花椒多酚类化合物抗自由基抗氧化损伤的研究

花椒多酚类化合物抗自由基抗氧化损伤的研究 花椒多酚类化合物抗自由基抗氧化损伤的研究 作者: 凌智群，万杰，胡苗苗，岑娇，魏萍 【摘要】 目的观察花椒多酚类化合物总提取物(ZPPC)对活性氧自由基?OH、O2,?和肝脂质过氧化损伤的作用。方法分别利用化学发光法、体外肝匀浆温育Fe2+和H2O2诱导及CCl4肝损伤实验探讨 ZPPC对?OH和O2,?的清除作用及检测肝和血浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性以及脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量。结果 ZPPC能有效地清除活性氧自由 基;口服低剂量ZPPC能显着降低CCl4 中毒小鼠血浆MDA，提高SOD活性。结论适量ZPPC具有抗活性氧自由基和脂质过氧化的作用。 【关键词】 花椒 多酚类化合物 自由基 抗氧化损伤 Abstract: ObjectiveTo study the effects of procyanidins extract from Zanthoxylum bungeanum Maxim. (ZPPC) on active oxygen radicals and lipid peroxidation.Methods (1) The scavenging effects of ZPPC on ?OH, and O2, were investigated by chemiluminescence method; (2) The contents of malondialdehyde (MDA) in liver homogenates incubated with Fe2+ and H2O2 in vitro was determined; (3) The mice were treated with a single intragastric feeding of 5% CCl4 soya bean oil solution (10 ml/kgbw) after seven days supplementation of ZPPC ,200,400,800 mg/(kg . The activity of superoxide dismutase (SOD) and the content of MDA in liver bw?d), and plasma of CCl4 toxic mice were determined.ResultsIn vitro, ZPPC 388.9 mg/L and 43 1.22 mg/L has marked activity on ?OH in Fenton systems and O2,. produced in xanthine/xanthine oxidase respectively, and could significantly decrease the contents of liver MDA. In vivo, ZPPC ,200，400 mg/(kg bw?d), evidently reduced the content of MDA and increased the activity of SOD. ConclusionIt suggests that ZPPC may be used as an antioxidant and might effectively protect liver from the injury due to lipid peroxidation. Key words: Zanthoxylum bungeanum Maxim.; Polyphenols; Free radicals 花椒为芸香科植物青椒Zanthoxylum schinifolium Sieb. Et Zucc.或花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.的干燥成熟果皮，味辛,性温,小毒，具有“温中止痛，驱虫，外用燥湿，杀虫止痒”的功效,1,，其主要化学成分有生物碱、酰胺、木脂素、香豆素、挥发油和脂肪酸等，而花椒多酚类化合物的相关研究报道较少。多酚类化合物是广泛存在于植物界的一类具有多种生理功能的活性物质, 它不仅具有很强的清除自由基能力, 还可以通过抑制氧化酶和络合过渡金属离子等方式起到抗氧化作用。本文以四川汉源花椒为研究对象，研究花椒总多酚类化合物的抗氧化活性，旨在充分挖掘利用该资源。 1 1.1 动物SD大鼠，雄性180,200 g;昆明种小鼠，雄性18,20 g，成都中医药大学实验动物中心提供。 1.2 样品制备花椒购自四川九襄。粉碎，丙酮-水溶液(7?3)浸提，减压除去浸提液中丙酮，然后过滤残留水液，将滤液经醋酸乙酯萃取分离，脱水干燥，得到花椒多 酚类化合物总粗提取物(ZPPC),得率为0.033%。ZPPC为黄棕色粉末，实验前用生理盐水配成所需浓度。 1.3 药品黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、3-氨基邻苯二甲酰肼购于Sigma公司,其余化学试剂均为AR级。超氧化物歧化酶(SOD)、脂质过氧化产物(MDA)测试盒: 南京建成生物工程研究所提供。 2 方法 2.1 总酚含量的测定 采用Folin-Ciocalteu法测定。准确吸取100 μl的提取物, 加入200 μl稀释1倍的酚试剂, 混匀, 再加入10, 2 ml Na2CO3溶液, 用蒸馏水定容至5 ml, 摇匀, 室温避光反应40 min，4 000 r/min离心10 min., 上清液在760 nm 处测吸光度。结果以100 g 提取物中含有相当没食子酸的克数表示。 2.2 羟基自由基(?OH)的产生和清除吸取一定量的ZPPC溶液, 50 μl 60 mmol/L 2-脱氧核糖, 100 μl 1mmol/L EDTA-FeCl3, 100 μl 1 mmol/L Vc 和100 μl 1 mmol/L H2O2, 用200 mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲溶液定容至 1 ml, 置于37?水浴锅中反应 1 h, 取出后分别加10,三氯乙酸溶液和1, 硫代巴比妥酸, 在80?水浴中反应15 min, 冷却后在532 nm 下测定其吸光度。 羟基自由基清除率(%)=(1,A样品/A对照)×100, A样品:样品管的吸光值; A对照:对照管的吸光值 2.3 超氧阴离子(O2,?)的产生和清除用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系产生O2,?,然后加入Luminol试剂,2,和样品,在WDD-1型发光测试仪上测试反应1min时的发光值，以蒸馏水为空白对照。 外给药对大鼠肝匀浆MDA含量的测定参照 文献 方法,3,，每支试管加 2.4 体 10% 大鼠肝匀浆0.2 ml，给药组每管分别加不同浓度的ZPPC，使其终浓度分别为: 4，8，16 g/L，对照组加等体积生理盐水，分别加诱导试液FeSO4(5 mmol/L) 0.1 ml，H2O2(10 mmol/L) 0.1 ml，空白对照组加0.1 ml生理盐水，37% 温育24 h，置冰水中冷却后TBA比色法,4,测MDA含量。 2.5 急性肝损伤实验昆明种小鼠50只，随机分为5组: 正常对照组、CCl4中毒组、ZPPC3个不同剂量组,每组小鼠分别灌胃200，400，800 mg/(kg ?d),。对照组给等体积生理盐水，连续7 d。末次灌胃后24 h，除正常对照组给等体积豆油外，其余各组一次灌胃5% CCl4油溶液10 ml/kg 体重，灌胃后不久，小鼠逐渐表现出中毒症状: 行动迟缓，全身蜷缩懒动，毛发竖立。24 h后摘眼球取血，肝素抗凝，然后颈椎脱臼法处死小鼠，摘取肝脏，制成10%匀浆，分别测定MDA含量、SOD酶活性。 2.6 数据处理以抑制O2,?的发光强度一半的浓度(IC50)为标准，判断ZPPC的有效性和效价;实验数据表示为?s，SPSS11.0，采用t检验和方差分析进行统计学处理。 3 结果 3.1 ZPPC和维生素C对?OH的清除作用结果见表1。羟基自由基已广泛用于测定植物提取物的抗氧化活性领域，羟基自由基是已知的最强的氧化剂，它比高锰酸钾和重铬酸钾的氧化性还强，具有极强的反应性，寿命极短，在很多缓冲溶液中，只要一产生，就会同缓冲溶液反应。它几乎可以攻击所有的邻近细胞，同细胞中的所有成分发生反应，对人体的危害最大。 从表1中可以看出，ZPPC的有效半数清除浓度为388.9 mg/L，与4.1 mg/L的VC的清除能力相当，且在一定浓度(20,800 μg/ml)范围内，ZPPC随着浓度的增加，其清除Fenton体系羟基中自由基的能力亦增强，呈现出一定的量效关系。表1 ZPPC对Fenton体系羟基自由基(?OH)清除作用的影响(略)。3.2 ZPPC对O2,?的清除作用结果见表2。表2 ZPPC对超氧阴离子自由基(O2-?)的清除作用(略) 生物体内主要的活性氧有超氧阴离子自由基(O2,?)、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(?OH)、烷氧基自由基等。超氧阴离子自由基是体内链式反应最早生产的自由基，其可被进一步还原，是线粒体生成有害活性氧的源头，一旦清除了超氧阴离子，便可以从根本上预防体内过多的羟基自由基和其它活性氧自由基，从而达到抗氧化损伤的目的。表2显示，ZPPC的有效半数清除浓度为43 1.22 mg/L，与0.87 mg/L的维生素C(VC)的清除能力相当，而且ZPPC对体系中产生的O2,?的抑制率与ZPPC的浓度呈直线正相关，即在一定范围内，随着ZPPC浓度的提高，其抑制率增强。 3.3 体外ZPPC对大鼠肝匀浆MDA含量的影响结果见表3。肝脏具有丰富的酶性抗氧化剂，而且也是一个具有微粒体和线粒体系统的在正常代谢过程中能产生活性氧自由基的器官。当Fe2+与过氧化氢等活性氧反应生成毒性更大的羟基自由基, 引发生物膜发生脂质过氧化反应，即自由基产生和抗氧化能力的平衡被打破时，就有可能发生损伤。而抗氧化剂与Fe2+发生络合反应后, 降低了介质中Fe2+的有效浓 从而减轻自由基对生物膜的氧化损伤作用。 度, 由表3可见，ZPPC对Fe2+和H2O2诱发的MDA值均有显着的抑制作用，且呈剂量依赖性。由于已知MDA含量的高低在一定程度上反映出膜脂质过氧化程度的强弱，提示ZPPC可抑制肝细胞膜脂质过氧化，推测其作用机理与ZPPC对活性氧自由基的清除作用及其强还原性及螯合金属离子的特性有关。表3 体外给药对Fe2+、H2O2引起大鼠肝匀浆MDA生成的影响(略)与空白对照组比较，aP0.01;n=10 3.4 ZPPC对CCl4中毒小鼠肝和血浆SOD酶活性和MDA含量的影响结果见表4。表4 ZPPC对CCl4诱导肝损伤小鼠肝脏、血浆SOD 活性的影响(略)与正常对照组比‎‎较，aP0.01;与CCl4 模型组比较b P0.05，cP0.01 ;n=10表5 ZPPC对CCl4诱导肝损伤小鼠肝脏、血浆MDA 生成的影响(略)与正常对照组比较，aP0.01 ;与CCl4 模型组比较，bP0.05， cP0.01 作为一种选择性肝脏毒物，CCl4具用很强的诱导肝脏脂质过氧化作用,5，6,，由于在体内时对肝亲和力大，通过肝微粒体中的细胞色素P-450代谢激活后生成三氯甲基,?CCl3,等自由基，诱发肝细胞膜发生脂质过氧化，是导致肝细胞损伤的一个重要因素。表4表明，CCl4组小鼠肝和血浆SOD酶活性比正常对照组显着降低(P0.01)，而口服ZPPC中、低剂量,200，400mg/(kg bw?d),可显着抑制CCl4引起的小鼠肝和血浆SOD酶活性的下降(P0.01)。但高剂量组,800 mg/(kg bw?d),无效;表5结果显示，CCl4中毒组小鼠肝脏和血浆MDA含量显着升高(P0.01)。口服ZPPC能在一定程度上防止CCl4的损伤，中、低剂量组小鼠肝和血浆MDA含量较CCl4组显着降低(P0.01),同样高剂量(800 mg/kg)也无效。提示ZPPC作为多酚类化合物，在动物体内的抗氧化活性 规律 与体外抗自由基作用的规律是一致的: 在一定浓度范围内，ZPPC的抗氧化活性随着浓度的升高而降低。 4 结论 本实验采用体外体外抗氧化实验模型,研究了从花椒中提取出的总多酚类化合物的清除?OH 和O2,?、抗Fe2+和H2O2诱发抑制脂质体氧化能力和体内抗CCl4诱导肝脏脂质过氧化能力以评价其抗氧化性。结果表明,从花椒中提取出的总多酚类化合物有较强的还原能力,能够抑制脂质体过氧化,有清除?OH，O2,?自由基的活性,而且在不同体系中,花椒总多酚类化合物的抗氧化活性与其浓度之间均有一定的量效关系，为进一步研究奠定了基础。 【 参考 文献 】 ,1,凌智群，魏居国，程宝宏，等.花椒功效的初步考证,J,.陕西中院学报，2017，31 (4): 73. ,2,Zhi-Qun Ling, Bi-Jun Xie ， Er-Ling Yang. 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