萄糖的竞争。;4结论;葡萄酒工业面临新的挑战。市场竞争更加激烈,消费者需求不断提高,生产环境可持续性越来越引起注意。一般认为葡萄酒的感官质量和风格主要取决于葡萄酒酵母菌株的发酵特性。葡萄酒酵母新菌株的构建可改善葡萄酒的发酵性能、加工效率、储存性能和感官质量,为葡萄酒生产企业提供更多机会。许多方法可以用于构建这样的酵母菌株,其中包括杂交、诱变、基因工程方法。但一般认为转基因对人类健康、安全和环境构成潜在威胁,部分消费者难以接受转基因食品。虽然官方已经批准2株酵母菌(面包酵母和酿酒酵母)用于食品饮料生产,但转基因酵母仍未用于大规模工业生产。并且转基因食品饮料生产必须通过安全评估,包装标签必须标明转基因。而基于自然适应筛选的菌株没有人为引入外源基因和抗性基因,不会引起消费者反感。所以,适应进化菌株更适合葡萄酒酿造,也是葡萄酒酵母菌株优化的方向。已经证明酵母的适应进化发生在基因表达水平,碳、氮和甾醇代谢相关的基因表达水平的差异及应激反应差异导致不同菌株的发酵性能差异[41],所以可以认为施加选择压的适应进化是通过遗传改变获得具有期望优良性状的突变株,达到基因工程改造的目的。;与基因工程方法相比,适应筛选方法获得的适应菌株生存能力更强,遗传改变可能发生在多基因、多代谢途径。因此可以解决基因工程菌在大规模生产阶段退化、生长缓慢等普遍存在的问题。但是,细胞整体代谢网络及各代谢途径间的相互连接机理,目前还不完全了解。因此,将来的研究工作应集中在葡萄酒发酵过程中调节回路和中心代谢途径的代谢流调节研究,以利于适应进化选择压的选择及菌株的进一步发酵优化。进一步在基因水平探究营养缺乏或富裕与适应进化之间的关系,尤其是对发酵应激基因的影响,以促进适应进化酿酒酵母菌株的构建。而且,基因水平转移作为非rDNA的进化工程方法值得研究,可以尝试将多菌株共同培养促使酵母菌获得其它菌包括非酵母菌的有利性状表达基因,目前还未见非酵母与酵母之间共培养的研究报道。考虑到酵母细胞在葡萄酒酿造中所受的应激作用不同,葡萄酒品种不同则风格不同,开发出满足葡萄酒酿造的各种情况的全能菌株不太可能。因此,不同菌株可以针对满足不同目的和风味要求,采用酵母组合发酵的策略获得优质葡萄酒